במבחנה Coculture Assay כדי להעריך פתוגן המושרה נדידת נויטרופילים טרנס אפיתל

משטחים ריר לשמש מחסומים פיזיים ואימונולוגיים מתן הגנה מפני איומים חיצוניים מתפשטים בסביבה^1,2. מחסום אפיתל מגן זה יכול להיות בסכנה כאשר אורגניזמים פתוגניים לפלוש². במקרה של פתוגן חיידקי, מפגש זה לעתים קרובות מעורר תהליך דלקתי על ידי הפעלת המערכת החיסונית המולדת ומפעיל גיוס מהיר של גרנולוציטים המגיב הראשון המכונה נויטרופילים^2-4. סוכנים Chemotactic להקל על גיוס נויטרופילים מיוצרים בחלקם על ידי תאי אפיתל הרירית המבקשים לפטור את המארח של הפתוגן הפוגע^2-4. חדירת נויטרופילים מוגזמת או לא פתורה של משטח האפיתל הרירית עלולה לגרום לפתולוגיה משמעותית^1,5. זוהי תוצאה של נזק לרקמות לא ספציפיות שנגרם על ידי ארסנל נויטרופילים אנטי בקטריאלי^5-7. במקרים כאלה, יכולת סיווג חיידקי של נויטרופילים מאפילה על ידי הרס של רקמה מארחת במהלך עלבון זיהומיות.  שיבוש של תפקוד מחסום אפיתל מגן יכול להוביל לחשיפה משופרת של הרקמה הבסיסית מיקרואורגניזמים ו / או רעלים, עוד יותר מחריף פתולוגיה המחלה^8,9. השלכות אלה ניתן לראות במערכות איברים מרובים כולל הריאה ומערכת העיכול^1,5. יתר על כן, מחלות דלקתיות לא מדבקות כגון התקפי אסטמה חמורים, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS), ומחלות מעי דלקתיות (IBD) מסומנים על ידי הפרה פתולוגית של מחסום האפיתל הרירית על ידי תגובה נויטרופילית מוגזמת^4,5,10-12.

התהליך המורכב של גיוס נויטרופילים בעקבות זיהום רירי כרוך במספר שלבים ממודרים^1,5,13,14. ראשית, נויטרופילים חייבים לצאת מהמחזור באמצעות סדרה של אינטראקציות תא לתא המאפשרות הגירה טרנס אנדותל^1,13. נויטרופילים הבאים לנווט בחלל ביניים קיים המכיל מטריצה חוץ תאית^1,14. כדי להגיע לומן של רירית נגוע, נויטרופילים חייבים אז לנדוד על פני מחסום האפיתל^1,4,5. תופעה מורכבת זו רב צעדים נחקרת לעתים קרובות במצטבר באמצעות מודלים בעלי חיים vivo של זיהום¹⁵. מודלים כאלה שימושיים לביסוס הצורך בגורמים ספציפיים, כגון כימוקינים, מולקולות הידבקות או מסלולי איתות המשתתפים בתהליך הכולל אך אינם מתאימים במידה רבה לפתרון תרומות מולקולריות קריטיות עבור כל שלב ממודר מובהק¹⁶. Cocultured במערכות במבחנה מידול טרנס אנדותל, טרנס-מטריצה, או הגירה טרנס אפיתל של נויטרופילים היו שימושיים במיוחד בהקשר זה^1,14,16,17.

מערכת מבחני קוקולטורה חזקה פותחה לצורך פענוח מנגנונים האחראים להגירה בין אפיתל נויטרופילים בתגובה לזיהום פתוגניים^18-22. מודל זה כרוך להדביק את פני השטח apical של שכבות תא אפיתל אנושי מקוטב עם פתוגן חיידקי ואחריו יישום של נויטרופילים אנושיים מבודדים טריים על פני השטח basolateral^18-22. נויטרופילים נודדים מעבר למחסום האפיתל בתגובה למוצרים צ'ממוטקטיים שמקורם באפיתל המופרשים בעקבות זיהום פתוגניים^18,21-23. מערכת מודל זו הופעלה באמצעות תרביות אפיתל מעיים וריאות שנחשפו לפתוגנים חיידקיים ספציפיים לרקמות המתאימים וחשפה מנגנונים מולקולריים חדשניים שעשויים להיות חשובים לתהליך גיוס הנויטרופילים במהלך זיהום רירי^3,8,19,24-28. כוחו של מודל זה במבחנה coculture הוא כי גישה רדוקציוניסטית מאפשרת לחוקר לתפעל באופן ניסיוני את הפתוגן, מחסום אפיתל, ו / או נויטרופילים במערכת מבוקרת היטב, רבייה מאוד, זול למדי. תובנה שנאספה מגישה זו ניתן למנף ביעילות לבצע ניתוח ממוקד של אירועים ממודרים במהלך גיוס נויטרופילים באמצעות מודלים זיהום vivo ^22,29,30.

מאמר זה מדגים את השלבים המרובים הדרושים להקמה מוצלחת של מודל זה לשחזור כדי לחקור פתוגן המושרה הגירה טרנס אפיתל נויטרופילים. מחסומי אפיתל ריאות נגועים פתוגן Pseudomonas aeruginosa מוצגים במאמר זה; עם זאת, אפיתליה רקמות אחרות ופתוגנים ניתן להחליף עם שינויים קלים. זריעה ו culturing של שכבות תא אפיתל ריאות מקוטבות על מסנני קולגן מצופים הפוכים מחוררים מפורט בזאת, כמו גם הצמיחה של P. aeruginosa פתוגניים ובידוד של נויטרופילים מדם שלם. כיצד רכיבים אלה משולבים כדי לבחון פתוגן המושרה הגירה טרנס אפיתל נויטרופילים מוצג יחד עם פקדים חיוביים ושליליים מתאימים כדי להקים מבחנה לשחזור. הרבגוניות של גישה זו לבחון היבטים שונים של הגירה נויטרופילית הנגרמת על ידי פתוגן טרנס אפיתל נדון בהתייחסות למחקרים ספציפיים בספרות.

צעדים (1-3) צריכים להתבצע בסביבה סטרילית תחת מכסה המנוע זרימה למינארי.

1. ציפוי קולגן טרנסוולים

1. הפוך פתרון קולגן 30 מיקרוגרם / מיליליטר. לדלל 3 מ"ג / מ"ל קולגן מלאי 1:100 ב 60% אתנול שהועבר דרך יחידת מסנן 0.2 מיקרומטר.
2. מערבולת מדוללת 30 מיקרוגרם / מיליליטר פתרון. הערה: אין צורך מערבולת פתרון 3 מ"ג / מ"ל קולגן מלאי, כמו פתרון זה הוא צמיג למדי בועות אוויר עשוי להיות הציג, פוטנציאל להקטין את הדיוק בעת pipetting.
3. הסר 0.33 ס"מ² אזור צמיחה transwells עם גודל נקבוביות של 3 מיקרומטר מאריזה חיצונית ומניחים את צלחת 24-well המכיל 12 transwells במהופך בתוך מכסה המנוע.
4. מרימים את הצלחת התחתונה ומניחים בצד. הערה: Transwells יהיה עכשיו במהופך נח על גבי המכסה של צלחת 24-באר
5. תדליק את מבער בונזן. הלבה hemostat עבור סטריליות ולתת מגניב.
6. עם המוסטט סטרילי, מעבירים טרנסוולים לצלחת פטרי 150 מ"מ x 25 מ"מ, ושומרים אותם במצב הפוך. הערה: הקפד לשמור על עקרות של צלחת ריק 24-באר בתוספת מכסה לשמש לאכלס transwells פעם הם כבר זרע עם תאי אפיתל.
7. פיפטה 70 μl של תמיסת קולגן 30 מיקרוגרם / מיליליטר על קרום המסנן של כל טרנסוול הפוך. הערה: מתח פנים צריך להחזיק נפח זה של פתרון במקום כמו אין קירות סביב קרום המסנן בעת גישה לפני השטח של החלק התחתון. היזהר כי פתרון הקולגן אינו מטפטף במורד הצד של transwell ולהימנע נע transwells במהלך הליך הציפוי.
8. השאירו את המכסה של צלחת פטרי למשך 4 שעות לפחות כדי לאפשר לפתרון אתנול להתאדות. כדי לשמור על סטריליות במהלך תהליך זה, שמור על מאוורר מכסה המנוע ועל האור האולטרה סגול דולק.
9. לאחר transwells התייבש, הם יכולים לשמש מיד או מאוחסנים בטמפרטורת החדר עד שבוע בתנאי כיסוי צלחת פטרי הוא במקום עקרות נשמרת.

2. בקבוק מעבר של תאי אפיתל עבור זריעת Transwells

(פרוטוקול זה מתאר באופן ספציפי את הטיפול בקו תא אפיתל הריאות H292 ליצירת מחסומי אפיתל הגדלים על טרנסוולים. ניתן להשתמש בקווים אחרים של תאי אפיתל עם שינויים קלים.)

1. הכינו את המדיום התרבותי על ידי הוספת סרום שור עוברי (HI-FBS) עם 10% משבית חום ו-1x פניצילין/סטרפטומיצין ל-RPMI 1640.
2. מדיה חמה, טריפסין-אדטה (T-EDTA) ו- D-PBS באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
3. הסר בקבוק T-75 המכיל תאים מהאינקובטור ולהעריך מפגש חזותי עם מיקרוסקופ הפוך. הערה: בעת שימוש בתאי H292, בקבוקונים צריכים להיות קרובים או משולבים באופן מלא.
4. לשאוף מדיה מבקבוקון. לקצר את משך הזמן כי התאים יבשים על ידי בעל הפתרון הבא מכסה המנוע עם כובע משוחרר.
5. מוסיפים 5 מ"ל D-PBS לבקבוק T-75 ומערבבים. הימנע מיצירת בועות. הסר את PBS על-ידי שאיפה.
6. מוסיפים 3 מ"ל T-EDTA לבקבוק T-75 ומסתחררים כדי לכסות את החלק התחתון.
7. הסר את רוב T-EDTA, משאיר כ 0.3 מ"ל בבקבוק T-75.
8. להפיץ את הנפח הקטן שנותר של T-EDTA על פני השטח של התאים ומניחים באינקובטור לח בתנאי תרבות סטנדרטיים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂).
9. לאחר פרק זמן מסוים, הסר בקבוקון מהחממה. הערה: התאים צריכים בקלות לנתק מפני השטח של הבקבוק על ידי הקשה עדינה על הבקבוק על צידו. תאים צריכים כעת להיות מעוגל צף כאשר דמיינו תחת המיקרוסקופ. הזמן הממוצע זה ייקח עבור תאי H292 הוא 5-10 דקות.
10. הוסף 10 מ"ל מדיה תרבות בקבוק כדי לנטרל T-EDTA ו resuspend תאים. צייר את פתרון התא לקצה פיפטה ופלט אל פני השטח של בקבוק המכיל תאים כחמש פעמים כדי לשימוש חוזר בכל התאים.
11. מעבירים תאים שעברו שימוש חוזר לצינור של 15 מ"ל לזריעת טרנסוולים. הערה: הריכוז של תאי H292 בשימוש חוזר שהוכנו באופן זה צריך לנוע בין 1 x 10 בקירוב⁶-1.8 x 10⁶ תאים / מיליליטר.

3. זריעת קולגן מצופה Transwells עם תאי אפיתל

1. הוסף 70 μl של פתרון תאים בשימוש חוזר מצינור 15 מ"ל לכל טרנסוול מצופה קולגן הפוך. הערה: פתרונות תא H292 עם טווח ריכוז בין 1 x 10⁶-1.8 x 10⁶ תאים / מיליליטר תניב כ 70,000-120,000 תאים / transwell.
2. מערבבים את השעיית התא על ידי היפוך צינור בעדינות מעת לעת כדי למנוע מהתאים להתיישב לתחתית הצינור 15 מ"ל תוך זריעת transwells. הערה: אין לבצע מערבולת בתאי מערבולת ולהיות זהירים כי קצה פיפטה אינו בא במגע ישיר עם מסנן קרום מצופה קולגן.
3. לאחר כל transwells הפוך כבר זרע עם תאי אפיתל, להחליף כיסוי צלחת פטרי בזהירות מקום באינקובטור תרבית הרקמה, לחות, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂. יש להקפיד להימנע מהפרעה להשעיית התא שנוספה לקרום המסנן מצופה הקולגן.
4. לשמור על טרנסוולים הפוכים באינקובטור תרבית הרקמות, לח, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ לילה. הערה: בועת הנוזל המכילה תאים צריכה להישאר קשורה לקרום המסנן החודר של הטרנסוול לאורך כל הדגירה הלילית. אם קרום המסנן מתייבש עקב אידוי של נוזל או בגלל הנוזל מטפטף במורד הצד של transwells, שכבות אפיתל לא יכול לגדול כראוי.
5. למחרת, להוסיף 1 מיליליטר מדיה לתוך צלחת סטרילית המקורי 24-באר ולהפוך כל טרנסוול הפוך באמצעות hemostat מעוקר לתוך כל באר המכילה 1 מ"ל של מדיה.
6. הוסף 0.2 מ"ל מדיה לתוך התא העליון של כל טרנסוול ולחזור לאינקובטור תרבית רקמות, לח, 37   מעלות צלזיוס, 5% CO₂.
7. H292 טרנסוולים הפוכים ניתן להשתמש מ 8 ימים עד 1 חודש לאחר הזריעה. הערה: אנו ממליצים לחכות מינימום של 8 ימים לאחר זריעת transwells כדי להבטיח כי monolayers אפיתל נוצרו באופן מלא ולהציג מחסום פונקציונלי. אפשר לבדוק את מחסום האפיתל H292 על ידי קביעה אם המונולאייר מסוגל להגביל שטף טרנס אפיתל של צנון צנון חלבון (HRP) בעקבות תוספת למשטח הבזולטרלי¹⁸.

4. הכנת חיידקים לזיהום של שכבות אפיתל על Transwells

1. יום אחד לפני הניסוי, לחלץ מושבה אחת של P. aeruginosa PAO1 מתוך צלחת אגר בידוד Pseudomonas ומושבה אחת של K12 E. coli MC1000 מ צלחת לוריא-ברטאני (LB) אגר ומניחים לתוך צינורות נפרדים המכילים 3 מ"ל של מרק LB. התראה: P. aeruginosa הוא פתוגן אנושי, אמצעי בטיחות BSL2 סטנדרטיים יש לאמץ בעת טיפול באורגניזם זה.
2. יש לנער במשך הלילה במהירות של 225 סל"ד בסביבה של 37 מעלות צלזיוס.
3. למחרת, להסיר 1 מ"ל מתרבויות חיידקים צפופים ומניחים לתוך 1.5 מ"ל צינורות אפנדורף.
4. סובב במיקרו-פוגה במהירות של 15,800 x גרם למשך 5 דקות ולאחר מכן הסר את המיקרו-טבעי.
5. הכינו מראש את תמיסת המלח המאוזנת של הנקס עם סידן ומגנזיום (HBSS+). הוסיפו 23.8 גרם HEPES ואבקת HBSS+ 97.5 גרם למים מזוקקים ב-9.5 ליטר. הוסף כמויות קטנות של 10 M NaOH לפתרון, תוך ניטור pH עד pH יציב של 7.4 הוא הגיע. העלה את עוצמת הקול עד 10 L ואחסן ב- 4ºC.
6. התחדשו בכל גלולה חיידקית עם 1 מ"ל HBSS+. וורטקס כדי להיות בטוח השעיה חיידקית אפילו מושגת.
7. לסובב שוב ב 15,800 x g במשך 5 דקות ולהסיר supernatant.
8. התחדשו עם גלולת PAO1 עם 0.6 מ"ל HBSS+ וכדור MC1000 עם 0.5 מ"ל HBSS+. וורטקס ההשעיות החיידקיות.
9. עוד יותר לדלל את PAO1 ו MC1000 גלולות בשימוש חוזר 1:100 ב HBSS +. לדוגמה, להוסיף 50 μl של 0.6 מיליליטר PAO1 גלולה בשימוש חוזר ל 5 מיליליטר HBSS +. הערה: באמצעות מדידות צפיפות אופטית (OD) כדי לקבוע את צפיפות התרבות, כמו גם יחידת היווצרות מושבה סטנדרטית (CFU) מתודולוגיית ציפוי דילול, PAO1 ו MC1000 פתרונות מוכנים באופן זה באופן עקבי תשואה בין 3 x 10⁷-6 x 10⁷ CFU / מיליליטר. הצפיפות של תרבות חיידקית מתואמת באופן חיובי עם מדידת OD של התרבות ב 600 ננומטר מתאם זה יכול לשמש כדי להעריך את ריכוז התא החיידקי. כדי לאשר את ריכוז התאים החיידקיים, ניתן לדלל את התרבות לריכוז משוער נמוך מאוד מצופה על צלחת אגר כך שניתן היה לצפות בין 30-200 תאים חיידקיים להיות נוכחים על הצלחת. התאים מפוזרים על פני הצלחת ומדגרים בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס, כך שכל תא יוצר מושבה בודדת של תאים גדולה מספיק כדי להיות גלוי ומושבות ניתן לספור לאחר מכן.

5. בידוד נויטרופילים מדם שלם

1. תמיסת דקסטרוז ציטראט חומצה (ACD) משמש נוגד קרישה ומוכן על ידי הוספת 6.9 גרם חומצת לימון, 12.5 גרם נתרן ציטראט, ו 10 גרם דקסטרוז ל 500 מ"ל מים מזוקקים. לאחר כל הרכיבים מומסים, פתרון ACD הוא מעוקר על ידי עובר דרך יחידת מסנן 0.2 מיקרומטר. אחסן פתרון ACD ב- 4ºC.
2. לפני ציור דם, להוסיף 5 מיליליטר ACD ל 50 מ"ל מזרק ולחבר 21 x 3/4 מחט פרפר G עם 12 בצינורות.
3. יש למרוח חוסם עורקים, לנגב ורידים עם אלכוהול ולהכניס מחט. הערה: כל פרוטוקול מחקר המערב נבדקים אנושיים חייב להיות מאושר על ידי ועדת בדיקה מוסדית ויש לספק הסכמה מדעת בכתב מכל תורם דם. לדוגמה, ניסויים שנערכו באמצעות פרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה לבדיקה מוסדית של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס והקצתו פרוטוקול #1999-P-007782.
4. לאט לאט לצייר 45 מ"ל של דם להבטיח כי הדם מתערבב עם ACD פעם אחת במזרק.
5. כאשר 45 מ"ל כבר נמשך (50 מ"ל נפח כולל), להתיר את חוסם העורקים לפני הסרת המחט. מיד להפעיל לחץ על הפצע עם גזה סטרילית כאשר המחט מוסרת.
6. מעבירים דם לאט לאורך הצד של צינור 50 מ"ל על פני כ 5-10 שניות.
7. ספין בצנטריפוגה ב 1,000 x גרם עם הבלם מושבת במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: צעד נוסף הכרוך בדילול דם שלם ב- PBS- וכיסוי זהיר של דם מדולל על Ficoll-Paque לפני צנטריפוגה ניתן להעסיק כדי להשיג רמה מעט גבוהה יותר של טוהר נויטרופילים על ידי הפרדת מעיל באפי ביעילות רבה יותר מן granulocytes⁸. השמטת צעד זה משמשת כדי לחסוך זמן מבלי להשפיע באופן דרסטי על תשואה או טוהר לצורך מבחנה זו, ולכן אנו מעדיפים לא לכלול את כיסוי הדם על צעד Ficoll-Paque.
8. בזמן שהדם מסתובב, לאט מאוד מוסיפים 1 גרם ג'לטין לתמיסת מלח מאוזנת של 50 מ"ל ללא סידן ומגנזיום (HBSS)) להכנת 2% תמיסת ג'לטין. שמור על פתרון ב 37 מעלות צלזיוס.
9. לשאוף ולהשליך פלזמה מצינור 50 מ"ל של דם באמצעות קצה פיפטה זכוכית שטופלה סיגמקוטה.
10. המשך לשאוף בזהירות רבה כדי להסיר את מעיל באפי, אשר מכיל תאי דם לבנים, כולל לימפוציטים.
11. כמו מעיל באפי מוסר לאט, חומר מעונן צהוב לבנבן מעל תא הדם האדום (RBC) שכבה ייעלם. להפסיק את השאיפה פעם מעיל באפי מוסר שכבת RBC ניתן לדמיין בבירור בעת צפייה מעל הצינור.
12. נסה לא להפריע לשכבת RBC כמו גרנולוציטים, בעיקר נויטרופילים, נמצאים ליד פני השטח של שכבת RBC, אבל אינם גלויים.
13. לנפח של 15 מ"ל שכבת RBC, להוסיף 30 מ"ל חם 2% פתרון ג'לטין (נפח 2x של שכבת RBC).
14. צינור הפוך בעדינות לערבב, דואג למזער היווצרות של בועות.
15. דגירה ב 37   מעלות צלזיוס במשך 25 דקות. הערה: RBCs צריך לצבור ולהתיישב לתחתית. כחלופה ג'לטין, דקסטרנים משקל מולקולרי גדול ניתן להעסיק משקעים RBCs⁸.
16. לאחר הדגירה, להעביר את השכבה העליונה אור אדמדם פתרון המכיל granulocytes לתוך צינור חדש 50 מ"ל עם פיפטה, נזהר לא להפריע שכבת RBC כהה התיישבו במהלך ההעברה. לאחר ההפרדה, השלך שכבת RBC כהה.
17. ספין הועבר פתרון אדמדם אור המכיל גרנולוציטים וכמה RBCs בצנטריפוגה ב 1,000 x g עם הבלם מופעל במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על מנת גלולה תאים.
18. יוצקים או שואפים את supernatant בזהירות, כמו גלולה תא אדמדם שייווצר בעקבות צנטריפוגה הוא בדרך כלל רופף.
19. הכן מאגר תמוגה RBC מראש ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס על ידי הוספת 8.29 גרם אמוניום כלורי (NH₄Cl), 1 גרם סודיום ביקרבונט (NaHCO_3),ו 0.038 גרם EDTA ל 1 L מים מזוקקים בעגלה. אחסן מאגר תמוגה RBC ב- 4ºC.
20. Resuspend ולשבור גלולת תא אדמדם עם נפח קטן של מאגר תמוגה RBC קר. לאחר גלולה התא הוא בתמיסה, למלא צינור ל 50 מיליליטר עם מאגר תמוגה RBC. הערה: בשלב זה והולך קדימה, לשמור את התאים על קרח או ב 4 מעלות צלזיוס.
21. סובב בצנטריפוגה ב- 300 x g במשך 10 דקות ב-   4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן שפוך או שאף את supernatant. הערה: supernatant יהיה אדמדם במקצת המכיל RBCs lysed. גלולה צריך להיות לבן צהבהב בשלב זה. אם RBCs משמעותי להישאר גלולה כפי שצוין על ידי גלולה אדמדם, שלב 5.20-5.21 ניתן לחזור על עצמו. RBCs משמעותי להישאר גלולה התא אם גלולה אדמדם משלב 5.20 לא שבור מספיק.
22. Resuspend ולשבור גלולה לבנבן עם נפח קטן של HBSS(-) ולאחר מכן למלא צינור ל 50 מ"ל עם HBSS(-). הערה: יש להשתמש ב- HBSS(-) ולא ב- HBSS+ כדי להשתמש מחדש בכדור התא הלבן. HBSS(-) חסר סידן ומגנזיום.
23. סובב שוב בצנטריפוגה במהירות של 300 x גרם למשך 10 דקות ב-   4ºC.
24. יוצקים את supernatant ו resuspend גלולה לנפח הסופי של 1 מיליליטר HBSS(-).
25. הוסף 5 μl של השעיית תא 1 מ"ל ל 250 μl HBSS(-) בצינור 1.5 מ"ל Eppendorf ומערבבים בעדינות למעלה ולמטה על ידי פיפטה.
26. הוסף 25 μl מתלה תא מדולל ל 25 μl 0.4% כחול Trypan.
27. מוסיפים 12 μl של תערובת לכל צד של המוציטרומטר סטנדרטי.
28. לספור את מספר התאים החיים שלא כללו את הצבע הכחול Trypan והם נמצאים בריבוע האמצעי של שני הצדדים של המוציטרומטר.
29. כדי לחשב את ריכוז התא, הכפל את הממוצע של 2 הריבועים ב- 100 (גורם דילול) ולאחר מכן הכפל ב- 10⁴ כדי לתת את מספר התאים/מיליליטר.
30. התאם את הריכוז הסופי ל- 5 x 10⁷ תאים/מ"ל. אם הוא גדול מ- 5 x 10⁷ תאים/מיליליטר, התאם על-ידי הוספת HBSS(-). אם פחות, גלולה את התאים ו resuspend לנפח המתאים.
31. שמור תאים על קרח עד מוכן לבדיקת נדידה. הערה: תאים אלה מייצגים את אוכלוסיית הגרנולוציטים של תאי דם לבנים. רוב הגרנולוציטים המבודדים מדם אנושי שלם הם נויטרופילים. תאים נשמרים על קרח מושעה HBSS(-) עד לתוספת לפקודת הנדידה על מנת לשמור על תאים במצב של רגיעה.

6. הכנת שכבות תאי אפיתל לבדיקת הגירה

(שלביםאלה אינם צריכים להתבצע בתוך מכסה המנוע סטרילי.)

1. הסר מן החממה 24-צלחת תומך שכבות אפיתל כי כבר מתורבת על החלק התחתון של קרום מסנן transwell לפחות שמונה ימים.
2. לתפוס את הקצה של כל טרנסוול עם hemostat, להרים מתוך צלחת 24-באר להפוך את transwell מעל דלי פסולת להשליך מדיה תרבות מן החדר הפנימי של transwell. טובלים כל טרנסוול לתוך לשטוף המכיל HBSS + כדי למלא את התא הפנימי של transwell עם HBSS +. השלך נוזלים מהתא הפנימי לתוך דלי פסולת.
3. חזור על שלב 6.2 לכביסה שנייה ב- HBSS+. לאחר שתי שטיפות, מניחים טרנסוולים לצלחת חדשה של 24 באר המכילה 1 מ"ל HBSS+ בכל באר. הערה: יש לבצע את כל הכביסה עם HBSS+ המחומם ל-37 מעלות צלזיוס.
4. שימו לב לתא העליון של כל טרנסוול כדי להעריך את שלמות שכבת תאי האפיתל. הערה: HBSS+ לא צריך לדלוף לתוך ולמלא את התא העליון של transwell כאשר ממוקם בבאר של צלחת 24-well המכיל 1 מ"ל של HBSS +.
5. לאחר התבוננות קפדנית בכל טרנסוול, יש להוסיף 0.2 מ"ל של HBSS+ לתא העליון.
6. מניחים באינקובטור ב 37   מעלות צלזיוס, 5% CO₂ בתא לח במשך 30-60 דקות כדי להשוות שכבות תא אפיתל.

7. נויטרופילים טרנס אפיתל הגירה Assay

1. הסר מן החממה 24-צלחת היטב של transwells שטף שווה ב HBSS +.
2. אוחזים בכל טרנסוול עם המוסטט ומשליכים נוזלים למעלה היטב לתוך דלי פסולת.
3. מניחים כל טרנסוול הפוך בצלחת פטרי 150 מ"מ x 25 מ"מ.
4. לשישה של Transwells הפוכה, להוסיף 25 μl של HBSS +. לשלושה מן transwells הפוכה, להדביק עם 25 μl P. aeruginosa (PAO1) מדולל HBSS + מוכן כמתואר בשלב 4. לשלושת הטרנסוולים ההפוכים האחרונים, להדביק עם 25 μl E. coli K12 (MC1000) מדולל HBSS + מוכן כמתואר בשלב 4. זהו כ 0.8 x 10⁶-1.5 x 10⁶ CFUs / שכבת אפיתל עבור כל מין חיידקי מאז הריכוז של פתרונות חיידקיים מוכן בשלב 4 הוא כ 3 x 10⁷-6 x 10⁷ CFU / מיליליטר.
5. דגירה ב 37   מעלות צלזיוס, 5% CO₂ בתא לח במשך 60 דקות.
6. הכן fMLP כפקד חיובי עבור נדידת נויטרופילים על ידי הוספת 5 μl של 10 mM fMLP מלאי 5 מיליליטר HBSS + נותן פתרון μM 10.
7. לשטוף transwells על ידי אחיזה עם hemostat והיפוך בחזרה לתוך צלחת לשטוף 24-well המכיל 1 מיליליטר HBSS + בתאים התחתונים. הוסף 0.2 מ"ל של HBSS+ לתאים העליונים.
8. לתפוס transwell עם hemostat ולהסיר מצלחת לשטוף הראשון. לפני הנחת transwells לתוך צלחת כביסה 24 באר שנייה המכילה 1 מיליליטר HBSS +, להשליך נוזלים מן התא העליון לתוך דלי פסולת. הוסף 0.2 מ"ל של HBSS+ לתא העליון.
9. חזור על שלבים 7.8 פעם נוספת עבור סך של 3 שטיפות. הערה: כל transwells צריך להיות נתון לאותו משטר טיפול וכביסה, בין אם הם נדבקו בחיידקים או לא, כדי להבטיח כי כל transwells להיות assayed כבר מניפולציה באותו אופן. זיהום של 60 דקות עם PAO1 או MC1000 אינו מפחית את הכדאיות או משנה את תכונות המחסום של המונולאייר H292 כפי שהוערך על ידי בדיקת רעלים מבוססת לקטט דהידרוגנאז ו בדיקת שטף HRP, בהתאמה^18,22.
10. הכינו צלחת נדידה של 24 בארות על ידי הוספת 1 מ"ל HBSS+ ל-12 בארות של צלחת ה-24 באר. הערה: ניתן להכין צלחת זו מראש.
11. לאחר הכביסה השלישית, להשליך נוזל מן התאים העליונים של transwells לתוך דלי פסולת באמצעות hemostat ומניחים שלושה של transwells נגע לתוך שלוש בארות של צלחת נדידה 24-well המכיל 1 מיליליטר HBSS +, המייצג את הפקד השלילי.
12. פיפטה 10 μl של פתרון 10 מיקרומטר של fMLP לתוך כל אחת משלוש בארות של צלחת נדידה 24-באר המכיל 1 מיליליטר HBSS + (100 nM).
13. מקום שלוש של transwells לא מושפע לתוך שלוש בארות של צלחת נדידה 24-well המכיל 100 nM fMLP, אשר מייצג שליטה חיובית על היכולת של נויטרופילים מבודדים לנדוד.
14. מקום שלושה transwells נגוע PAO1 ושלושה transwells נגוע MC1000 לתוך שלוש בארות כל אחד בהתאמה של צלחת נדידה 24-באר המכיל 1 מיליליטר HBSS +. הוסף 0.1 מ"ל של HBSS+ לתא העליון של כל טרנסוול.
15. נוסף על 0.1 מיליליטר HBSS+ בכל טרנסוול, להוסיף בזהירות 20 μl של ההשעיה נויטרופילים (5 x 10⁷ תאים / מיליליטר) מוכן כמתואר בשלב 5. הערה: זה מייצג בערך 1 x 10⁶ נויטרופילים / טרנסוול.
16. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ בתא לח במשך 2 שעות כדי לאפשר הגירה טרנס אפיתל של נויטרופילים.
17. הכן עקומה סטנדרטית לקביעת מספר הנויטרופילים שהיגרו לאחר שעתיים. הוסף 40 μl של ההשעיה נויטרופילים (5 x 10⁷ תאים / מיליליטר) לתוך 2 מיליליטר של HBSS(+) ולהעביר 1 מיליליטר לתוך 1 מיליליטר HBSS(+) ולבצע דילול סדרתי 2-פי שמונה פעמים נוספות עבור סך של 10 סטנדרטים הנעים בין כ 2,000 תא / מיליליטר ל 1 x 10⁶ תאים / מיליליטר. כלול 1 מ"ל HBSS(+) עבור ריק.
18. לאחר שעתיים של נדידה, הרימו את הטרנסוולים על ידי אחיזה בהמוסטט והקישו בעדינות על הקירות הפנימיים של צלחת הנדידה של 24 בארות. השלך טרנסוולים.
19. להעריך את ההגירה של נויטרופילים בגסות בבארות על ידי צפייה בארות של צלחת נדידה 24-well תחת מיקרוסקופ הפוך באמצעות המטרה 10X (ראה איור 1 עבור תמונות של נויטרופילים נודדים בכל תנאי).
20. הוסף 50 μl של 10% טריטון X-100 לכל שימוש טוב בלוח נדידה 24-well, כל תקן, ואת הריק.
21. סובב את לוח ההעברה, הסטנדרטים והריק במהירות נמוכה למשך 20 דקות ב-   4ºC.
22. הכן מאגר ציטראט M 1 מראש. מוסיפים 52.5 גרם חומצת לימון ו-73.5 גרם נתרן ציטראט ל-400 מ"ל מים מזוקקים בכומתה. תביא את ה-pH ל-4.2. מוסיפים מים מזוקקים לתמיסה סופית של 500 מ"ל. אחסן פתרון ב- 4 מעלות צלזיוס.
23. הכן פתרון מצע ABTS טרי באותו יום. הוסיפו 3 טבליות ABTS (10 מ"ג כל אחת) ו-5 מ"ל של חיץ ציטראט 1 מ' ל-45 מ"ל מים מזוקקים. אפשר טבליות להתמוסס באופן מלא בתמיסה. ניכוי תוספת של 50 μl של 30% מי חמצן עד פתרון מצע ABTS יש צורך (ראה שלב 7.27).
24. הוסף 50 μl של מאגר ציטראט לכל שימוש טוב בלוח ההעברה 24-well, כל תקן, ואת הריק.
25. העבר 100 μl של כל מדגם היטב כפול לצלחת 96-באר. הערה: חשוב מאוד לערבב תוכן ביסודיות בכל דגימה היטב לפני המעבר לצלחת 96-well. פיפט הפתרון למעלה ולמטה לפחות חמש פעמים לפני ההעברה.
26. העבר 100 μl של כל תקן ואת הריק ללוח 96-באר לאחר ערבוב (ריק כפול).
27. הוסף 50 μl של 30% מי חמצן לפתרון ABTS ומערבולת.
28. הוסף 100 μl של פתרון מצע ABTS לכל מדגם על צלחת 96-well.
29. אפשר צלחת לפתח במשך 5-10 דקות בחושך. הערה: צבע ירוק צריך להתפתח בארות מסוימות, בקורלציה עם מספר נויטרופילים נוכחים בכל באר.
30. קרא באורך גל של 405 ננומטר באמצעות קורא microplate.
31. לחשב את מספר הנויטרופילים שהיגרו על פני שכבת האפיתל באמצעות הסטנדרטים לפיהם קיים מתאם חיובי ליניארי בין המספרים הידועים של נויטרופילים שהוכנו כתקנים לבין כמות הפעילות peroxidase כפי שנמדד על ידי צפיפות אופטית ב 405 ננומטר (ראה איורים 2 ו - 3 עבור נתונים מייצגים). הערה: שיטה זו של כימות נויטרופילים מנצלת את הכמות הגדולה של פעילות peroxidase המוצגת על ידי נויטרופילים עקב ביטוי myeloperoxidase. גישות חלופיות לכמת נויטרופילים ניתן לשקול, כגון שיטות הכוללות נויטרופילים prelabeling עם רדיואקטיביות או תרכובות פלואורסצנטיות.

מספר מחקרים הראו כי שכבות אפיתל נגועות בפתוגן להקל על נדידת נויטרופילים טרנס אפיתל3,8,19,24-28,31,32. זה קורה באמצעות אינדוקציה ספציפית לפתוגן של שיפוע נויטרופילים שמקורו בתא אפיתל3,23. לדוגמה, פתוגניים P. aeruginosa אינטראקציה עם פני השטח apical של תאי אפיתל ריאות גורם מספר משמעותי של נויטרופילים לנדוד על פני שכבת האפיתל18,22,25,26,33,34. מערכת זו מבחנים רלוונטיים קלינית ניתן לתמרן בדרכים רבות כדי לחשוף פתוגן מפתח ולארח תורמים מולקולריים כאשר יחד עם פקדים מתאימים.

נויטרופילים שנוספו לשכבות תא אפיתל מקוטבות שלא הודבקו אינן נודדות למספרים ניכרים. עם זאת, יישום של שיפוע מושך כימותרפיה על פני שכבת אפיתל לא מודבקת יניע מספר משמעותי של נויטרופילים לרוחב. חשוב לכלול הן אלה פקדים שליליים וחיוביים בהתאמה בתוך כל בדיקה בעת חקירת נדידת נויטרופילים על פני שכבות אפיתל נגוע פתוגן. הבקרה השלילית קובעת את מספר הרקע של נויטרופילים החוצים את שכבת האפיתל בהיעדר אות. מספר זה צריך להיות נמוך מאוד כאשר תאי אפיתל מתורבתים הקימו מחסום תפקודי. נדידת רקע גבוהה מסבכת את הפרשנות של תוצאות שהושגו עם אפיתל נגוע בפתוגן. השליטה החיובית כרוכה בהחלת שיפוע של כימותרפיה נויטרופילית מושכת כגון fMLP על פני שכבת האפיתל ומשמשת כדי לאשר כי נויטרופילים מבודדים הם פונקציונליים. יתר על כן, במקרה כי שכבות אפיתל מטופלים מראש עם ריאגנטים מסוימים כדי להעריך את ההשפעות שלהם על פתוגן המושרה הגירה טרנס אפיתל, שיפוע fMLP משמש כדי לשלוט על כל ההשפעות ריאגנט עשוי להיות על היכולת של נויטרופילים לנווט את שכבת האפיתל ללא קשר להשפעות בתיווך פתוגן. שליטה נוספת המועסקת לעתים קרובות בתוך מערכת מבחנים זו כרוכה בזיהום של שכבות אפיתל עם חיידקים לא פאתוגניים במקביל לפתוגן. שליטה זו יכולה להיות מנוצלת כדי להבחין בין תגובות אפיתל רלוונטיות בעקבות אינטראקציה עם חיידקים, כמו גם לסייע בזיהוי של גורמים פתוגניים הדרושים לגירוי הגירה ניוטרופילית טרנס אפיתל.

ניתן להעריך הגירה טרנס-אפיתל נויטרופילית הן מבחינה איכותית והן מבחינה כמותית. בסיום הדגירה של שעתיים לאחר תוספת של נויטרופילים למשטח הבזולטרלי, טרנסוולים מוסרים ונויטרופילים שהיגרו במלואם על פני שכבת האפיתל לתא האפיקל ניתן לראות בבאר התחתונה של צלחת הנדידה של 24 בארות. תמונה מייצגת של כל תנאי מוצגת באיור 1, בתמונה באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך. מעט מאוד נויטרופילים נצפו נודדים על פני שכבת אפיתל לא מודבקת ללא שיפוע צ'ממוטקטי שנכפה (HBSS+) ומייצגים רמות רקע במח"ש (איור 1A). לעומת זאת, ניתן היה לראות שפע של נויטרופילים טרנס-מילימטרים כאשר מסופק שיפוע fMLP(איור 1B). זיהום האפיתל עם E. coli MC1000 לאפתוגניים הביא למעט נויטרופילים שעברו נדידה גלויים לעין, ואילו נויטרופילים טרנסגנדיים רבים נצפו כאשר שכבות אפיתל נדבקו בריאה פתוגנית P. aeruginosa (PAO1) (איורים 1C ו - 1D).

הנויטרופילים שהיגרו בניסוי מכמתים על ידי מדידת פעילות המיאלופרוקסידאז שלהם. עקומה סטנדרטית מנוצלת כדי לאפשר הערכה של מספר הנויטרופילים הטרנס-מילימטרים. מספר הנויטרופילים תואם באופן חיובי את כמות הפעילות peroxidase שנמדדה בעקבות תמוגה של נויטרופילים עם ערכים המציגים קשר ליניארי בטווח מספרי הנויטרופילים שנבחרו עבור העקומה הסטנדרטית (2 x 103-1 x 106 תאים / מיליליטר) (איור 2). מספר משמעותי של נויטרופילים נודדים על פני שכבות אפיתל בתגובה לשיפוע fMLP שסופק או בתגובה לשכבת אפיתל נגוע PAO1 (איור 3). מספר הנויטרופילים הנויטרופילים הנודדים בהיעדר גירויים (HBSS+) או בעקבות זיהום אפיתל אפיתל אפיתל עם E. coli MC1000 הלא-פאתוגניים נמצא מתחת לגבול הגילוי של ה- assay (איור 3). הנתונים המוצגים באיור 3 מייצגים את המספר הממוצע של נויטרופילים טרנס-נדיפים עם קווי שגיאה המייצגים סטיית תקן של שלוש בארות / מצב עצמאיים. נתונים כמותיים המתוארים באיור 3 עולים בקנה אחד עם תמונות באר מייצגות המוצגות באיור 1.

איור 1. תמונה של נויטרופילים בעקבות הגירה טרנס-אפיתל. תמונות נצפו עם מיקרוסקופ אור הפוך בהגדלה פי 10 של הבאר התחתונה (תא apical) של צלחת נדידה 24-באר לאחר תקופת הדגירה 2 שעות עם נויטרופילים שנוספו לבאר העליונה (תא basolateral). (A)בקרה שלילית HBSS+. (B)שליטה חיובית הטילה מעבר צבע צ'מוטי fMLP. (C)שכבות תא אפיתל נגועות ב- E. coli K12 (MC1000) לא פתוגניים. (ד)שכבות תא אפיתל נגועות בפתוגניים P. aeruginosa (PAO1). לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.

איור 2. נויטרופילים בריכוז התחלתי של 1 x 106 היו נתונים לתשעה דילולים פי 2. בעקבות תמוגה, כמות הפעילות peroxidase נקבע ומספר נויטרופילים היה גרף על ציר x עם פעילות peroxidase על ציר y. המשוואה המתוארת יכולה לשמש כדי לקבוע את מספר הנויטרופילים הקיימים בכל באר לאחר גלגול בהתבסס על כמות הפעילות peroxidase נמדד בכל באר. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.

איור 3. כימות של נויטרופילים טרנסג'נדרים. מספר הנויטרופילים הטרנס-מהגרים מכומת על ידי פעילות מיאלופרוקסידאז יחסית לעקומה סטנדרטית ליניארית של מספרים ידועים של נויטרופילים. מספר ניכר של נויטרופילים שעברו נדידה נצפו בעקבות זיהום תא אפיתל עם P. aeruginosa פתוגניים (PAO1) או הקמת שיפוע apical כדי basolateral של fMLP כימותרפיה נויטרופילים. מספרים בלתי ניתנים לגילוי של נויטרופילים שעברו נדידה נצפו בעקבות זיהום בתא אפיתל עם טיפול E. coli K12 (MC1000) לא פתוגניים או מאגר בקרה שלילי בלבד (HBSS+). לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.