נדידת חיידקים טרנס-אפיתל נויטרופילים בתגובה לזיהום חיידקי ריר תורמת לפגיעה באפיתל ומחלות קליניות. פותח מודל במבחנה המשלב פתוגן, נויטרופילים אנושיים ושכבות תא אפיתל אנושיות מקוטבות הגדלות על מסנני טרנסוול כדי להקל על חקירות לקראת פענוח המנגנונים המולקולריים המתזמרים תופעה זו.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
במבחנה Coculture Assay כדי להעריך פתוגן המושרה נדידת נויטרופילים טרנס אפיתל
במאמר זה
סיכום
תקציר
משטחי ריר משמשים כמחסומי הגנה מפני אורגניזמים פתוגניים. תגובות חיסוניות מולדות מופעלות על פי פתוגן חישה המוביל לחדירת רקמות עם תאים דלקתיים נודדים, בעיקר נויטרופילים. תהליך זה יש פוטנציאל להיות הרסני לרקמות אם מוגזם או מוחזק במצב לא פתור. מודלים במבחנה Cocultured ניתן להשתמש כדי ללמוד את המנגנונים המולקולריים הייחודיים המעורבים פתוגן המושרה הגירה נויטרופילית טרנס אפיתל. סוג זה של מודל מספק רב-תכליתיות בעיצוב ניסיוני עם הזדמנות למניפולציה מבוקרת של הפתוגן, מחסום האפיתל או הנויטרופילים. זיהום פתוגניים של פני השטח האפיקליים של מונוליירים אפיתל מקוטבים הגדלים על מסנני טרנסוול חדירים מעוררים בזולטרל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית להגירה טרנס-אפיתל אפיתל של נויטרופילים המוחלים על פני השטח הבזולטרליים. מודל במבחנה המתואר בזאת מדגים את הצעדים המרובים הדרושים להדגמת נדידת נויטרופילים על פני מונולאייר אפיתל ריאות מקוטב שנדבק ב- P. aeruginosa פתוגניים (PAO1). זריעה ו culturing של מהומה חדירה עם תאי אפיתל ריאות נגזר אנושי מתואר, יחד עם בידוד של נויטרופילים מדם אנושי שלם culturing של PAO1 ו K12 E. קולי לאpathogenic (MC1000). תהליך ההגירה והניתוח הכמותי של נויטרופילים שהיגרו בהצלחה וגויסו בתגובה לזיהום פתוגניים מוצגים בנתונים מייצגים, כולל בקרות חיוביות ושליליות. ניתן לתפעל ולהחיל מערכת מודל במבחנה זו על משטחים ריר אחרים. תגובות דלקתיות המערבות חדירה נויטרופילית מוגזמת יכולות להיות הרסניות לרקמות המארחות ויכולות להתרחש בהיעדר זיהומים פתוגניים. הבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים המקדמים הגירה טרנס-אפיתל נויטרופילים באמצעות מניפולציה ניסיונית של מערכת מבחני התופת במבחנה המתוארת בזאת יש פוטנציאל משמעותי לזהות מטרות טיפוליות חדשניות למגוון מחלות זיהומיות ריריות כמו גם דלקתיות.
מבוא
משטחים ריר לשמש מחסומים פיזיים ואימונולוגיים מתן הגנה מפני איומים חיצוניים מתפשטים בסביבה1,2. מחסום אפיתל מגן זה יכול להיות בסכנה כאשר אורגניזמים פתוגניים לפלוש2. במקרה של פתוגן חיידקי, מפגש זה לעתים קרובות מעורר תהליך דלקתי על ידי הפעלת המערכת החיסונית המולדת ומפעיל גיוס מהיר של גרנולוציטים המגיב הראשון המכונה נויטרופילים2-4. סוכנים Chemotactic להקל על גיוס נויטרופילים מיוצרים בחלקם על ידי תאי אפיתל הרירית המבקשים לפטור את המארח של הפתוגן הפוגע2-4. חדירת נויטרופילים מוגזמת או לא פתורה של משטח האפיתל הרירית עלולה לגרום לפתולוגיה משמעותית1,5. זוהי תוצאה של נזק לרקמות לא ספציפיות שנגרם על ידי ארסנל נויטרופילים אנטי ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
צעדים (1-3) צריכים להתבצע בסביבה סטרילית תחת מכסה המנוע זרימה למינארי.
1. ציפוי קולגן טרנסוולים
- הפוך פתרון קולגן 30 מיקרוגרם / מיליליטר. לדלל 3 מ"ג / מ"ל קולגן מלאי 1:100 ב 60% אתנול שהועבר דרך יחידת מסנן 0.2 מיקרומטר.
- מערבולת מדוללת 30 מיקרוגרם / מיליליטר פתרון. הערה: אין צורך מערבולת פתרון 3 מ"ג / מ"ל קולגן מלאי, כמו פתרון זה הוא צמיג למדי בועות אוויר עשוי להיות הציג, פוטנציאל להקטין את הדיוק בעת pipetting.
- הסר 0.33 ס"מ2 אזור צמיחה transwells עם גודל נקבוביות של 3 מיקרומטר מאריזה חיצונית ומניחים את צלחת 24-well המכיל 12 transwells במהופך בתוך מכסה המנוע.
- מרימים את הצלחת התחתונה ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מספר מחקרים הראו כי שכבות אפיתל נגועות בפתוגן להקל על נדידת נויטרופילים טרנס אפיתל3,8,19,24-28,31,32. זה קורה באמצעות אינדוקציה ספציפית לפתוגן של שיפוע נויטרופילים שמקורו בתא אפיתל3,23. לדוגמה, פתוגניים P. aeruginosa אינטראקציה עם פני השטח apical של תאי אפיתל ריאות גורם מספר משמעותי של נויטרופילים לנדוד על פני שכבת האפיתל18,22,25,26,33,34. מערכת זו מבחנים רלוונטיים קלינית ניתן לתמרן בדרכים רבות כדי לחשוף פתוגן מפתח ולארח תורמים מולקולריים כאשר יחד עם פקדים מתאימים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
נדידת נויטרופילים על פני משטחי אפיתל ריר היא תכונה נפוצה בפתולוגיה של מחלות בעקבות זיהום עם פתוגנים חיידקיים3. המתודולוגיה המתוארת בזאת מציעה גישה מהירה וישירה לבידוד ניסיוני של אירוע דיסקרטי זה באמצעות תא אנושי הנגזר ממערכת מבחני ויטרו-קוקולטורה, המדגימה תכונה של התהליך הדלקתי המופעל על ידי זיהומים חיידקיים. מערכת זו פותחה במקור באמצעות תאי אפיתל מעיים מקוטבים נגועים בפתוגנים אנטריים כולל סלמונלה טיפימוריום, Shigella flexneri, ו E. coliפתוגניים שונים8,19,24,27,28
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה כספית על ידי NIH (1 R01 AI095338-01A1).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תאי NCl-H292 | ATCC | CRL-1848 | |
| RPMI-1640 בינוני | ATCC | 30-2001 | |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | ATCC | #47085 | |
| Escherichia coli MC1000 | ATCC | #39531 | |
| D-PBS (1x) נוזלי | Invitrogen | 14190-144 | ללא סידן ומגנזיום |
| סרום בקר עוברי מומת בחום | Invitrogen | 10082-147 | 10% הוסיף לתרבית |
| מדיום פניצילין-סטרפטומיצין | Invitrogen | 15140-122 | 100x: 10,000 יחידות פניצילין ו-10,000 ומיקרו; גרם סטרפטומיצין למ"ל. |
| טריפסין-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300-062 | 50 מ"ל מנות מאוחסנות קפואות בטמפרטורה של -20 ºC. ניתן לאחסן את Aliquot בשימוש ב-4 & C לטווח קצר. |
| תמיסת המלח המאוזנת של האנק - HBSS(-) | Invitrogen | 14175-079 | סטרילי, ללא סידן ומגנזיום |
| תמיסת טריפן כחולה | Invitrogen | 15250-061. | מלאי = 0.4% |
| קולגן, זנב עכברוש | Invitrogen | A10483-01 | ניתן גם לבודד במעבדה ישירות מזנבות של חולדות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים |
| חומצת לימון | סיגמא-אולדריץ' | C1909-500G | רכיב של 1 M מאגר ציטראט ותמיסת חומצה ציטראט דקסטרוז (ACD) |
| נתרן ציטראט | סיגמא-אולדריץ' | S4641-500G | רכיב של 1 M מאגר ציטראט |
| דקסטרוז | נטול מיםSigma-Aldrich | D8066-250G | רכיב של תמיסת חומצה ציטראט דקסטרוז (ACD) |
| אמוניום כלוריד | סיגמא-אולדריץ' | 213330-500G | רכיב של מאגר ליזה של כדוריות דם אדומות (RBC) |
| נתרן ביקרבונט | Sigma-Aldrich | S6014-500G | רכיב של מאגר ליזה של כדוריות דם אדומות (RBC) |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED-100G | רכיב של מאגר ליזה של כדוריות דם אדומות (RBC) |
| אבקת HBSS(+) | סיגמא-אולדריץ' | H1387-10L | מרכיב עיקרי של HBSS+ |
| HEPES | סיגמא-אולדריץ' | H3375-500G | רכיב של HBSS+ |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | עקוב אחר הוראות הספק לציפוי קצות פיפטה מזכוכית |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| 2,2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) מלח דיאמוניום (ABTS) | סיגמא-אולדריץ' | A9941-50TAB | מרכיב עיקרי בתמיסת מצע ABTS |
| 30% תמיסת מי חמצן | סיגמא-אולדריץ' | H1009-100ML | רכיב בתמיסת מצע ABTS |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP או fMLF) | Sigma-Aldrich | F-3506 | יש להכין תמיסת מלאי של 10 מ"מ ב-DMSO ולאחסן את הכמות ב-20 ºC. |
| ג'לטין סוג B | פישר סיינטיפיק | M-12026 | |
| Pseudomonas בידוד אגר | פישר סיינטיפיק | DF0927-17-1 | עקוב אחר היצרן הוראות להכנת צלחות PIA |
| Ficoll-Paque PLUS | פישר סיינטיפיק | 45-001-749 | אופציונלי, יכול לשפר את טוהר הנויטרופילים |
| צלחת נדידה 24 בארות | Corning Incorporated | #3524 | |
| צלחת כביסה 24 בארות | Falcon | 35-1147 | ניתן לעשות שימוש חוזר אם ספוג באתנול 70% ונשטף היטב לפני שימוש חוזר |
| בצלחת 96 בארות | Fisher Scientific | #12565501 | |
| תומכים חדירים של Transwell | Corning Incorporated | #3415 | פוליקרבונט; קוטר: 6.5 מ"מ; שטח גידול: 0.33 ס"מ2; סגנון מנה: צלחת 24 בארות; גודל נקבוביות: 3.0 ומיקרו; מ |
| צלחת פטרי | פלקון | 35-1013 | כל צלחת פטרי מכילה 24 צלחת פטרי הפוכה 0.33 ס"מ2 Transwells. |
| 500 מ"ל 0.2 μ m פילטר / בקבוק | פישר סיינטיפיק | 09-740-25A | לעיקור תמיסת חומצה ציטראט דקסטרוז (ACD) |
| 5-3/4 בזכוכית פסטר פיפטה | פישר סיינטיפיק | 13-678-20A | קצות ציפוי עם סיגמקוט לפני השימוש |
| Hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | הפוך מעוקל, |
| משונן Invertoskop | Zeiss | #342222 | |
| Versa-Max מכשירים | מולקולריים | #432789 |
מקורות
- Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung. Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).
- Hurley, B. P., McCormick, B. A. Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threat....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
