הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Culturing ושמירה

40.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50787

⸱

14 בספטמבר 2013

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Emory University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

difficile Clostridium הוא חיידק פתוגניים שהוא anaerobe מחמיר וגורם לשלשול לאנטיביוטיקה קשור (AAD). כאן, שיטות לבידוד, culturing ושמירה על ג תאים של צמח difficile ונבגים מתוארים. טכניקות אלו מחייבות תא אנאירובי, אשר דורשת תחזוקה שוטפת על מנת להבטיח תנאים נאותים לג האופטימלי טיפוח difficile.

תקציר

difficile Clostridium הוא אנאירובי, חיידק גראם חיובי, sporogenic שאחראי בעיקר לשלשולי אנטיביוטיקה משויכים (AAD), והוא הפתוגן nosocomial משמעותי. ג difficile קשה לשמצה לבודד ולטפח והוא מאוד רגיש אפילו רמות נמוכות של חמצן בסביבה. כאן, שיטות לבידוד ג difficile מדגימות צואה ולאחר מכן culturing ג difficile להכנה של מניות גליצרול עבור אחסון לטווח ארוך מוצגים. טכניקות להכנה וספירת מניות נבג במעבדה עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם כוללים מחקרי מיקרוסקופיה ובעלי החיים גם מתוארות. טכניקות אלו מחייבות תא אנאירובי, אשר שומר על סביבת אנאירובי עקבית על מנת להבטיח תנאים נאותים לג האופטימלי צמיחת difficile. אנו מספקים פרוטוקולים להעברת חומרים בתוך ומחוץ לחדר בלי caבאמצעות זיהום חמצן משמעותי יחד עם הצעות לתחזוקה שוטפת הנדרשת כדי לקיים את סביבת אנאירובי המתאימה לג יעיל ועקבי טיפוח difficile.

מבוא

difficile Clostridium הוא, חיידק יוצר נבג גראם חיובי שהוא anaerobe לחייב והפתוגן במערכת העיכול שעלול להיות קטלני לבני אדם ובעלי חיים. תאר בשנת 1935 תחילה כאורגניזם commensal נמצא בדגימות צואה מיילודים 1, ג difficile מאוחר יותר הוכיח להיות הסוכן סיבתי של קוליטיס pseudomembranous הקשורים לטיפול אנטיביוטי 2. ג זיהומי difficile (CDI) הם קדמו בדרך כלל על ידי טיפול אנטיביוטי שתוצאת שיבוש הפלורה הנורמלית במעי הגס, יצירת נישה לג difficile לשגשג 2. ג difficile מועבר כנבג רדום דרך מסלול הצואה, אוראלי ולאחר מכן נובט בתוך מערכת העיכול, בייצור תאים של צמח מסוגל לייצר כמה רעלים וגורמים למחלת קוליטיס 3 חמורות. CDI הוא לעתים קרובות עקשן לטיפולים קונבנציונליים והן באלהfections לעתים קרובות חוזרים על עצמם 4. כתוצאה מכך, CDI אחראי לעד 4.8 מליארד דולרים בעלויות טיפול רפואי בארצות הברית 5-7.

ג difficile רגיש מאוד אפילו לרמות נמוכות של חמצן בסביבה. לג difficile להתמיד בסביבה ולהיות מועבר ביעילות ממארח ​​למארח, היווצרות נבג מטבולית פעיל היא 8 קריטיים. בגלל תחזוקת המעבדה ומניפולציה של ג difficile דורש סביבה מבוקרת, אנאירובי, טכניקות אלה מחייבות שימוש בתא אנאירובי. שימוש בתאים אנאירוביים הביאה התאוששות ובידוד של אנאירוביים לחייב 9-11 מוגבר, ואפשר מספר הטכניקות מולקולריות שיש לבצע באווירה אנאירובית.

בנוסף לג difficile, שימוש אנאירובי קאמרי והתחזוקה המתוארת כאן חליםלאנאירוביים לחייב אחרים, כגון מינים אחרים קלוסטרידיאל (למשל perfringens ג), מינים אחרים במערכת העיכול (מינים למשל Bacteroides 12) ופתוגנים חניכיים (למשל מיני Peptostreptococcus 13).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

שים לב: ג difficile הוא פתוגן אדם ובעלי החיים שיכולים לגרום למחלות במערכת העיכול. ניסויים מעורבים ג difficile חייבת להתבצע עם אמצעי זהירות מתאים בטיחות ביולוגית (BSL-2).

1. אנאירובי קאמרי שימוש ותחזוקה

ג difficile הוא anaerobe קפדן והוא מאוד רגיש אפילו ריכוזים נמוכים של חמצן באטמוספרה. לכן, יש צורך בסביבה מבוקרת, אנאירובי למניפולציה המוצלחת שלה. השימוש בתא אנאירובי (איור 1 א) מספק סביבה היציבה ביותר ואת התנאים אידיאליים לגידול יעיל של ג difficile וחיידקים אנאירוביים אחרים 14. כאן, אווירה המכילה תערובת גז (5% CO 2, 10% H 2, 85% N 2) יכולה להישמר ביציבות.

כדי להציג את כל פריטים לתוך התא בלי זיהום חמצן משמעותי,מנעל אוויר חייב להיות בשימוש (איור 1). פונקציות מכשיר זה כמחלף גז ופועל באופן אוטומטי, באופן ידני למחצה או ידני. יש מנעל האוויר שתי דלתות: אחת המספק גישה לצד החיצוני של מנעל האוויר והגישה לספק אחרת כדי הפנים של חדר אנאירובי. בהתאם לדגם, מנעל האוויר עשוי להיות דלת נוספת, אשר יכולה להציע גישה לתא אנאירובי סמוך, ובכך לחסוך את העלות של מנעל אוויר נפרד. אלא אם כן ההעברה באופן פעיל פריטים באו מתוך החדר, שתי הדלתות צריכה להישאר סגורות בכל העת, כדי למנוע זיהום חמצן. מנעל האוויר בעל מתג הפעלה / כיבוי בחזית ולוח המכיל ארבעה כפתורים. קווי הגז וצינור משאבת ואקום מחוברים בחלקו האחורי של מנעל האוויר, בסמוך לפנל שבו המתגים להפעלה ידנית מלאה של היחידה נמצאים. מומלץ ששני מחזורי טיהור, שימוש בגז חנקן (N 2), נמצאים בשימוש לפני המילוי למחלף בתערובת גז (5% CO 2, 10% H 2, 85% N 2) כדי להפחית את כמות החמצן שהוכנסה לתא. כמו כן, חשוב לא לעזוב גם דלת פתוחה לזמן רב יותר מהזמן הסכום הנדרש כדי להיכנס ולצאת מהמחלף ופריטים לתכנן ניסויים כדי להפחית את התדירות של נע פנימה והחוצה מתא פריטים. נהלי ההפעלה השונות לתאים אנאירוביים ויניל המפורטות להלן. לפני ביצוע פרוטוקולים אלה, להבטיח כי אלה תואמים את הוראות היצרן המצורפות לקאמרי.

  1. מצב אוטומטי
    זהו מצב הניתן לתכנות והתאמה האישי ומבוצע כולו על ידי מנעל האוויר. כדי לתכנת את מנעל האוויר, עיין בהוראות היצרן. תכנית מומלצת לכניסה טיפוסית לחדר כוללת שני מחזורי טיהור באמצעות גז חנקן אחרי מילוי מנעל האוויר בתערובת גזים שמתאימה לאווירה נשמרה בתוך צ'אם מקרובבער. במהלך כל מחזור ואקום, נהלי המפעל הרגילים מציעים משיכת ואקום ל20 inHg וטיהור ל1 inHg.
    1. ודא שדלת מנעל האוויר הפנימית סגורה במלואו.
    2. פתח את דלת מנעל האוויר החיצונית.
    3. הנח פריטים למנעל אוויר וסגור את דלת מנעל האוויר החיצונית. אם החדרת נוזלים, להתיר את כובעים באמצע הדרך כדי להבטיח חילוף גזים יעיל. חבילות ואריזות סגורות יש לפתוח לפני תחילת המחזור; הימנעות מלעשות זאת עלולה לעוות וplasticware נזק ומכולות. כדי לשמור על סטריליות, פתח את החבילות מספיק כדי לאפשר חילוף גזים יעיל בלבד.
    4. לחץ על הכפתור 'התחל'.
    5. חכה עד מנעל האוויר שרכב על אופניו במסגרת התכנית והתצוגה קוראת "אנאירובית".
    6. פתח את דלת מנעל אוויר פנימית.
    7. להעביר פריטים אל תוך החדר.
    8. סגור את הדלת פנימית.
  2. מצב חצי ידני
    מצב זה עשוי להיות בשימוש בעת העברת פריטים באו מחוץ לחדר והוא הכרחי כאשר גycling הגז בתוך התא הנדרש.
    1. ודא שדלת מנעל האוויר הפנימית סגורה במלואו.
    2. פתח את דלת מנעל האוויר החיצונית.
    3. הנח פריטים למנעל אוויר וסגור את דלת מנעל האוויר החיצונית. אם החדרת נוזלים, להתיר את כובעים באמצע הדרך כדי להבטיח חילוף גזים יעיל. חבילות אטום, כגון לולאות יחסינו וצלחות 96 היטב, יש לפתוח לפני תחילת המחזור.
    4. לחץ על תפריט.
    5. לחץ על Start. מנעל האוויר יציג את תפקידו של כל לחצן ולא יגיב עד שזה יסתיים:
      • חץ למעלה: מפעיל את משאבת הוואקום.
      • חץ למטה: יוזם את זרימת החנקן (טיהור) גז.
      • התחל: יוזם את זרימת תערובת גז.
      • תפריט: לחזור לתצוגת ברירת המחדל.
    6. לחץ על "Up", הסרת גז ממנעל האוויר, עד שהתצוגה קוראת 20 inHg.
    7. הקש "Down", ממלא את מנעל האוויר עם חנקן, עד שהתצוגה קוראת פחות מ 1 inHg. אל overshoot, כמו זו ייצור לחץ חיובי בתוך מנעל האוויר, אשר עשוי להשפיע על שלמותה.
    8. חזור על שלבים 6 ו -7 לביצוע מחזור טיהור נוסף.
    9. לחץ על "Up" עד שהתצוגה קורא 20 inHg.
    10. לחץ על "התחל", ממלא את המחלף עם תערובת גז, עד שהתצוגה קוראת פחות מ 1 inHg.
    11. פתח את דלת מנעל אוויר פנימית.
    12. להעביר פריטים אל תוך החדר.
    13. סגור את הדלת פנימית.
  3. מצב ידני
    במצב זה ניתן להשתמש בכל פעם שהמצבים האוטומטיים או חצי ידני לא עובדים או שאין כוח למנעל האוויר. מצב זה אינו פועל כאשר מנעל האוויר הוא על, ולכן קשה לקבוע את הלחץ בתוך מנעל האוויר. בגלל הוואקום למשוך ופעמים טיהור גז תלויה בשיעורי ואקום וזרימת גז, בהתאמה, את השימוש במד לחץ במחלף נדרש לפקח על הלחץ ולהפחית את הסיכון לפציעה ונזק למנעל האוויר אישיים.
    1. ודא שדלת מנעל האוויר הפנימית סגורה במלואו.
    2. פתח את דלת מנעל האוויר החיצונית.
    3. הנח פריטים, כולל מד הלחץ, למנעל אוויר וסגור את דלת מנעל האוויר החיצונית. אם החדרת נוזלים, להתיר את כובעים באמצע הדרך כדי להבטיח חילוף גזים יעיל. חבילות אטום, כגון לולאות יחסינו וצלחות 96 היטב, יש לפתוח לפני תחילת המחזור.
    4. אתר שלושה המתגים בצד האחורי של מנעל האוויר שכותרתו "מתגי שליטה ידניים". אלה שכותרתו בנפרד כ:
      • ואקום
      • חנקן
      • מיקס גז
    5. להעיף את מתג ואקום לעבור עד שמד הלחץ קורא כ 20 inHg.
    6. להעיף את המתג למתג חנקן עד מד הלחץ קורא כ 1 inHg.
    7. להעיף את מתג ואקום לעבור עד שמד הלחץ קורא כ 20 inHg.
    8. להעיף את המתג למתג חנקן עד מד הלחץ קורא כ 1 inHg.
    9. להעיף את מתג ואקום לעבור עד שמד הלחץ קורא כ 20 inHg.
    10. להעיף את המתג למתג גז מערבבים עד שמד הלחץ קורא כ 1 inHg.
    11. פתח את דלת מנעל אוויר פנימית.
    12. להעביר פריטים אל תוך החדר.
    13. סגור את הדלת פנימית.

2. Culturing, ספירת והאחסון ג difficile מדגימות הצואה

הליך זה נועד לשחזר ג difficile מדגימות צואה המכיל נבגים ולאחר מכן לשמור על מושבות מבודדות תאים או נבגים של צמח באחסון לטווח ארוך כמו מניות גליצרול. לחלופין, הליך זה יכול לשמש כדי למנות את מספר ג הווה difficile בדגימות צואה (למשל ממחקרים בבעלי חיים). באופן סלקטיבי ואופן דיפרנציאלי כדי להעשיר לג difficile, אגר taurocholate-cefoxitin-cycloserine פרוקטוז (TCCFA) משמש כדי לעכב את הצמיחה של חי צואה נורמלי 15-16. Cycloserine הוא bacteriostatic לחיידקים גראם שליליים, ואילו cefoxitin באופן רחב יותר מעכב את הצמיחה של חיידקים הן גראם שליליים וחיוביים, למעט ג difficile ורוב להיכנס זני cocci. אינדיקטור pH, אדום ניטראלי, יכול להיכלל בטווח הבינוני, כמו התסיסה של פרוקטוז תגרום לירידה ברמת חומציות ושינוי בצבע הבא מאדומים / כתום לצהוב. כדי לשחזר ביעילות נבגים של C. difficile כמו חיידקים וגטטיבי, taurocholate נתרן מלח המרה משמש כדי לגרום לנביטה 17-18. בגלל ג difficile יוצר נבגים, אלכוהול או טיפול בחום של דגימות ניתן להשתמש כדי להפחית או לחסל תאי צמח, מגביל את הצמיחה של חי מזהם, שעשוי להגביר את היעילות של ג התאוששות difficile 19. כפי שהוזכר לעיל, הוא קריטי מראש לצמצם את כל הצלחות לפחות 1-2 שעות בתא אנאירובי לפני שימוש כדי להבטיח את הסרתן של חמצן שיורית. ייבוש אווירng הצלחות לפני השימוש בתא יכולות להפחית את העיבוי. מדיום נוזלי עשוי לחלוף 24 שעות כדי להפחית בהתאם לכמות ויחס שטח אל האוויר של המכל בשימוש.

לפני שיתחילו, יש להציב את הפריטים הבאים לתוך תא אנאירובי:

  • דגימת צואה
  • מטליות סטרילי
  • לולאות inoculating סטרילי
  • 1x PBS (ראה חומרים)
  • צלחות TCCFA (ראה חומרים)
  • צלחות BHIS (מוח לב עירוי בינוני עם תמצית שמרים) ומרק (ראה חומרים)
  • גליצרול 50% (מעוקר)
  • 10% L-ציסטאין (מעוקר)
  • בקבוקוני אחסון קריוגני

* לחלופין, ניתן להפיץ מושבות מבודדות על גבי צלחות אגר BHIS, ולאחר מכן לגרד וresuspended במדיום נוזלי BHIS עם גליצרול 15% עבור אחסון לטווח ארוך ב -80 ° C. ** חשוב לציין כי גראם מכתים אינה אסטרטגיה יעילה לזהות ג difficile ישירות מדגימות צואת 23 ; ג difficile חייב להיות ראשון מבודד מהצמחייה אחרת הנמצאת בצואה.

  1. Resuspend דגימת הצואה ב1x PBS (עשוי להתבצע בתנאים אירוביים), ולהבטיח שדגימת הצואה היא resuspended באופן מלא ב 1x PBS על ידי vortexing. אם ספירת ג difficile מהצואה, לשקול את דגימת הצואה לפני התוספת של 1x PBS.
  2. לעשות דילולים סידוריים של דגימת צואה המושעית זה ב1x PBS לבידוד או ספירה מתאים של יחידות מושבה להרכיב (CFU) לגרם של צואה.
  3. באמצעות טכניקת aseptic, להחיל על כל דילול סדרתי לצלחות TCCFA 100 μl.
  4. באמצעות סדרה של לולאות inoculating סטרילי, פס התרבות הגישה בקשה למושבות מבודדות או באופן שווה להפיץ את התרבות מוחלת על פני השטח של צלחת TCCFA לספירה של מושבות.
  5. דגירה את הצלחת אנאירובי ל48 שעות על 37 ° C. ניתן לאתר ולזהות ג מושבות difficile בתוך 24 שעות המבוססות עלהמראה השטוח, לא סדיר, קרקע כוס המושבות 15, אם כי זיהוי וספירה מדויקים יותר מושגת אחרי 48 שעות.
  6. באמצעות לולאות inoculating סטרילי, תת כל מושבות הנחזות להיות ג difficile על צלחות מופחתות מראש BHIS אגר, בתוספת L-ציסטאין 0.03% 20. פיק מושבה בודדת, ופס לצלחת ברביעים, באמצעות לולאת inoculating סטרילי חדשה לכל רבע, כדי לקבל מושבות מבודדות. לחלופין, לספור את ג מושבות difficile של כל דילול (עשוי להתבצע בתנאים אירוביים), ולחשב את מספר יחידות המושבה להרכיב לגרם של דגימת צואה.
  7. אשר ג זיהוי difficile באמצעות גראם מכתים. לאחר גראם מכתים, ג difficile יופיע כמוטות סגולות וכמה תאים עשויים להכיל endospores מסוף. תגובת שרשרת של פולימראז זיהוי (PCR) של גנים המקודדים רעלן B עשוי לספק אישור נוסף שלזני toxigenic של ג difficile 21 תוך הקלדת multilocus רצף (MLST) היא מוצלחת לזיהוי והקלדה מדויקת של זנים ידועים וnontoxigenic של ג difficile 22.
  8. כדי לשמור על מלאי של ג difficile ב -80 ° C, לאסוף פרט, מושבה מבודדת מהצלחת אגר BHIS באמצעות inoculating לולאת סטרילי וresuspend המושבה ב10 מיליליטר של BHIS המופחת מראש מדיום נוזלי בתוספת 0.03% L-ציסטאין. *
  9. דגירה הלילה אנאירובי על 37 מעלות צלזיוס, או עד שהתרבות הופכת להיות עכורה.
  10. הוספת 333 μl של גליצרול 50% ו666 μl של ג תרבות difficile לצינור קירור מיליליטר 1.8 ליצור 15% מניית גליצרול של הזן המבודד.
  11. חוזקה מכסה את צינור הקירור, לערבב היטב ולהסיר את המניות באופן מיידי מהאולם ומקום אנאירובי במקפיא -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך.

3. Culturing ג difficile ממניות קפואות גליצרול

הליך זה מספק להתאוששות של ג difficile ממניות גליצרול מאוחסנות ב -80 ° C. בגלל להקפיא להפשיר מחזורים חוזרים ונשנים עשויים להרוג תאים של צמח, חשוב לשמור על מניות גליצרול קפוא בכל העת. אנו לא ממליצים על השימוש בקרח יבש להעברת זנים ובמתוך החדר כמו האידוי של קרח יבש יכול לשנות את הסביבה בתוך התא. במקום זאת, אנו ממליצים על שימוש במדפי קירור קפוא כדי לשמור על מניות גליצרול קפוא במהלך הובלה. למטרות סלקטיבית והפרש שונים, שלוש תקשורת משמשות בדרך כלל לculturing ג difficile. TCCFA, כפי שפורט לעיל, הוא סלקטיבי לג difficile ומכיל taurocholate נתרן, germinant. עירוי לב המוח בתוספת תמצית שמרים (BHIS) הוא מדיום נפוץ, מועשר, הלא סלקטיבי המאפשר לצמיחה של מגוון רחב של אורגניזמים (איור 2 א) 24. לעתים קרובות, L-cysteinדואר מתווסף לBHIS כסוכן צמצום 20. לבסוף, התוספת של דם לבינוני (איור 2) מאפשרת לנביגה יעילים יותר מאשר על TCCFA ומספקת לצורך זיהוי של הקרינה ירקרקה או ירקרקה הייחודית הוצגה על ידי ג difficile תחת אולטרה סגול ארוך גל (UV) אור 15 (איור 2 ג). כאשר culturing ג difficile ממניות נבג, זה קריטי לזכור שtaurocholate נתרן יש להוסיף למדיום כדי להבטיח נביטה.

לפני שיתחילו, יש להציב את הפריטים הבאים לתוך תא אנאירובי:

  • מניית גליצרול קפואה (בקירור מדף)
  • לולאות inoculating סטרילי
  • צלחות TCCFA או BHIS (ראה חומרים)
  • BHIS מרק (ראה חומרים)
  • גליצרול 50% (מעוקר)
  • בקבוקוני אחסון קריוגני
  1. הנח את מניית גליצרול הקפואה של ג difficile במדף קירור שכבר מאוחסן ב -80 יחסי ציבור C °IOR להשתמש כדי למנוע הפשרה.
  2. להביא את מניית גליצרול הקפואה בקרח יבש לתוך תא אנאירובי.
  3. באמצעות טכניקת aseptic וinoculating לולאת סטרילי, הנח כמות קטנה של המניות לצלחת ומאיר ברבע אחד של הצלחת.
  4. סובב את צלחת ° 90 ו, באמצעות לולאת inoculating סטרילי חדשה, תמשיך בעירום פני רבע השני.
  5. חזור לרביעים שלישיים והרביעי כדי להבטיח את הבידוד של מושבות בודדות.
  6. מייד להסיר את מניית גליצרול הקפואה מתא אנאירובי ולחזור ל° -80 ג
  7. דגירה את צלחת אנאירובי הלילה בשעה 37 ° C. יש לשים לב מושבות מבודדות בודדות לאחר צמיחה בן לילה.

4. נבגי טיהור מג difficile

כפי שנדרש נביגה להישרדות בסביבות עשירה בחמצן ולהעברה יעילה של מחלת 8, ההכנה של מניות נבג היא often נחוץ ליישומים במורד הזרם, אינו מוגבלים למחקרי מיקרוסקופיה ובעלי חיים. חשוב לציין כי ספירת נבגים דורשת חזרות כדי להבטיח שחזור של ספירה. Pipetting מעלה ומטה מספר פעמים בין דילולים גם מפחיתה את האובדן מאז נבגים לדבוק פלסטיק היטב.

נביגה של ג difficile הוא לא מהיר כמו או הומוגנית כמו מיני sporogenic אחרים. כדי לייעל את ייצור נבג והתאוששות, או בינוני נביגה (SMC) 17,25 או 70:30 בינוני 26 מומלץ. מדיה אחרת הנפוצה הן BHIS, המחייב 4-5 ימים של צמיחה לפני נביגה יעיל נתפסת 27, וClospore, מדיום נוזלי שמייצר כותרות גבוהות של נבגים (אוקטובר 7 - אוקטובר 8 נבגים למיליליטר) לאחר 72 שעות של צמיחה. פרוטוקולים אחרים להשתמש במים קרים כקרח ולא 1X PBS 20, עם זאת, השימוש בתמיסה איזוטונית יכול להפחית את הנבגים מלהידבק זה לזה משטחים אחרים ופלסטיק. לחלופין,כמה חוקרים לטהר נוספים הנבגים שלהם באמצעות שיפוע סוכרוז כדי להסיר באופן מלא תאים ופסולת 29 וגטטיבי.

לפני שיתחילו, יש להציב את הפריטים הבאים לתוך תא אנאירובי:

  • לולאות inoculating סטרילי
  • BHIS, SMC ו / או 70:30 צלחות (ראו חומרים)
  • BHIS מרק (ראה חומרים)
  • עיקור-מסנן 1x PBS, (ראה חומרים)
  1. תרבות זנים ממניות גליצרול קפוא לצלחות BHIS מופחתות מראש ודגירת אנאירובי הלילה בשעה 37 ° C.
  2. Restreak על כמה SMC המופחת מראש או 70:30 צלחות דגירה אנאירובי ב37 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות. יצירת נבגים ניתן בעקבות באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב. נבגים יופיעו גטטיבי בהיר ואילו שלב ותאי אם יופיעו כהה שלב. * כחלופה, יכולים להיות מטוהרים נבגים מ70:30 מדיום נוזלי לאחר 24-48 שעות, אשר מניב 10 5 -10 6 נבגים למיליליטר, תלוי בstraiמשמש n.
  3. שימוש inoculating לולאת סטרילי, לגרד צלחות וresuspend התאים 10 מיליליטר סטרילי 1X PBS.
  4. בטל צלחות ולהסיר השעיה נבג מתא אנאירובי. גלולה התאים ב 3,000 XG במשך 15 דקות. לשטוף את התאים פעמיים ב 1x PBS, resuspending באופן מלא את התא גלולה בכל פעם.
  5. דגירה הלילה ב 4 ° C כדי לסייע בתמוגה של גטטיבי ותאים האם.
  6. לדגור על 70 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי להרוג את כל תאים של צמח שיורית.
  7. כדי לקבוע יחידות מושבה להרכיב (CFU) למיליליטר, סדרנו לדלל כל הכנת נבג ב 1x PBS וצלחת על BHIS + 0.1% taurocholate נתרן. דגירה צלחות למינימום של 24 שעות לפני ספירת מושבות.
  8. ניתן לאחסן את הנבגים ב 1x PBS בטמפרטורת חדר או או 4 ° C לאחסון ארוך טווח. אם מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס, זה עשוי להיות שימושי כדי לחמם הכנת הנבג ב-C ° 55 במשך 15 דקות כדי לשחזר את הנביטה יעילה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

דוגמא של ג difficile גדל על BHIS ותקשורת כבשים אנאירובי קולומביה אגר דם שניתן לראות באיור 2. ג difficile יוצר מושבות סדירות שהם שטוחים ובעלי מראה קרקע זכוכית אשר באו לידי ביטוי בשני אמצעי התקשורת. הנה, לבודד קליני אריתרומיצין רגיש של ג difficile, 630E 30, הוא גדל על BHIS אגר, מדיום מועשר, הלא סלקטיבי, ל24 שעות על 37 ° C (איור 2 א). מושבות על אגר דם קולומביה אנאירובי כבשים נראות דומות לאלה שגדלו על BHIS תחת אור...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השיטות שתוארו כאן לאפשר התאוששות פשוטה ומהירה של ג difficile ממגוון רחב של דגימות צואה, כולל בני אדם, עכברים ואוגרים, כמו גם האחסון לטווח הארוך של ג difficile כמו מניות גליצרול או נבג. ג difficile יכול להיות אורגניזם קשה לעיבוד, אך הקפדה על סביבת אנאירובי והיישום של טכניקות אספטיים יכולים לספק לצמיחה איתנה והפחתה בזיהום.

תאים אנאירוביים: שיקולים ותחזוקה

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

ברצוננו להודות למתחנחן מעבדות באדיבות מתן תמונות של חדר אנאירובי. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק DK087763 (SMM) ותכנית לימודים STEP / HHMI פיתוח מלגה (Ane).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פרוטאוז פפטון מס' 2BD212120
Na2HPO4FisherS373
KH2PO4FisherBP362
NaClFisherS27
MgSO4 (נטול מים)FisherM65
á'...-פרוקטוזפישרL96
נתרן טאורוכולטסיגמאT4009
á'...-ציקלוסריןסיגמאC6880
CefoxitinFlukaC4786
עירוי לב מוח בינוניBD237300
פרוטאוז פפטוןBD211684
(NH4)2SO4SigmaA5132
Tris baseFisherBP152
AgarBD214010
L-cysteineSigmaC7755
BactoPeptoneBD211684
אגר דם כבשים קולומביאניFisherL21928
NaClFisherS27
KClFisherP217
גליצרולFisherBP2291
לולאות חיסון סטריליותFisher22363596
ספוגיות סטריליותFisher1495990
Coy ויניל תא אנאירובי ואביזריםCoy Laboratory Products, Incשצוין על ידי הלקוחפריטים אלה מוזמנים בהתאמה אישית לפי צרכי
Materials
TCCFA agar

proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g
Na2HPO4 5 g
KH2PO4 1 גרם
NaCl 2 גרם
MgSO4 (נטול מים) 0.1 גרם
פרוקטוז 6 גרם
אגר 20 גרם

להביא ל-1 ליטר עם מים נטולי יונים וחיטוי ב-121 & deg; C למשך 20 דקות לעיקור.

לאחר החיטוי, הוסף:
10 מ"ל של 10% (w/v) נתרן טאורוכולאט, מעוקר במסנן (מומס במים; ריכוז סופי, 0.1%)
25 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל á'...-ציקלוסרין, מעוקר במסנן (מומס במים; ריכוז סופי, 250 μ גרם/מ"ל)
1.6 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל צפוקסיטין, מעוקר במסנן (מומס במים; ריכוז סופי, 16 μ גרם/מ"ל)

BHIS בינוני

חליטת לב למוח 37 גרם
תמצית שמרים 5 גרם

לצלחות, יש להוסיף 15 גרם אגר. הביאו ל-1 ליטר עם מים נטולי יונים וחיטוי ב-121 מעלות; C למשך 20 דקות לעיקור.

אופציונלי (להוסיף לאחר חיטוי):

3 מ"ל של 10% (w/v) L-cysteine (מומס במים; ריכוז סופי, 0.03%)
10 מ"ל של 10% (w/v) נתרן טאורוכולט (מומס במים; ריכוז סופי, 0.1%)

SMC Sporulation בינוני

BactoPeptone 90 g
פרוטאז פפטון 5 גרם
(NH4)2SO4 1 g
בסיס Tris 1.5 g
Agar 15 g

להביא ל-1 ליטר עם מים נטולי יונים וחיטוי ב-121 & deg; C למשך 20 דקות לעיקור.

אופציונלי (להוסיף לאחר חיטוי):
3 מ"ל של 10% (w/v) L-ציסטאין (נמס במים; ריכוז סופי, 0.03%)

70:30 בינוני

בקטופפטון 63 גרם
פרוטאז פפטון 3.5 גרם
חליטת לב למוח 11.1 גרם
תמצית שמרים 1.5 גרם<>> (NH)2SO4 0.7 g
בסיס Tris 1.06 g

לצלחות יש להוסיף 15 גרם אגר. הביאו ל-1 ליטר עם מים נטולי יונים וחיטוי ב-121 מעלות; C למשך 20 דקות לעיקור. לאחר החיטוי, יש להוסיף 3 מ"ל של 10% L-ציסטאין (ריכוז סופי, 0.03%).

אגר דם

מומלץ להשתמש בצלחות אגר דם כבשים אנאירוביות מוכנות מראש של קולומביה (Fisher Scientific, L21928)35.

1X תמיסת מלח בופר פוספט (PBS)

NaCl 8.01 g
KCl 0.2 g
Na2HPO4 1.44 g
KH2PO4 0.27 g

הביאו ל-1 ליטר עם מים נטולי יונים והתאימו את ה-pH ל-7.4 עם HCl. מסנן יש לעקר לפני השימוש.
מעבדה

מקורות

  1. Hall, I. C., O'Toole, E. Intestinal flora in new-borin infants - With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).
  2. Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. Clindamycin-Associated Colitis - Prospective Study. Ann. Intern. Med. 81, 429-433 (1974).
  3. Gerding, D. N. Clostridium difficile 30 years on: what has, or has not, changed and why. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 2-8 (2009).
  4. Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C. Treatment of Clostridium difficile infection. Clin. Infect. Dis. 46, Suppl 1. 32-42 (2008).
  5. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin. Infect. Dis. 55, 88-92 (2012).
  6. Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin. Microbiol. Infect. 18, 5-12 (2012).
  7. Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143, 1171-1173 (2012).
  8. Deakin, L. J., et al. The Clostridium difficile spo0A gene is a persistence and transmission factor. Infect. Immun. 80, 2704-2711 (2012).
  9. Drasar, B. S. Cultivation of anaerobic intestinal bacteria. J. Pathol. Bacteriol. 94, 417-427 (1967).
  10. Leach, P. A., Bullen, J. J., Grant, I. D. Anaerobic CO 2 cabinet for the cultivation of strict anerobes. Appl. Microbiol. 22, 824-827 (1971).
  11. Killgore, G. E., Starr, S. E., Del Bene,, Whaley, V. E., N, D., Dowell, V. R. Comparison of three anaerobic systems for the isolation of anaerobic bacteria from clinical specimens. Am. J. Clin. Pathol. 59, 552-559 (1973).
  12. Bacic, M. K., Smith, C. J. Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 13, Unit 13C 11(2008).
  13. Doan, N., Contreras, A., Flynn, J., Morrison, J., Slots, J. Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria. J. Clin. Microbiol. 37, 171-174 (1999).
  14. Socransky, S., Macdonald, J. B., Sawyer, S. The cultivation of Treponema microdentium as surface colonies. Arch. Oral. Biol. 1, 171-172 (1959).
  15. George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 9, 214-219 (1979).
  16. Wilson, K. H., Silva, J., Fekety, F. R. Suppression of Clostridium difficile by normal hamster cecal flora and prevention of antibiotic-associated cecitis. Infect. Immun. 34, 626-628 (1981).
  17. Wilson, K. H., Kennedy, M. J., Fekety, F. R. Use of sodium taurocholate to enhance spore recovery on a medium selective for Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 15, 443-446 (1982).
  18. Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).
  19. Marler, L. M., et al. Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools. J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).
  20. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1(2009).
  21. Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. Genetic manipulation of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2(2011).
  22. Lemee, L., Pons, J. L. Multilocus sequence typing for Clostridium difficile. Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).
  23. Shanholtzer, C. J., Peterson, L. R., Olson, M. N., Gerding, D. N. Prospective study of gram-stained stool smears in diagnosis of Clostridium difficile colitis. J. Clin. Microbiol. 17, 906-908 (1983).
  24. Smith, C. J., Markowitz, S. M., Macrina, F. L. Transferable tetracycline resistance in Clostridium difficile. Antimicrob. Agents Chemother. 19, 997-1003 (1981).
  25. Permpoonpattana, P., et al. Surface layers of Clostridium difficile endospores. J. Bacteriol. 193, 6461-6470 (2011).
  26. Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins. J. Bacteriol. , (2013).
  27. Burns, D. A., Minton, N. P. Sporulation studies in Clostridium difficile. J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).
  28. Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).
  29. Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid. J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).
  30. O'Connor, J. R., et al. Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants. Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).
  31. Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface. J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).
  32. Koch, C. J., Kruuv, J. The release of oxygen from polystyrene Petri dishes. Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).
  33. Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J. Bacteriol. , (2012).
  34. Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. Anaerobic cell culture. Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F(2009).
  35. Lyras, D., et al. Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature. 458, 1176-1179 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תא אנאירוביבידוד דגימות צואההכנת מוגב גליצרולספירת נבגיםזריעה במצע סלקטיבידגירה אנאירוביתחישוב CFUרמת בטיחות ביולוגית 2תרבית תאים וגטטיביים
Culturing ושמירה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.