חקר אינטראקציות של סטפילוקוקוס עם נויטרופילים ידי cytometry זרימה מיקרוסקופית וזמן לשגות

סיכום

אנו מציגים שיטות כדי לחקור את ההשפעה של PSMs ורעלים אחרים המופרשים על ידי סטפילוקוקוס בנויטרופילים באמצעות cytometry הזרימה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תקציר

אנו מציגים שיטות כדי לחקור את ההשפעה של modulins פנול מסיס (PSMs) ורעלים אחרים המיוצר ומופרש על ידי סטפילוקוקוס על נויטרופילים. כדי לחקור את ההשפעות של PSMs על נויטרופילים אנחנו מבודדים נויטרופילים טריים באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות. נויטרופילים אלה נטענים עם צבע שמאיר על גיוס סיד. ההפעלה של נויטרופילים ידי PSMs יוזמת גידול מהיר וחולף בריכוז הסידן התוך התאי ללא תשלום. בניסוי זרימת cytometry התגייסות מהירה זו ניתן למדוד על ידי ניטור הקרינה של צבע טעון מראש שמגיב לריכוז המוגבר של Ca ^{2 +} ללא תשלום. באמצעות שיטה זו אנו יכולים לקבוע את ריכוז PSM הצורך להפעיל נויטרופילים, ולמדוד את ההשפעות של מעכבים ספציפיים וכלליים של הפעלת נויטרופילים.

כדי לחקור את הביטוי של PSMs במרחב תאי, Wדואר בנה fusions הכתב של האמרגן של אופרון PSMα ל-GFP. כשכתב זנים אלה של ס ' aureus הם phagocytosed ידי נויטרופילים, יכולה להיות שנצפה האינדוקציה של ביטוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

מבוא

נויטרופילים (PMNs) הם phagocytes המקצועי שמשחקים תפקיד מפתח בתגובה החיסונית המולדת נגד Staphylococcus aureus ^1. המאבק המתמיד בין מארח והחיידק הוביל למירוץ חימוש של שניהם. לאחרונה, קהילה הקשורים (CA) זנים של meticillin עמיד ס aureus (MRSA) צמחו נראה שכדי להיות יעיל מאוד בעקיפה של נויטרופילים הרג ^2,3. ייצור יתר פנול מסיס modulin (PSMs) של CA-MRSA נקשר עם ארסיות גבוהה יותר ^4,5. נויטרופילים אדם יכולים לזהות PSMs אלה באמצעות FPR2 אשר להוביל להפעלה של ה-G-חלבון זה יחד ⁶ קולט. אחד האירועים הראשונים הוא ההתגייסות של חנויות תאיות של סידן (Ca ^{2 +).} Ca ^{2 +} משמש כשליח משני עבור מגוון רחב של פונקציות, כולל מפעיל של PMNs degranulation וphagocytosis ^7. לכן Ca ^{2 +} הוא אינדיקטור רגיש מאוד שליכולת התפקודית של PSMs להפעיל PMNs. כדי לחקור את ההשפעות של PSMs על נויטרופילים, נויטרופילים טריים מבודדים ועמוסים בצבע, כי מאיר על גיוס סיד. בניסוי זרימת cytometry ניתן למדוד התגייסות מהירה זה. באמצעות שיטה זו, ניתן ללמוד את ההשפעות הישירות של רעילים ורכיבים אחרים על נויטרופילים, ולקבוע את הריכוז הנמוך ביותר שבם הם פעילים. עבורנו, זה הוא כלי שימושי מאוד כדי לחקור את ההשפעה של חלבונים רבים המיוצרים על ידי ס aureus מעורב בהעלמה חיסונית, כגון חלבון מעכב FPR2 (FLIPr) ^8, FLIPr כמו ^7, וחלבון מעכב Chemotaxis של סטפילוקוקוס (שבבים) ^9. כל החלבונים האלה הוכחו לעכב את גיוס הסיד בנויטרופילים באמצעות קשירה לקולט הכרת אגוניסט.

לאחרונה, הקבוצה שלנו שתארה PSMs תפקודי מעוכבת על ידי יפופרוטאין בסרום ^{10 <}/ Sup>. יפופרוטאינים אלה הם שפע נוכחי בתוך הדם והרקמה אנושית, מה שמעיד שPSMs להפעיל את תפקידם בעיקר בסביבה תאית. הזמינות של assay גיוס הסיד אפשרה לנו למדוד את ההשפעה של ליפופרוטאין בסרום דווקא על הפעלה של נויטרופילים ידי PSMs, שמסומנת על ידי העיכוב הניכר בריכוזים נמוכים מאוד של סרום.

מאז PSMs תפקודי מעוכבים על ידי סרום, שערנו כי יש תפקיד חשוב לPSMs כרעלים תאיים. לכן אנו מבקשים לקבוע את תפקידו של PSMs לאחר phagocytosis. כדי לחקור את הביטוי של PSMs במרחב אינטר, בנינו fusions הכתב של האמרגן של אופרון psmα ל-GFP. כשכתב זנים אלה של ס ' aureus היה phagocytosed ידי נויטרופילים, האינדוקציה של ביטוי הייתה להבחין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ^10. ברור, זה טקhnique מאפשר הלימוד של הביטוי של מספר רב של גנים בס aureus או פתוגנים אחרים לאחר phagocytosis. מאחר לס aureus לשרוד בנישה בין התאית הוא מאוד חשוב כדי להתגבר על מערכת החיסון המולדת ^{11 10 12,} לומד את התפקיד של גנים מופעלים בנישה זו היא רלוונטי ביותר להבנת ביטוייה שונים.

פרוטוקול

1. בידוד של PMNs דם אנושי על ידי צנטריפוגה הצפיפות

1. צייר 5 9 צינורות מ"ל של דם ורידי heparinized.
2. הכן Ficoll הדרגתיים שכבה כפולה (4 הדרגתיים לדם 5 צינורות) באופן הבא: יוצקים 12 מ"ל של פתרון צפיפות 1.119 גרם / מיליליטר Ficoll בצינור 50 מ"ל ובזהירות שכבה 10 מ"ל של פתרון צפיפות 1.077 גרם / מיליליטר Ficoll על העליונה.
3. לדלל את הדם עם נפח שווה של PBS.
4. שכבת הדם המדולל בזהירות על שיפוע Ficoll השכבה הכפול; 20-25 מ"ל לשיפוע.
5. צנטריפוגה 20 דקות ב 396 XG ברוטור נדנוד דלי, 22 ° C ללא בלימה.
6. הכן RPMI קר המכיל 0.05% אנוש סרום אלבומין (RPMI-HSA). כמו כן להכין מיליליטר סטרילי deionized H ₂ O. 9 טרום מגניב גם RPMI וH ₂ O על קרח.
7. לשאוב את השכבה העליונה המכילה Ficoll פלזמה (בצבע צהוב) וPBMC, והשכבה השנייה של Ficoll (בצבע לבן) עם השימוש במשאבת ואקום (לשים על קצה פיפטה סטריליתפיפטה).
8. לאסוף את PMNs בצינורות 50 מ"ל באמצעות פיפטה פלסטיק קטנה (צינור 1 לשברי PMN של כל 2 הדרגתיים), ומניח אותם על קרח.
9. הוסף קר RPMI-HSA להיקף כולל של 50 מ"ל ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 249 XG ב 4 ° C.
10. קח את supernatant עם השימוש במשאבת ואקום ומערבולת גלולה בעדינות (אריתרוציטים וPMNs).
11. הוסף H ₂ O deionized סטרילי מ"ל 9 ולהתחיל את הטיימר. לעצור את ההלם האוסמוטי Hyper אחרי 30 שניות בדיוק, על ידי הוספת 1 מ"ל 10 פעמים PBS המרוכז. הערה: 30 שניות הן קריטיות מאוד.
12. הוסף קר RPMI-HSA להיקף כולל של 50 מ"ל ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 249 XG ב 4 ° C.
13. קח את supernatant עם השימוש במשאבת ואקום ולאסוף את כדור PMN בצינור 1 עם נפח מוגדר (1-2 מ"ל) RPMI-HSA.
14. לקבוע את הכמות של תאים ולהתאים את הריכוז ל1.10 ⁷ תאים / מ"ל. בהתאם לתורם, התשואה של PMNs מבודד תהיה betwex 10 ⁶ ו 3 10 ⁷ PMNs en 5 x מצינור כל מ"ל של דם 9

2. Assay תזרים cytometric להערכה של גיוס הסיד בPMNs אדם

1. תאי עומס (5 x 10 ⁶ תאים / מ"ל) עם 2 מיקרומטר Fluo-3-AM בRPMI-HSA ודגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר נדנדה לאט, באמצעות למשל נדנדה פלטפורמה שייקר, מוגן מפני אור.
2. בינתיים להכין דילול סדרתי (למשל פי 3) של הגירוי בריכוז הסופי 10x. PSMα3 נעשה שימוש בפרוטוקול זה, אך כל גירוי GPCR הפועל על נויטרופילים מתאים.
3. הכן מעכב מרוכז 10x של הקולטן בRPMI-HSA. כאשר המעכב פועל על הגירוי (HDL למשל בPSMα3) גירוי μl מראש דגירה 25 עם נפח שווה של מעכב למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר.
4. שטוף תאים על ידי הוספת 10 מ"ל של RPMI-HSA ו צנטריפוגות במשך 249 XG בטמפרטורת חדר. תאי Resuspend עד 5 X10 ⁶ תאים / מ"ל.
5. רגע לפני הניסוי, לדלל את התאים ל2x10 ⁶ תאים / מ"ל בRPMI-HSA ולהוסיף 200 תאי μl לכל צינור FACS. PMNs המדולל הם מאוד שבירים. שמירה על אותם זמן רב מדי בריכוז זה תוביל להפעלה אוטומטית; אותו מחזיק לטלטול נמרץ או pipetting.
6. צרף את הצינור לcytometer הזרימה, לחכות 3 שניות ולהתחיל רכישה. לאחר פרק זמן קבוע (לדוגמא 8 שניות), תוריד את הצינור במהירות ולהוסיף 50 גירוי μl למדגם. מייד לצרף מחדש את הצינור על בעל המדגם ולהמשיך ברכישה.
7. התחל עם סוף הנמוך ביותר ועם הריכוז הגבוה ביותר של גירוי. שטוף את מחט זרימת cytometer באופן קבוע אחרי כל סיבוב עם RPMI-HSA.
8. לנתח נתונים עם תוכנת ניתוח cytometry זרימה. השווה את אות הקרינה הממוצעת לפני תוספת של הגירוי לכי לאחר תוספת של הגירוי ולהשתמש בפקדים החיוביים ושליליים המתאימים כדי לחשב את ACכוח tivation עבור כל דילול שנמדד.

לחלופין, כאשר המעכב פועל על קולט מראש דגירה תאים עם המעכב.

3. ניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטי של הביטוי של GFP חיידקים לאחר phagocytosis ידי PMNs

1. לגדול ס זני סטפילוקוקוס המכילים מבנה כתב עניין במשך הלילה במרק (עם אנטיביוטיקה כאשר נדרשים לשמור על כתב פלסמיד). במקרה זה מתח MW2 המכיל משמש מבנה כתב GFP PSMα ^10, גדל בצינור פלסטיק 50 מ"ל עם 5 מ"ל של מדיום תרבות LB.
2. כדי להסיר את כל GFP מביטוי O / N, לדלל את התרבויות לOD ₆₆₀ 0.01 ולגדול לקוטר חיצוני 0.1 _660. Redilute 01:30 תרבות זו, ולעקוב אחר צמיחה עד התרבות מגיעה OD ₆₆₀ של 0.1. לאסוף את החיידקים על ידי צנטריפוגה ולשטוף פעם בDPBS. Resuspend ב1:10 הנפח המקורי כדי להשיג ₆₆₀ OD של 1.0 או rקירוב 5.10 ⁸ CFU / מ"ל.
3. מערבבים את החיידקים (1.10 ⁷ / מ"ל) עם PMNs המבודדים טרי (1.10 ⁶ / מ"ל) בRPMI-HSA (יחס 10:01) בmicrotube 1.5 מ"ל ולהוסיף סרום אנושי ונקווה לריכוז סופי של 10%. לנער על פלטפורמה רועדת במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לעורר phagocytosis. לדלל את PMNs עמוסי חיידקים ל5.10 ⁵ PMNs / מ"ל וμl פיפטה 250 לתוך באר של להחליק את מכסה קבורים גם 8.
4. תדמית PMNs עם חיידקים במיקרוסקופ. מיקרוסקופ ההפוכה מצוידות אובייקטיבי NA 40X/0.85 עובדת טוב וצריכה להיות עטוף בתא סביבה חשוך כדי לשמור על הסביבה ביציבות על 37 ° C. לרכוש תמונות למספר התפקידים מוגדרים מראש באמצעות המצלמה בכל 5-10 דקות בשניהם בשדה הבהיר וערוץ ה-GFP לעקוב ייצור ה-GFP בזמן.

תוצאות

assay תזרים cytometric להערכה של גיוס הסיד בPMNs אדם

דוגרים נויטרופילים עם סדרת ריכוז PSMα3 סינטטי וכתוצאה מההפעלה מהירה כפי שהיא נמדדת על ידי שטף סידן, המוצג על ידי גידול באות בFL-1. טרום דגירה של PSMα3 הסינטטי עם 0.01%, 0.1% או 1% בסרום אנושי עכבות היכולת לעורר נתיבי סיד (איור 1) באופן משמעותי.

ניתוח של הביטוי של GFP בחיידקים לאחר p...

דיון

בשיטות שתוארו כאן כמה צעדים הם מאוד קריטיים. אנו ידגישו אלה כאן.

לבידודה של נויטרופילים ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות זה חשוב לא להפריע לשכבות במהלך או לאחר את צעדי צנטריפוגה. כאשר aspirating את הנויטרופילים באמצעות פיפטה פלסטיק, לוודא שלא לסחוט את הבלון ואילו בשכבה של תאים, כמו הנוזל להוציא יפריע את השכבות. כמו כן, מבחינה ויזואלית לבדוק גלולה של נויטרופילים אחרי ההלם האוסמוטי וצעד צנטריפוגה. אם גלולה עדיין תמוגה הכ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Fluo-3, AM	בדיקות מולקולריות / Life Technologies	F-1241
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-5442-03	צפיפות 1.077 גרם/מ"ל
Histopaque	Sigma	11191	צפיפות 1.119 גרם/מ"ל
RPMI 1640	Gibco, Life Technologies	52400-025	מכיל 25 מ"מ HEPES ומיקרוסקופ L-גלוטמין
Leica TCS SP5	Leica מיקרוסיסטמס, הולנד	TCS SP5	מטרה: HCX PL APO 40x/0.85
FACSCalibur	BD Biosciences	FACSקליבור	חשוב מאוד שניתן יהיה להסיר ולהחליף את הצינור במהלך תהליך המדידה