difficile Clostridium הוא חיידק פתוגניים שהוא anaerobe מחמיר וגורם לשלשול לאנטיביוטיקה קשור (AAD). כאן, שיטות לבידוד, culturing ושמירה על ג תאים של צמח difficile ונבגים מתוארים. טכניקות אלו מחייבות תא אנאירובי, אשר דורשת תחזוקה שוטפת על מנת להבטיח תנאים נאותים לג האופטימלי טיפוח difficile.
difficile Clostridium הוא אנאירובי, חיידק גראם חיובי, sporogenic שאחראי בעיקר לשלשולי אנטיביוטיקה משויכים (AAD), והוא הפתוגן nosocomial משמעותי. ג difficile קשה לשמצה לבודד ולטפח והוא מאוד רגיש אפילו רמות נמוכות של חמצן בסביבה. כאן, שיטות לבידוד ג difficile מדגימות צואה ולאחר מכן culturing ג difficile להכנה של מניות גליצרול עבור אחסון לטווח ארוך מוצגים. טכניקות להכנה וספירת מניות נבג במעבדה עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם כוללים מחקרי מיקרוסקופיה ובעלי החיים גם מתוארות. טכניקות אלו מחייבות תא אנאירובי, אשר שומר על סביבת אנאירובי עקבית על מנת להבטיח תנאים נאותים לג האופטימלי צמיחת difficile. אנו מספקים פרוטוקולים להעברת חומרים בתוך ומחוץ לחדר בלי caבאמצעות זיהום חמצן משמעותי יחד עם הצעות לתחזוקה שוטפת הנדרשת כדי לקיים את סביבת אנאירובי המתאימה לג יעיל ועקבי טיפוח difficile.
difficile Clostridium הוא, חיידק יוצר נבג גראם חיובי שהוא anaerobe לחייב והפתוגן במערכת העיכול שעלול להיות קטלני לבני אדם ובעלי חיים. תאר בשנת 1935 תחילה כאורגניזם commensal נמצא בדגימות צואה מיילודים 1, ג difficile מאוחר יותר הוכיח להיות הסוכן סיבתי של קוליטיס pseudomembranous הקשורים לטיפול אנטיביוטי 2. ג זיהומי difficile (CDI) הם קדמו בדרך כלל על ידי טיפול אנטיביוטי שתוצאת שיבוש הפלורה הנורמלית במעי הגס, יצירת נישה לג difficile לשגשג 2. ג difficile מועבר כנבג רדום דרך מסלול הצואה, אוראלי ולאחר מכן נובט בתוך מערכת העיכול, בייצור תאים של צמח....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
שים לב: ג difficile הוא פתוגן אדם ובעלי החיים שיכולים לגרום למחלות במערכת העיכול. ניסויים מעורבים ג difficile חייבת להתבצע עם אמצעי זהירות מתאים בטיחות ביולוגית (BSL-2).
1. אנאירובי קאמרי שימוש ותחזוקה
ג difficile הוא anaerobe קפדן והוא מאוד רגיש אפילו ריכוזים נמוכים של חמצן באטמוספרה. לכן, יש צורך בסביבה מבוקרת, אנאירובי למניפולציה המוצלחת שלה. השימוש בתא אנאירובי (איור 1 א) מספק סביבה היציבה ביותר ואת התנאים אידיאליים לגידול יעיל של ג difficile<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דוגמא של ג difficile גדל על BHIS ותקשורת כבשים אנאירובי קולומביה אגר דם שניתן לראות באיור 2. ג difficile יוצר מושבות סדירות שהם שטוחים ובעלי מראה קרקע זכוכית אשר באו לידי ביטוי בשני אמצעי התקשורת. הנה, לבודד קליני אריתרומיצין רגיש של ג difficile, 630E 30, הוא גדל על BHIS אגר, מדיום מועשר, הלא סלקטיבי, ל24 שעות על 37 ° C (איור 2 א). מושבות על אגר דם קולומביה אנאירובי כבשים נראות דומות לאלה שגדלו על BHIS תחת אור.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
השיטות שתוארו כאן לאפשר התאוששות פשוטה ומהירה של ג difficile ממגוון רחב של דגימות צואה, כולל בני אדם, עכברים ואוגרים, כמו גם האחסון לטווח הארוך של ג difficile כמו מניות גליצרול או נבג. ג difficile יכול להיות אורגניזם קשה לעיבוד, אך הקפדה על סביבת אנאירובי והיישום של טכניקות אספטיים יכולים לספק לצמיחה איתנה והפחתה בזיהום.
תאים אנאירוביים: שיקולים ותחזוקה
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
ברצוננו להודות למתחנחן מעבדות באדיבות מתן תמונות של חדר אנאירובי. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק DK087763 (SMM) ותכנית לימודים STEP / HHMI פיתוח מלגה (Ane).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פרוטאוז פפטון מס' 2 | BD | 212120 | |
| Na2HPO4 | Fisher | S373 | |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| MgSO4 (נטול מים) | Fisher | M65 | |
| á'...-פרוקטוז | פישר | L96 | |
| נתרן טאורוכולט | סיגמא | T4009 | |
| á'...-ציקלוסרין | סיגמא | C6880 | |
| Cefoxitin | Fluka | C4786 | |
| עירוי לב מוח בינוני | BD | 237300 | |
| פרוטאוז פפטון | BD | 211684 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A5132 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| L-cysteine | Sigma | C7755 | |
| BactoPeptone | BD | 211684 | |
| אגר דם כבשים קולומביאני | Fisher | L21928 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| KCl | Fisher | P217 | |
| גליצרול | Fisher | BP2291 | |
| לולאות חיסון סטריליות | Fisher | 22363596 | |
| ספוגיות סטריליות | Fisher | 1495990 | |
| Coy ויניל תא אנאירובי ואביזרים | Coy Laboratory Products, Inc | שצוין על ידי הלקוח | פריטים אלה מוזמנים בהתאמה אישית לפי צרכי |
| Materials | |||
| TCCFA agar proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 גרם NaCl 2 גרם MgSO4 (נטול מים) 0.1 גרם פרוקטוז 6 גרם אגר 20 גרם להביא ל-1 ליטר עם מים נטולי יונים וחיטוי ב-121 & deg; C למשך 20 דקות לעיקור. לאחר החיטוי, הוסף: 10 מ"ל של 10% (w/v) נתרן טאורוכולאט, מעוקר במסנן (מומס במים; ריכוז סופי, 0.1%) 25 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל á'...-ציקלוסרין, מעוקר במסנן (מומס במים; ריכוז סופי, 250 μ גרם/מ"ל) 1.6 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל צפוקסיטין, מעוקר במסנן (מומס במים; ריכוז סופי, 16 μ גרם/מ"ל) BHIS בינוני חליטת לב למוח 37 גרם תמצית שמרים 5 גרם לצלחות, יש להוסיף 15 גרם אגר. הביאו ל-1 ליטר עם מים נטולי יונים וחיטוי ב-121 מעלות; C למשך 20 דקות לעיקור. אופציונלי (להוסיף לאחר חיטוי): 3 מ"ל של 10% (w/v) L-cysteine (מומס במים; ריכוז סופי, 0.03%) 10 מ"ל של 10% (w/v) נתרן טאורוכולט (מומס במים; ריכוז סופי, 0.1%) SMC Sporulation בינוני BactoPeptone 90 g פרוטאז פפטון 5 גרם (NH4)2SO4 1 g בסיס Tris 1.5 g Agar 15 g להביא ל-1 ליטר עם מים נטולי יונים וחיטוי ב-121 & deg; C למשך 20 דקות לעיקור. אופציונלי (להוסיף לאחר חיטוי): 3 מ"ל של 10% (w/v) L-ציסטאין (נמס במים; ריכוז סופי, 0.03%) 70:30 בינוני בקטופפטון 63 גרם פרוטאז פפטון 3.5 גרם חליטת לב למוח 11.1 גרם תמצית שמרים 1.5 גרם<>> (NH)2SO4 0.7 g בסיס Tris 1.06 g לצלחות יש להוסיף 15 גרם אגר. הביאו ל-1 ליטר עם מים נטולי יונים וחיטוי ב-121 מעלות; C למשך 20 דקות לעיקור. לאחר החיטוי, יש להוסיף 3 מ"ל של 10% L-ציסטאין (ריכוז סופי, 0.03%). אגר דם מומלץ להשתמש בצלחות אגר דם כבשים אנאירוביות מוכנות מראש של קולומביה (Fisher Scientific, L21928)35. 1X תמיסת מלח בופר פוספט (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g הביאו ל-1 ליטר עם מים נטולי יונים והתאימו את ה-pH ל-7.4 עם HCl. מסנן יש לעקר לפני השימוש. | |||
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה