Method Article

דה-סלולריזציה של ריאות פרימטים לא אנושיים ורסלולריזציה באמצעות ביו-ריאקטור מיוחד לאיברים גדולים

DOI:

10.3791/50825

⸱

December 15th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Stem Cell Research and Regenerative Medicine, Tulane University School of Medicine, 2Division of Regenerative Medicine, Tulane National Primate Research Center, 3Department of Microbiology and Immunology, Tulane University School of Medicine, 4Department of Pharmacology, Tulane University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דה-סלולריזציה של איברים שלמים מייצרת פיגומים ביולוגיים טבעיים שעשויים לשמש לרפואה רגנרטיבית. מוצג תיאור של מודל פרימטים לא אנושי של התחדשות ריאות שבו ריאות שלמות עוברות דה-סלולריזציה ולאחר מכן נזרעות עם תאי גזע בוגרים ותאי אנדותל בביו-ריאקטור המאפשר זרימת כלי דם ואוורור מדיה נוזלית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין מספיק ריאות זמינות כדי לענות על צרכי השתלת איברים נוכחיים ועתידיים. התחדשות רקמות ביו-מלאכותיות היא אלטרנטיבה אטרקטיבית להשתלת איברים קלאסית. טכנולוגיה זו משתמשת במטריצה החוץ-תאית הביולוגית הטבעית (ECM) של האיבר כפיגום שעליו ניתן לזרוע ולתרבית תאים אוטולוגיים או תאים גזעיים/אב באופן המאפשר התחדשות של הרקמה המקורית. ה-ECM הטבעי מבודד בתהליך הנקרא דה-סלולריזציה. דה-סלולריזציה מתבצעת על ידי טיפול ברקמות עם סדרה של חומרי ניקוי, מלחים ואנזימים כדי להשיג הסרה יעילה של חומר תאי תוך השארת ה-ECM שלם. מחקרים שנערכו תוך שימוש ב-decellularization ו-recellularization לאחר מכן של ריאות מכרסמים הראו הצלחה שולית ביצירת רקמה דמוית ריאה המסוגלת להחליף גזים in vivo. בעוד שהם מציעים הוכחת היתכנות חיונית, מודלים של מכרסמים אינם ניתנים לתרגום ישיר לשימוש אנושי. פרימטים לא אנושיים (NHP) מציעים מודל מתאים יותר לחקור את השימוש בייצור איברים ביו-מלאכותיים לשימוש קליני בסופו של דבר.

מוצגים הפרוטוקולים להשגת דה-סלולריזציה מלאה של הריאות שנרכשו מקוק רזוס NHP. ניתן לזרוע את הריאות הא-תאיות המתקבלות במגוון תאים, כולל תאי גזע מזנכימליים ותאי אנדותל. כתב היד מתאר גם את התפתחותה של מערכת ביו-ריאקטור שבה ניתן לגדל ריאות מקוק זרעי תאים בתנאים של מתיחה ומתח מכניים המסופקים על ידי אוורור בלחץ שלילי כמו גם זלוף פועם דרך כלי הדם; ידוע כי כוחות אלה מכוונים התמיינות לאורך שושלות ריאתיות ואנדותל, בהתאמה. ניתנות תוצאות מייצגות של דה-סלולריזציה וזריעת תאים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביו-הנדסה של רקמות ואיברים היא תוספת אטרקטיבית לתחום הרפואה הרגנרטיבית. יצירת איברים "שגודלו במעבדה" המתאימים להשתלה בחולים כדי להחליף פונקציונליות של איברים חולים רצויה מאוד על מנת לענות על הביקוש הנוכחי והעתידי לצרכי השתלה. עקרונות הנדסת הרקמות מתרכזים סביב זריעה של סוגי תאים רצויים, או אבותיהם, לפיגום התומך בצורת הרקמה המהונדסת תוך אספקת גורמי הגדילה המתאימים ותנאי התרבית הדרושים לחיקוי תהליכי התפתחות או התחדשות. בעוד שפיגומים סינתטיים שימשו להנדסת רקמות, והמטריצה החוץ-תאית הטבעית (ECM) עשויה להיות המקור הטוב ביותר לפיגומים ספציפיים לאיברים למטרה זו. דה-סלולריזציה של איברים שלמים היא תהליך המאפשר הסרת תאים תוך השארת ההיבטים הכימיים והמבניים של ה-ECM המקורי ללא פגע.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. דה-סלולריזציה של ריאות מקוק איבר שלם

  1. הכנת פתרונות
    1. חיטוי 10-15 ליטר מים נטולי יונים (dH2O) בבקבוקים של 1-2 ליטר.
    2. הכינו "תמיסת טריטון" (0.1% טריטון X-100 ב-dH2O) על ידי ערבוב 1 מ"ל טריטון X-100 ב-999 מ"ל של dH2O תוך ערבוב על מערבל מגנטי. סנן את התמיסה דרך מכשיר סינון של 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
    3. הכן "תמיסת SDC" (2% SDC ב-dH2O) על ידי הוספה איטית של 20 גרם נתרן דאוקסיכולט (SDC) ל-~900 מ"ל dH2O תוך כדי ערבוב. לאחר המסת SDC העבירו את התמיסה לגליל מדורג והביאו את הנפח ל-1 מ"ל עם dH2O. סנן את התמיסה דרך מנגנון סינון של 0.22 מיקרומטר. יש לא....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאות המוצגות להלן מייצגות ניסויים נפרדים שבהם זרעו תאי גזע מזנכימליים מקוק רזוס עם תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח עצם מקוק רזוס או תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים שמקורם בריאה רזוס, בהתאמה, שבודדו ואופיינו כפי שתוארו קודם לכן16-18.

לאורך תהליך הדה-סלולריזציה, ריאות מקוק הראו הלבנה מתקדמת שהגיעה לשיאה במראה שקוף בסוף התהליך; עם זאת, הריאות שמרו על המאפיינים האנטומיים הגסים שלהן ונותרו אלסטיות במידה רבה ומסוגלות לייצר רתיעה טבעית לאחר ניפוח עם נוזל (איורים 3A ו-.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתן לפרק רקמות ביעילות וביעילות על ידי מספר שיטות המשתמשות בחומרים פיזיקליים, כימיים ואנזימטיים12,20. האתגרים בייצור מטריצות ביולוגיות תלת מימדיות מאיברים גדולים כוללים את הדרישה לכמויות גדולות של פתרונות דה-סלולריזציה, ציוד מסחרי יקר (כלומר ביו-ריאקטורים), וכמות מסחררת של הפרעות מתודולוגיות הנדרשות להשגת המוצר הסופי שמקורו ברקמות. השיטה שלנו מספקת גישה פשוטה הממזערת מניפולציה פיזית, נפח מגיב ועלות. דה-סלולריזציה ועיקור מלא של ריאות מקוק רזוס לוקח שלושה ימים בלבד; יתר על כן, ניתן לאחסן את הרקמות נטול.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין לנו מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות לעורכי הנדסת רקמות על שאפשרו שימוש בתמונות מפרסום קודם בדוח זה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
נתרן ניטרופרוסידסיגמא-אולדריץ'71778-25G
מלח נתרן הפריןפישרBP2425
טריטון X-100פישרBP151-100
נתרן דאוקסיכולטפישרBP349-100
נתרן כלוריפישר7647-14-5
לבלב בקר DNaseסיגמא-אולדריץ'DN25הכן מלאי, הכן והקפיא
מגנזיום גופרתיפישר10034-99-8
סידן כלוריפישרC614-500
PBS (ללא Ca/Mg)Gibco, Life Technologies10010-031
אנטיביוטיקה-אנטי-פטרייתGibco Life Technologies15240062
מדיה
Alpha MEMGibco Life Technologies12561-072
בינוני 199Gibco Life Technologies11150067
סרום בקר עוברי פרימיוםAtlanta BiologicalsS11150
L-גלוטמין 100xGibco Life Technologies25030-081
תוסף צמיחת תאי אנדותל (ECGS)ScienCell1052
אנטיביוטיקה-אנטי-פטרייתGibco Life Technologies15240062
שסתומי סימון זריעה של תאים ותרבית ביו-ריאקטור
Cole-ParmerEW-98553-20
מחברי YCole-ParmerED-30614-08
3-Way stopcocksמכשירי הרווארד 721664
MasterFlex L/S 14 צינורותCole-Parmer96420-14
MasterFlex L/S 16 צינורותקול-פארמר96420-16
זכר מנעול לואר 1/8בקול-פארמרEW-45505-04
נקבה לואר 1/8בקול-פארמרSI-45502-04
זכר לואר תקע מנעולקול-פארמרEW-45505-56
יציאות הזרקהמדי-מינון EPSIV2004
צינורות לטקססנט לואיס רפואי סופפיHN10910
מהדק צינורקול-פארמרEW-06832-02
2 ליטר צנצנת עם פה רחבפישר05-719-276
60 מ"ל מזרקיםפישרNC9035364
לתרבית תאים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
  2. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nonhuman Primate LungLung DecellularizationBioreactor SystemExtracellular MatrixStem Cell SeedingEndothelial Cell CultureMechanical StretchPulsatile PerfusionTissue EngineeringOrgan Regeneration

Related Articles