הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שימוש בכימיה לחץ כדי למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בסינתזת RNA Host-Cell

11.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50809

⸱

9 באוגוסט 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Sealy Center for Vaccine Development, Center for Biodefense and Emerging Infectious Diseases, University of Texas Medical Branch

במאמר זה

סיכום

שיטה זו מתארת ​​את השימוש בכימיה לחץ כדי למדוד שינויים בשעתוק תא מארח לאחר הדבקה בנגיף קדחת הבקעה (RVFV) מתח MP-12. תוצאות יכולות להיות דמיינו איכותית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או הושגו כמותית באמצעות cytometry הזרימה. שיטה זו ניתנת להתאמה לשימוש עם וירוסים אחרים.

תקציר

רבים וירוסי RNA התפתחו היכולת לעכב שעתוק תא מארח כאמצעי לעקוף את ההגנות של סלולריות. לצורך המחקר של וירוסים אלה, ולכן חשוב לנו בצורה מהירה ואמינה למדידת פעילות תעתיק בתאים נגועים. באופן מסורתי, שעתוק כבר נמדד גם על ידי שילוב של נוקלאוזידים רדיואקטיביים כגון H-3 uridine אחרי גילוי דרך autoradiography או נצנץ ספירה, או שילוב של תולדות אנלוגים uridine כגון 5-bromouridine (BRU) ואחריו גילוי דרך immunostaining. השימוש באיזוטופים רדיואקטיביים, לעומת זאת, דורש ציוד מיוחד ולא ריאלי במספר הגדרות מעבדה, תוך זיהוי של ברו יכול להיות מסורבל ועלול לסבול מרגישות נמוכה.

הכימיה לחץ שפותחה לאחרונה, הכוללת היווצרות triazole נחושת קטליזאטור מיזיד וalkyne, החברה מספקת מהירה וhighlחלופה רגישה Y לשתי השיטות הללו. לחץ כימיה היא תהליך שלב שני שבו RNA המתהווה הוא שהכותרת ראשונה על ידי שילוב של אנלוגי uridine 5 ethynyluridine (איחוד אירופי), ואחריו גילוי של התווית עם אזיד ניאון. azides האלה זמינים בכמה fluorophores שונה, המאפשר מגוון רחב של אפשרויות לשם ויזואליזציה.

פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת דיכוי שעתוק בתאים נגועים בנגיף קדחת בקעת (RVFV) מתח MP-12 באמצעות לחץ כימיה. במקביל, ביטוי של חלבונים נגיפיים בתאים אלה נקבע על ידי immunostaining תאי הקלסית. שלבי 1 עד 4 פירוט שיטה לדמיין דיכוי תעתיק באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ואילו שלבי 5 עד 8 פירוט שיטה לכמת דיכוי תעתיק באמצעות cytometry הזרימה. פרוטוקול זה הוא להתאמה בקלות לשימוש עם וירוסים אחרים.

מבוא

באופן מסורתי, פעילות תעתיק כבר נמדד באמצעות שילוב של שני רדיואקטיבי (H-3 uridine) 1 או הלוגנים (BRU) 2 נוקלאוזידים לרנ"א המתהווה. אנלוגים uridine אלה נלקחו על ידי תאים, הוסבו uridine-אדנוזין (UTP) דרך מסלול ההצלה nucleoside, ושולבו לאחר מכן לתוך RNA מסונתז חדש. ניתן לאתר 3 H-uridine ידי autoradiography, שיכול להימשך זמן רב, או נצנץ ספירה, אשר דורש ציוד מיוחד. יתר על כן, השימוש באיזוטופים רדיואקטיביים לא יכולים להיות מעשי במספר הגדרות מעבדה, כולל מעבדות בטיחות ביולוגיות הכלה גבוהה. ניתן לאתר באמצעות ברו immunostaining עם נוגדנים נגד ברו, אשר עשוי לדרוש permeabilization הקשה כדי להבטיח גישה של הנוגדן לגרעין או denaturation החלקית של רנ"א, כמבנה המשני RNA עשוי להיות הפרעה סטרית לכריכת נוגדנים.

_content "> הפרוטוקול המתואר כאן מנצל את הכימיה לחץ פיתחה לאחרונה לחץ כימיה 3 למדידת פעילות תעתיק בתאים נגועים בזן RVFV MP-12. מסתמכת על נחושת סלקטיבי והיעילה ביותר (אני)-catalyzed תגובת cycloaddition בין alkyne ו מחצית אזיד 4,5. בפרוטוקול זה, RNA המתהווה בתאים נגועים שכותרתו ראשונה באמצעות שילוב של uridine האנלוגי האיחוד האירופי. בשלב שני, האיחוד האירופי Incorporated הוא זוהה באמצעות תגובה עם אזיד ניאון. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם (1) שהיא אינה דורשת את השימוש באיזוטופים רדיואקטיביים ו( 2) שהיא אינה דורשת permeabilization הקשה או denaturation של רנ"א. עם משקל מולקולרי של פחות מ -50 דא, גישה של אזיד הניאון לא הקשתה על ידי מספיק permeabilization או RNA מבנה המשני. יתר על כן, חוקרים אינם מוגבלים בבחירתם של נוגדנים עיקריים כאשר שילוב זיהוי של RNA עם כיתהimmunostaining iCal לחלבונים ויראליים.

שתי שיטות שונות מתוארות בפרוטוקול זה: אחת להמחשת שעתוק באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (צעדים 1-4), ואחד לכימות שעתוק באמצעות cytometry זרימה (שלבים 5-8). שתי שיטות אלה משלבות תיוג של רנ"א המתהווה עם immunostaining תאי לחלבונים נגיפיים, המאפשר למתאם בין פעילות תעתיק וזיהום ויראלי על בסיס תא אחר תא.

החוקרים השתמשו בהצלחה בפרוטוקול שתואר כאן כדי לקבוע פעילות תעתיק בתאים נגועים בזן RVFV MP-12 6, התאים נגועים במוטציות שונות MP-12, 9, 7,8 ותאים נגועים בנגיף טוסקנה (TOSV) 10. ניתן להתאים הפרוטוקול המתואר כאן בקלות לשימוש עם וירוסים שונים ויש לו את הפוטנציאל להיות שונה כדי לכלול מכתים immunofluorescence של חלבונים נגיפיים או סלולריים ספציפיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ניתוח של שעתוק על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי

1. להדביק תאים עם RNA המתהווה ייבל עם איחוד אירופי MP-12 ו

  1. מקום coverslips 12 מ"מ עגול לצלחת תרבית רקמת 12 גם, שאחד coverslip בכל טוב.

הערה: אם יש לי תאי צרות דבקות coverslips, מעיל עם פולי-L-ליזין (MW ≥ 70,000) לפני הצבת בבארות. למטרה זו, coverslips לצלול בפתרון מ"ג / מ"ל 0.1 סטרילי בH 2 O של פולי-L-ליזין למשך 5 דקות. יש לשטוף coverslips עם סטרילי H 2 O ואוויר יבש לפחות שעה 2.

  1. לזרע 293 תאים על coverslips, להוסיף 5 x 10 4 תאים במדיום גידול 1 מ"ל (DMEM המכיל 10% בסרום שור עוברי, 100 U / ml פניצילין ו100 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין) בכל טוב. דגירה בחממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 O / נ
  2. להדביק תאים עם MP-12 בריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 3. לכלול לפחות שני בארות נגועים: אחת משתי הבארות תשמש כשליטה נגוע, אחרים יטופל בactinomycin D (ActD) בצעד 1.5 כשלט לדיכוי תעתיק. הסר את מדיום גידול ולדלל את מניות הווירוס, כך שהנפח הכולל הוסיף גם הוא לכל 200 מ"ל. דגירה במשך שעה 1 בחממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.

הערה: במקום להדביק תאים, יכולים גם להיות transfected תאים עם DNA פלסמיד או במבחנה מסונתזת RNA קידוד חלבון נגיפי ספציפי. למטרה זו, עם transfect תאים מגיב transfection כימי מתאים בהתאם להוראות היצרן והמשך לשלב 1.5 ב16 transfection ההודעה HR. רצוי לייעל את תנאי transfection וזמן דגירה לפני התיוג וקיבוע רנ"א.

  1. הסר את הבידוד ולהוסיף צמיחה בינונית טרי 1 מ"ל לכל טוב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 שעות.
ove_content ">. הערה: אם התאמת פרוטוקול זה לשימוש עם וירוס אחר, רצוי לבצע ניסוי כמובן זמן כדי לקבוע את נקודת הזמן האופטימלית לתיוג וקיבוע RNA הגדר את מהלך הזמן הזה, כך שפעמי הזיהום הם מעד וכל יכולות להיות שכותרתו דגימות, קבועים, ומוכתם באותו הזמן.

  1. בגיל 15 לאחר זיהום שעה (HPI), להחליף את מדיום גידול עם מדיום המכיל 1 מ"מ איחוד אירופי. לאחת מהבארות נגועות מדומה, גם להוסיף 5 מיקרוגרם / ActD מ"ל. זה ישמש כשלט לדיכוי תעתיק, כפי ActD מעכב סינתזת RNA-DNA תלויה. חזור תאים לחממה.
  2. בגיל 16 HPI, להסיר את המדיום ולשטוף את coverslips פעם אחת עם 1 מיליליטר PBS (KCl 0.20 גר '/ ל', KH 2 PO 4 0.20 גר '/ ל', NaCl 8.00 גר '/ ל', Na 2 HPO 4 1.15 גר '/ ל', pH 7.4) בכל טוב. תקן את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) לכל טוב ודוגר במשך 30 דקות ב RT.

> שים לב: כדי להכין 4% PFA פתרון קיבעון, לפזר paraformaldehyde G 10 בH 2 O 150 מ"ל מחומם ל 60 מעלות צלזיוס בstirrer מגנטי מחומם. הוסף 500 μl של 1M NaOH ולהמשיך לבחוש עד שהפתרון הופך ברור. פתרון סינון PFA דרך נייר סינון כדי להסיר את החלקיקים ולהוסיף 62.5 מ"ל פוספט חיץ (77 מ"מ אא 2 PO 4, 287 מ"מ Na 2 4 HPO, pH 7.4). הוסף H 2 O עד נפח כולל של 250 מ"ל. להקפיא ב -20 ° C בaliquots שימוש יחיד.

  1. שטפי פעם עם 1 מיליליטר PBS בכל טוב. זמן דגירה לא נדרש לכך ואת כל צעדים לשטוף לאחר מכן. פנה מייד לצעד 2.

הערה: חשוב להמשיך מייד עם התגובה לחץ, כמו רנ"א מתנוון אם כל הזמן בשלב זה לתקופות ממושכות של זמן: הפסד של אות הקרינה RNA כבר ניתן לראות אם תאים נשמרים במשך שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס . בדומה לכך, אם לכלגיבוש ניסוי כמובן זמן, כדי להיות בטוח תווית, לתקן, ולהכתים את כל הדגימות באותו הזמן.

2. לחץ על תגובה לזיהוי תווית RNA

  1. Permeabilize תאים על ידי הוספת 1 מ"ל 0.2% טריטון X-100 ב PBS. דגירה במשך 10 דקות ב RT.

הערה: כל פתרונות המשמשים בשלבים 2.1-2.3 צריכים להיות nuclease ללא תשלום.

  1. לשטוף שלוש פעמים עם 1 מיליליטר PBS בכל טוב.
  2. הסר coverslips מצלחת 12 היטב ולהעביר לתוך תא לח. כיסוי כל coverslip עם 50 - פתרון 100 μl לחץ מכתים (100 מ"מ טריס pH 8.5, 1 מ"מ CuSO 4, 20 מיקרומטר יזידו ניאון [מרבי עירור / פליטה: 590/617 ננומטר], חומצה אסקורבית 100 מ"מ) כל אחד. דגירה במשך שעה 1 ב RT בחושך.

הערה: כדי להרכיב את התא, הקו הלח התחתון של תרבית תאים או צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ עם סרט פרפין פלסטיק. מרפד את החלק הפנימי של הקצה של דיsh עם מגבות נייר לחות. הנח את coverslips על סרט פרפין הפלסטיק.

הערה: היזהר שלא לתת את coverslips להתייבש בזה או בכל שלב אחר בפרוטוקול. עדיף להוסיף את הפתרון מכתים לכל coverslip ישירות לאחר שהושם בתא הלח.

שימו לב: הכן לחץ מכתים פתרון הטרי מייד לפני הצעד הזה. פתרונות מניות של 1.5 מ 'טריס pH 8.5, 100 מ"מ CuSO 4, וחומצה אסקורבית 500 מ"מ ניתן לאחסן ב 4 ° C. עם זאת, להשליך כל פתרון מניות חומצה אסקורבית שהפך צהובה.

שים לב: הקפד לבחור fluorophore התואם את המסננים על מיקרוסקופ פלואורסצנטי שלך.

  1. הסר coverslips מחדר והמקום לח לתוך צלחת 12 גם טרי ולשטוף שלוש פעמים עם 1 מיליליטר PBS בכל טוב.

הערה: אם אין דהtection של חלבונים נגיפיים הוא רצוי, יכולה להיות מותקנת coverslips וצלמה לאחר שלב זה (המשך לשלב 3.3).

3. Immunofluorescence כדי לזהות ביטוי של חלבונים נגיפיים

  1. הוסף 1 מ"ל של חיץ חסימה (3% (w / v) אלבומין בסרום שור (BSA) ב-PBS) זה טוב ודגירה במשך 30 דקות ב RT בחושך.
  2. הסר coverslips מצלחת 12 היטב, העברה לתא לח ולכסות עם 50 - 100 μl של נוגדן ראשוני (אנטי RVFV, מתנה מסוג ד"ר RB Tesh, UTMB) דילול בחסימת המאגר (1:500). דגירה במשך שעה 1 ב RT בחושך.

שים לב: כאשר התאמת פרוטוקול זה לשימוש בוירוס שונה, לקבוע את הדילול האופטימלי לנוגדן הראשוני שלך ראשון.

הערה: לחלופין, ניתן לבצע את הצעד הזה O / N ב 4 ° C בחושך.

  1. הסר coverslips מחדר והמקום לח בחזרה לתוך צלחת 12 היטב ולשטוףגם לשלוש פעמים עם 1 מיליליטר PBS.
  2. הסר coverslips ממקום 12 גם, מקום לתא וכיסוי לח עם 50 - 100 μl של נוגדנים משני (אנטי עכבר IgG מצומדות לצבע פלואורסצנטי [מרבי עירור / פליטה: 495/519 ננומטר]) דילול בחסימת המאגר (1: 500). דגירה במשך שעה 1 ב RT בחושך.

שים לב: הקפד לבחור את נוגדנים משני שיכול לזהות את הנוגדן הראשוני שלך ותואם את המסננים על מיקרוסקופ פלואורסצנטי שלך.

הערה: אם תרצה, ניתן להוסיף 200 ng / ml DAPI לדילול הנוגדנים משני כדי להמחיש גרעינים.

  1. הסר coverslips מהחדר והמקום לח בחזרה לתוך צלחת 12 היטב ולשטוף שלוש פעמים עם 1 מיליליטר PBS בכל טוב.
  2. הר coverslips על ידי הצבת טיפה אחת (CA. Μl 15) של Fluoromount-G לשקופית מיקרוסקופ. טובלים את coverslip לH 2 O, להסיר עודפי H 2 O על ידי הנגיעה ה צד נגד דואר מגבת נייר, ומקום תאים בצד למטה לירידה של Fluoromount-G. אוויר יבש למשך 5 דקות.

הערה: אם הדמיה במיקרוסקופ הפוכה, לאפשר Fluoromount-G לבסס על 4 מעלות CO / N או להדביק את coverslips לשקופית מיקרוסקופ על ידי איטום הקצה עם לק השקוף.

הערה: יכולות להיות צילמו שקופיות באופן מיידי או מאוחסנות על 4 מעלות צלזיוס בחושך לתקופה של עד שבוע.

4. רכישת נתונים

  1. תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

שים לב: הקפד לבחור fluorophores המתאים שניתן דמיין באמצעות מיקרוסקופ שלך. לקבלת הפניה, להלן fluorophores וערכות מסנן המשמש לרכישת התמונות המוצגות בפרסום זה.

DAPI:
מסנן עירור: BP 330-385
Dichromatic מראה: DM 400
פליטת מסנן: LP 420

S = "jove_content"> Fluorophore עם מקסימום עירור / פליטה של ​​495/519:
מסנן עירור: BP 460-490
Dichromatic מראה: DM 505
פליטת מסנן: LP 510

Fluorophore עם מקסימום עירור / פליטה של ​​590/617:
מסנן עירור: BP 545-580
Dichromatic מראה: DM 600
פליטת מסנן: LP 610

ניתוח של שעתוק על ידי הזרימה cytometry

5. להדביק תאים עם RNA המתהווה ייבל עם איחוד אירופי MP-12 ו

  1. 293 תאי זרע לתוך צלחת תרבית רקמה 6 היטב במדיום גידול (DMEM המכיל 10% בסרום שור עוברי, 100 U / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין). דגירה בחממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד תאים יגיעו ל -80 - 100% confluency.
  2. להדביק תאים עם MP-12 במשרד פנים של 3. תכלול לפחות שתי בארות נגועים: אחת משתי הבארות תשמש שליטה נגוע, אחרים יטופל בActD בצעד5.4. הסר את מדיום גידול ולדלל את מניות הווירוס, כך שהנפח הכולל מתווסף גם כל הוא 400 μl. דגירה במשך שעה 1 בחממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  3. הסר את הבידוד ולהוסיף 2 מדיום גידול טרי מ"ל לכל טוב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.

הערה: אם התאמת פרוטוקול זה לשימוש עם וירוס אחר, רצוי לבצע ניסוי כמובן זמן כדי לקבוע את נקודת הזמן האופטימלית עבור תיוג וקציר. הגדר את מהלך הזמן הזה, כך שפעמי הזיהום הם מעד ויכולים להיות מתויגים כל הדגימות, שנקטפו, ומוכתם באותו הזמן.

  1. בגיל 12 HPI, להחליף מדיום גידול המכיל בינונית עם 0.5 מ"מ איחוד אירופי. לאחת מהבארות נגועות מדומה, גם להוסיף 5 מיקרוגרם / ActD מ"ל. זה ישמש כשלט לדיכוי תעתיק, כפי ActD מעכב סינתזת RNA-DNA תלויה. חזור תאים לחממה.
  2. בגיל 13 HPI, לשטוף תאי פעם שנינותשעות PBS וקציר על ידי trypsinization של תאים. שטוף תאים שנקטפו שלוש פעמים עם PBS המכיל 1 mM EDTA (PBS-EDTA).

הערה: במהלך פעולות אלה ולאחר מכן, לא צנטריפוגות תאים מהר יותר מאשר 500 - 1000 XG כדי למנוע שבירת תא. צנטריפוגה תאים 2 - 1 דקות למשקעים.

הערה: אם immunostaining פני השטח מתוכנן בעקבות לחץ התגובה, הקציר באמצעות שוטר גומי או מגרד תא הפנוי במקום.

  1. תקן את התאים על ידי resuspending ב 1 מ"ל של PFA 4% ו דגירה במשך 30 דקות ב RT. עיין בשלב 1.6 להוראות כיצד להכין PFA 4%.
  2. שטפי פעם עם 1 מיליליטר PBS-EDTA בכל טוב. להמשיך מייד לשלב 6.

הערה: חשוב להמשיך מייד עם התגובה לחץ, כמו רנ"א מתנוון אם כל הזמן בשלב זה לתקופות ממושכות של זמן. באופן דומה, אם ביצוע ג זמןניסוי ourse, הקפד תווית, לתקן ולהכתים את כל הדגימות באותו הזמן.

6. לחץ על תגובה לזיהוי תווית RNA

  1. Permeabilize תאים על ידי resuspending ב0.5 מ"ל של 0.2% טריטון X-100 ב PBS. דגירה במשך 10 דקות ב RT.

הערה: כל פתרונות המשמשים בשלבים 6.1-6.3 צריכים להיות nuclease ללא תשלום.

הערה: אם תאים אינם משקעים כראוי במהלך שלב זה, להגדיל את זמן צנטריפוגה עד 5 דקות. התנהגות שקיעה תשפר פעם אחת תאים תלויים בFACS חיץ (שלב 6.4).

  1. שטפי פעם עם 1 מיליליטר PBS.

הערה: אל תשתמש בEDTA בשלב זה כמו זה chelate Cu 2 + היונים ההכרחי לתגובת לחץ.

  1. תאי Resuspend ב 200 פתרון מכתים לחץ μl (100 מ"מ טריס pH 8.5, 1 מ"מ CuSO 4, 200nm אזיד מסומן עם פלורסנט לצבוע [excמקסימום itation / פליטה: 650/665 ננומטר], חומצה אסקורבית 100 מ"מ). דגירה במשך שעה 1 ב RT בחושך.

שימו לב: הכן לחץ מכתים פתרון הטרי מייד לפני הצעד הזה. פתרונות מניות של 1.5 מ 'טריס pH 8.5, 100 מ"מ CuSO 4, וחומצה אסקורבית 500 מ"מ ניתן לאחסן ב 4 ° C. עם זאת, להשליך כל פתרון מניות חומצה אסקורבית שהפך צהובה.

הערה: אם תאי גוש ביחד במהלך שלב זה, resuspend ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים.

שים לב: הקפד לבחור fluorophore שיכול להיות מזוהה על ידי cytometer הזרימה שלך.

הערה: ניתן גם להכין דגימה אחת של תאים נגועים שאינם כפופים להליך מכתים לחץ, אלה יהיו צורך בכיול של cytometer הזרימה. כך או להשתמש במחצית מהתאים הנגועים או לכלול נוסף נגוע גם בשלב 5.2. קון אלהתאי Trol יהיו immunostained בשלב 7.1.

  1. שטוף פעמיים עם FACS חיץ (PBS המכיל 1 mM EDTA ו 0.5% (w / v) BSA).

הערה: אם אין immunostaining של חלבונים נגיפיים הוא רצוי, ניתן לנתח תאים באופן מיידי (המשך לשלב 8).

7. Immunofluorescence כדי לזהות ביטוי של חלבונים נגיפיים

  1. תאי Resuspend ב 200 μl של נוגדן ראשוני (אנטי RVFV) דילול בFACS חיץ (1:10,000) ודגירה עבור שעה 1 ב RT בחושך.

הערה: לחלופין, ניתן לבצע את הצעד הזה O / N ב 4 ° C בחושך.

הערה: ניתן גם להכין דגימה אחת של תאים נגועים בו היו נתונים להליך מכתים לחץ אבל לא immunostained, אלה יהיו צורך בכיול של cytometer הזרימה. כך או להשתמש במחצית מהתאים הנגועים או המדומים כוללים גם נגוע נוספות בצעד 5.2.

שים לב: כאשר התאמת פרוטוקול זה לשימוש בוירוס שונה, לקבוע את הדילול האופטימלי לנוגדן הראשוני שלך ראשון.

  1. לשטוף את התאים פעמיים בחיץ FACS.
  2. תאי Resuspend ב 200 μl של נוגדנים משני (אנטי עכבר IgG מצומדות לצבע פלואורסצנטי [מרבי עירור / פליטה: 495/519 ננומטר]) בדילול מלא FACS חיץ (1:1,000) ודגירה עבור שעה 1 ב RT בחושך.
  3. לשטוף את התאים פעם אחת בחיץ FACS.

הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן תאי O / N ב 4 ° C בחושך.

8. רכישת נתונים

  1. Resuspend תאים ב500 FACS חיץ, העברת μl לתוך 5 מ"ל צינורות קלקר ולנתח באמצעות cytometer זרימה. השתמש MP-12 תאים נגועים (אין תגובה מכתים קליק, אנטי RVFV בלבד) ותאים נגועים מדומים (לחץ על תגובה בלבד) כדי לכייל את המכשיר.

לאדואר: הקפד לבחור fluorophores המתאים שיכול להיות מזוהה על ידי המכשיר שלך. לקבלת הפניה, להלן קווי לייזר ומערכות סינון ששמשו לרכישה את הנתונים המוצגים בפרסום זה.

Fluorophore עם ספקטרום עירור / פליטה של ​​495/519:
לייזר: 488 ננומטר
מסנן: 530/30

Fluorophore עם ספקטרום עירור / פליטה של ​​650/665:
לייזר: 640 ננומטר
מסנן: 670/20

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

החלבון של NSS RVFV (משפחת Bunyaviridae, Phlebovirus סוג) 11 מעכב שעתוק כללי תא מארח באמצעות שני מנגנונים נפרדים: (א) על ידי sequestering מקטע P44 של גורם השעתוק הבסיסי TFIIH 11 ו (ב) על ידי קידום השפלה proteasomal של p62 מקטע של 6 TFIIH. MP-12 זן תרכיב RVFV 13 שימש במשך הניסויים שתוארו בפרוטוקול זה מאז-12 MP מתח יכול להיות מטופלים במעבדת בטיחות ביולוגית ברמת 2 והוא לא נכלל בשלטון בחר הסוכן בארה"ב, אשר חל על פרוע אחרות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול סיפק מתאר שיטה למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בשעתוק תא מארח באמצעות שילוב של uridine האנלוגי האיחוד האירופי לרנ"א המתהווה. לשיטה זו מספר יתרונות על פני שיטות קודמות: הוא מהיר, רגיש, ושאינו מסתמך על השימוש באיזוטופים רדיואקטיביים. יתר על כן, ניתן להתאים את השיטה להניב נתונים איכותניים דרך מיקרוסקופ פלואורסצנטי או נתונים כמותיים באמצעות cytometry הזרימה באמצעות את אותם חומרים כימיים. בשילוב עם מכתים immunofluorescence לאנטיגנים נגיפיים, שיטה זו גם מאפשרת לחוקר לנקוט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

אנו מודים RB Tesh למתן העכבר polyclonal אנטי RVFV נסיוב ומ 'גריפין של מתקן Core cytometry זרימת UTMB לעזרה עם cytometry הזרימה. עבודה זו נתמכה על ידי 5 U54 AI057156 באמצעות המרכז האזורי המערבי של אקסלנס, מענק NIH R01 AI08764301, ומימון ממרכז Sealy לפיתוח חיסון בUTMB.BK נתמכה על ידי מלגת קרן מקלפלין וו ג'יימס בUTMB.OL נתמכה על ידי פרס מוריס הילמן ר 'בשלב מוקדם בקריירה חוקר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
5-ethynyl-uridineBerry AssociatesPY 7563מתמוססים ב-DMSO עבור מלאי 100 מ"מ
12 מ"מ כיסויים עגוליםFisherbrand12-545-82
צינורות פוליסטירן 5 מ"לBD Biosciences352058
Actinomycin D (ActD)Sigma9415מתמוססים ב-DMSO עבור מלאי 10 מ"מ
Alexa Fluor 488 עז אנטי-עכבר IgGInvitrogenA-11029
אלבומין סרום בקר (BSA) סנטה קרוזsc-2323
CuSO4SigmaC-8027מתמוסס ב-H2O עבור מלאי 100 מ"מ
DAPI SigmaD-9542מתמוסס ב-H2O עבור מלאי 5 מ"ג/מ"ל
DMEM Invitrogen11965092
FBSאזידInvitrogen 16000044
(Alexa Fluor 594-coupled)InvitrogenA10270
אזיד פלואורסצנטי (Alexa Fluor 657-coupled)InvitrogenA10277
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
L-ascorbicacid SigmaA-5960מתמוסס ב-H2O עבור 500 מ"מ
מסנן ניירVWRbrand28333-087
פרפורמלדהיד סיגמא158127
פניצילין-סטרפטומיציןInvitrogen15140122
פולי-L-ליזין (MW ≥ 70000)SigmaP1274
Triton X-100SigmaT-8787
בסיס TrizmaSigmaT-1503להתמוסס ב-H2O עבור מלאי של 1.5 M, pH 8.5
Trypsin-EDTAInvitrogen25200056
מיקרוסקופ פלואורסצנטילמשל Olympus IX71
Flow Cytometere. BD Biosciences LSRII Fortessa
פלואורסצנטי

מקורות

  1. Fakan, S. Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus. Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).
  2. Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies. Cytometry. 14, 455-458 (1993).
  3. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15779-15784 (2008).
  4. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 41, 2596-2599 (2002).
  5. Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
  6. Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs protein of rift valley fever virus promotes posttranslational downregulation of the TFIIH subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
  7. Kalveram, B., et al. Rift Valley fever virus NSs inhibits host transcription independently of the degradation of dsRNA-dependent protein kinase PKR. Virology. , (2012).
  8. Head, J. A., Kalveram, B., Ikegami, T. Functional analysis of Rift Valley fever virus NSs encoding a partial truncation. PLoS One. 7, e45730(2012).
  9. Lihoradova, O. A., et al. Characterization of Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain Encoding NSs of Punta Toro Virus or Sandfly Fever Sicilian Virus. PLoS Negl Trop Dis. 7, e2181(2013).
  10. Kalveram, B., Ikegami, T. Toscana Virus NSs Protein Promotes Degradation of Double-Stranded RNA-Dependent Protein Kinase. J. Virol. , (2013).
  11. Schmaljohn, C., Nichol, S. In Fields Virology. Knipe, D. M., et al. , Lippincott Williams and Wilkins. 1741-1789 (2007).
  12. Le May, N., et al. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
  13. Caplen, H., Peters, C. J., Bishop, D. H. Mutagen-directed attenuation of Rift Valley fever virus as a method for vaccine development. J. Gen. Virol. 66, 2271-2277 (1985).
  14. Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
  15. Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. Detection of viral RNA by fluorescence in situ hybridization (FISH). J. Vis. Exp. , e4002(2012).
  16. Reich, E., Goldberg, I. H. Actinomycin and nucleic acid function. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 3, 183-234 (1964).
  17. Holmes, K. L., Lantz, L. M., Russ, W. Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodies. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 4 (Unit 4 2), (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

EURNA
שימוש בכימיה לחץ כדי למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בסינתזת RNA Host-Cell
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.