אנו מתארים שיטה להשתלה ותחזוקה של חלונות זכוכית מעל חוט השדרה החשוף של עכברים בוגרים לחקר דלקת מוח אוטואימונית ניסיונית. חלונות אלה מספקים גישה אופטית כרונית לחוט השדרה לניטור דינמיקת התאים ברמה התת-תאית בבעלי חיים חיים באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
השתלת זכוכית חוט השדרה של Windows בעכברים בוגרים עם ניסיון אוטואימוניות Encephalomyelitis
במאמר זה
סיכום
תקציר
דלקת מוח אוטואימונית ניסיונית (EAE) במכרסמים בוגרים היא המודל הניסויי הסטנדרטי לחקר מחלות דמיאלינטיות אוטונומיות כגון טרשת נפוצה. כאן אנו מציגים פרוטוקול השתלת חלונות זכוכית בעלות נמוכה וניתן לשחזור המתאים למיקרוסקופיה תוך-חיונית ולחקר הדינמיקה של ציטוארכיטקטורה של חוט השדרה ברזולוציה תת-תאית בעכברים בוגרים חיים עם EAE. בקצרה, אנו חושפים בניתוח את החוליות T12-L2 ובונים תא סביב החוליות החשופות באמצעות שילוב של ציאנואקרילט ומלט דנטלי. כריתת למינקטומיה מבוצעת מ- T13 ל- L1, ושכבה דקה של אלסטומר סיליקון שקוף מוחלת על פני השטח הגביים של חוט השדרה החשוף. כיסוי זכוכית שונה מושתל על חוט השדרה החשוף תוך הקפדה שהזכוכית לא תיגע ישירות בחוט השדרה. כדי להפחית את חדירת התאים הדלקתיים בין החלון לחוט השדרה, ניתן טיפול אנטי דלקתי כל יומיים (לפי המלצת ועדת האתיקה) במשך 10 הימים הראשונים לאחר ההשתלה. EAE מושרה רק 2-3 שבועות לאחר הפסקת הטיפול האנטי דלקתי.
באמצעות גישה זו הצלחנו לגרום ל-EAE ב-87% מבעלי החיים עם חלונות מושתלים, ובאמצעות עכברי Thy1-CFP-23 (אקסונים כחולים בחוט השדרה הגבי), כימתנו אובדן אקסונלי לאורך התקדמות EAE. יחד, פרוטוקול זה עשוי להיות שימושי לחקר הגיוס של אוכלוסיות תאים שונות כמו גם דינמיקת האינטראקציה ביניהן, ברזולוציה תת-תאית ולפרקי זמן ממושכים. שיטת הדמיה תוך-חיונית זו מייצגת כלי רב ערך לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות לטיפול במחלות אוטואימוניות כגון EAE.
מבוא
טרשת נפוצה היא מחלה אוטואימונית של מערכת העצבים המרכזית הגורמת לנזק מתקדם למיאלין ולאקסון. מודל המחקר הסטנדרטי למחלות אוטואימוניות של מערכת העצבים המרכזית הוא EAE במכרסמים בוגרים. עם זאת, האירועים התאיים הדינמיים העומדים בבסיס התקדמות EAE נותרו ברובם לא נחקרו. גישה אחת היא להשתמש במיקרוסקופיה דו-פוטונית תוך-חיונית כדי לדמיין אוכלוסיות תאיות עם סמנים פלואורסצנטיים לפרקי זמן ממושכים בחוט השדרה של עכברים בוגרים עם EAE.
מיקרוסקופיה דו-פוטונית תוך-חיונית היא דרך רבת עוצמה לחקור פיזיולוגיה תאית, אינטראקציות תאיות והתקדמות דינמית של מחלות בבעלי חיים ברזולוציה תת-תאית1. עם זאת, מכשול מרכזי לגישה הוא שהיא דורשת גישה אופטית לאזור העניין. לדוגמה, חלונות זכוכית גולגולתית הם מתודולוגיה מבוססת היטב להדמיה חוזרת ונשנית של אותם מיקרו-מבנים במוח במשך מספר שבועות2,3. עם זאת, התאמת מתודולוגיה זו להדמיית חוט השדרה אינה פשוטה והיא דורשת מספר שינויים טכניים כדי לשתק את רקמת עמוד השדרה הגבית בתוך החוליות המפורקות.
בעבר, גישה אופטית לחוט השדרה דרשה חשיפה מחדש של חוט השדרה בניתוח בתחילת כל מפגש הדמיה ותפירת העור בסוף כל מפגש4-12. ניתוחים חוזרים ונשנים אלה הם טראומטיים עבור בעל החיים, מגבילים את מספר ואורך מפגשי ההדמיה, ומגדילים את ההסתברות לחפצים הקשורים לניתוח כגון דלקת ונזק לחוט השדרה באמצעות הפרעה מכנית. כדי להתגבר על חסרונות אלה, פיתחנו לאחרונה פרוטוקול להשתלת חלונות זכוכית מעל חוט השדרה החשוף של עכברים טרנסגניים פלואורסצנטיים בוגרים עם פגיעות טראומטיות בחוט השדרה לניסויים ארוכי טווח במיקרוסקופיה דו-פוטונית in vivo ללא ניתוחים חוזרים13. כאן אנו מציגים התאמה מפורטת של פרוטוקול ההשתלה בהקשר של יישומו לחקר האירועים התאיים הדינמיים העומדים בבסיס התקדמות EAE בעכברים בוגרים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת חלון ומבנה תמיכה
- הכנת חלונות - הכינו מספר חלונות בגדלים שונים (רוחב = 1.8-2.2 מ"מ; אורך = 4.5-5.2 מ"מ) להשתלה.
- ביצוע בור המקדחה השונה לחיתוך זכוכית הכיסוי - בעזרת כמות נדיבה של מלט דנטלי חבר בור מקדחה לפיר (במקרה שלנו מהדקי בולדוג ישנים). ודא שהבור הוא ~45° ביחס לפיר לטיפול קל יותר.
הערה: סופרי יהלומים עובדים היטב גם לחיתוך זכוכית כיסוי. - הכנת שקופית A - באמצעות שקופית מיקרוסקופ רגילה, הדביקו פיסת נייר סרגל קצרה (~2 ס"מ) לתחתית השקופית כך שתוכלו לראות את הסרגל דרך הזכוכית. לאחר מכן, הניחו פיסת סרט לאורך קצה הסימון 0 מ"מ של הסרגל כדי לשמש כמתקן לזכוכית הכיסוי בשלב הבא.
- באמצעות בור המקדחה ששונה, שקופית A ושקופית מיקרוסקופ לא שונה (שקופית B), מקם חתיכת זכוכית כיסוי (עובי מס' 1.5) לסימון 0 מ"מ בשקופית A. השתמש בשקופית B כדי להחזיק את זכוכית הכיסוי במקומה וכג'יג לקו החיתוך המיועד. חותכים את זכוכית הכיסוי למלבן ארוך של כ -5X22 מ"מ. סובב את הזכוכית החתוכה ב-90° וחתוך את המלבן למלבן קטן יותר של ~2 x 5 מ"מ.
- ביצוע בור המקדחה השונה לחיתוך זכוכית הכיסוי - בעזרת כמות נדיבה של מלט דנטלי חבר בור מקדחה לפיר (במקרה שלנו מהדקי בולדוג ישנים). ודא שהבור הוא ~45° ביחס לפיר לטיפול קל יותר.
- שינויים בסיכות - יושתלו שני סיכות מותאמות כדי לתמוך ולקבע את תא החלון לחוליות (ראה סעיף 2.7-8).
- בעזרת סיכה קטנה סטנדרטית (כתר = 8 מ"מ; רגל = 4 מ"מ), כופפו את אמצע הכתר ~90° כך שקצות הרגליים כמעט נוגעים.
- כופפו את קצות הרגליים כלפי חוץ ~45° בנקודת המחצית, כך שהמחצית הדיסטלית של הרגליים תהיה מקבילה.
- כופפו את המחצית הדיסטלית של הרגליים ~30° כלפי מעלה ביחס למישור המהדק. הכניסו את הסיכות ששונו לאתנול לפני הניתוח לעיקור.
הערה: ניתן לעקר סיכות גם באמצעות תחמוצת אתילן או חיטוי.
- שינויים באטב - הכינו מהדק אחד מותאם להשתלה כחלק מהתא (ראה סעיפים 2.9-10) וישמש כמהדק אחיזה לניתוח והדמיה.
- בעזרת מהדק נייר רגיל בגודל 25 מ"מ, הסר את העיקול הקטן והשאיר צורת U מוארכת.
- בעזרת צבת או נהגי מחט, צמצם את קוטר העיקול ל ~ 2 מ"מ תוך שמירה על הקצוות מקבילים.
- כופפו את הקצוות כלפי חוץ ~90° בכ-8-10 מ"מ מהעיקול. בצע את כל ההתאמות הדרושות כדי שהוא ישכב שטוח.
2. השתלת חלון
הערה: כל ההליכים הכירורגיים והטיפול בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיית מועצת הקהילות האירופיות ואושרו על ידי הוועדה הלאומית ללימודי בעלי חיים של צרפת (אישור מס' 13,300).
- יש להרדים את העכבר (Ket/Xyl; מינון אינדוקציה: 120 מ"ג/ק"ג, 12 מ"ג/ק"ג; מינון משלים, 40 מ"ג/ק"ג, 4 מ"ג/ק"ג), למרוח משחת עיניים על העיניים.
- יש לגלח את גבו ברוחב של ~2 ס"מ על ~5 ס"מ אורך, במרכזו על גיבנת בית החזה, ולנקות את העור החשוף באמצעות סבון יוד ואחריו תמיסת יוד. נקו כפפות על ידי ריסוס עם 90% אתנול.
- בעזרת מספריים לרקמות חותכים את עור הגב לאורך מעל חוליות T11 עד L1 (~2 ס"מ). בעזרת אזמל, בצע חתכים אורכיים דו-צדדיים בין התהליכים הקוצניים והרוחביים מ-T11 ל-L1. הערה: אם כפפות או מכשירים נוגעים בפרווה או בעור של בעל החיים, נקה מחדש את הכפפות או המכשיר באמצעות סטריליזטור קר כגון אתנול 90% או Germ-X.
- תלו את העכבר במזלג עמוד השדרה סטריאוטקסי - התחילו בהידוק מזלג עמוד השדרה הימני העליון למקומו. אחוז ב-T11 באמצעות מלקחיים של אדסון ומקם את התהליך הרוחבי T11 מעל מזלג עמוד השדרה הקבוע. תוך כדי החזקת החוליה במקומה, מהדקים את מזלג עמוד השדרה הנגדי מתחת לתהליך הרוחבי הנגדי.
- באמצעות אותו הליך כמו שלב 2.4, מקם את L1 בתוך מזלג עמוד השדרה.
- בעזרת אזמל (מס '23), מגרדים בעדינות את השרירים בין התהליכים הקוצניים והרוחביים מ- T11 ל- L1 כך שהלמינה נראית בבירור. לתצוגה טובה יותר של הפדיקלים של T11, חתוך את הגיד הבולט מקצה התהליך הרוחבי.
- שטפו את הסיכות ששונו עם PBS, והכניסו את קצות הסיכות לרוחב לפדיקלים החולייתיים של T11 ו-L1 תוך התאמת המרחק בין הקצוות כך שהם נוגעים קלות בפדיקל.
הערה: השתמש רק ב-PBS המכיל דקסמתזון (0.1%), פניצילין (1,000 U/ml) וסטרפטומיצין (1 מ"ג/מ"ל), כדי להפחית דלקת לאחר ניתוח ולשפר את בהירות החלון. - הדביקו את הסיכות למקומם עם טיפה קטנה של ציאנואקרילט בכל נקודת החדרה והוציאו את העכבר ממזלגות עמוד השדרה.
- מרחו שכבה דקה של ציאנואקרילט על קצוות העור החתוכים והשרירים החשופים סביב החוליות הנקיות, והקפידו לא להדביק את החוליות. כופפו את קצות מהדק הנייר שהשתנה כך שייכנסו מתחת לחלקים הבולטים של הסיכות המושתלות וינוחו במקביל לציר הארוך של עמוד השדרה המבודד והשאירו במצב זה.
- החל מממשק העור-שריר, יש למרוח מספר שכבות של צמנט דנטלי כדי לכסות את כל הפתח למעט החוליות החשופות, ולהקפיד להשתיל את מהדק הנייר בצורה מאובטחת בתוך הצמנט הדנטלי.
- לאחר שהמלט הדנטלי נרפא (5-15 דקות), חבר את העכבר ל'מחזיק הקליפ' על ידי החלק החשוף של מהדק הנייר המושתל. בעזרת מלקחיים, הסר את השריר ורקמות רכות אחרות בין התהליכים הקוצניים והלמינה של החוליות החשופות.
הערה: כל מכשיר שיכול לתפוס היטב את החלק החשוף של מהדק הנייר מבלי לגרום ללחץ על הקליפ/תא, וניתן לתמרן אותו כדי לכוון מחדש את העכבר במהלך הניתוח יכול לשמש כ'מחזיק קליפס'. - בעזרת מקדחה להסרת עצם, יש לדלל את הלמינה של T12 ו-T13 באופן דו-צדדי. כדי להסיר את עצם הגב, אחוז בתהליך הקוצני בעזרת מלקחיים קהים והרם תוך הקפדה לא להפעיל כוח כלפי מטה לכיוון חוט השדרה. אם העצם לא נעלמת בקלות, המשך לדלל את הלמינה עד שניתן יהיה להסיר את התהליך הקוצני בקלות.
- בעזרת מקדחה להסרת עצם, המשיכו לעצב את הקצוות הצדדיים של החוליות ליצירת מבנה תומך לחלון. הסר בעדינות את כל שברי העצם הקטנים הנוגעים בדורה מאטר באמצעות מלקחיים קהים. הקפד לשמור על הלחות של הדורה מאטר באמצעות PBS.
- בחר אחד מהחלונות המוכנים שהוא מעט רחב יותר מפתח כריתת הלמינקטומיה ובדוק עד כמה הוא מונח על העצם החשופה. באופן אידיאלי, החלון יונח באופן דו-צדדי על שתי החוליות כך שאמצע החלון ייגע בדורה מאטר (איור 1a). עם זאת, החלון לא אמור לדחוס את חוט השדרה גם כאשר דוחפים את החלון לכיוון חוט השדרה. אם החלון אינו מאוזן או מונח מעל הדורה, חזור על שלב 2.13.
- לאחר שסיפקת את כריתת הלמינקטומיה, הנח חתיכה קטנה של נייר טישו על חוט השדרה כדי למנוע ייבוש של הדורה והניח את העכבר בצד.
- ניקוי החלון - הניחו את החלון בתמיסה של מנקה חלונות למשך מספר שניות. בעזרת חתיכת רקמת עדשת מיקרוסקופ, נגב את החלון יבש. בעזרת המיקרוסקופ הכירורגי ודא שהחלון נקי, וחזור על תהליך הניקוי אם לא. הנח את החלון באזור נקי עם גישה נוחה לשליפה מהירה ומיקום החלון בשלב 2.19.
- אחזר את העכבר והסר את נייר הטישו. הסר בעדינות כל פסולת מהדורה באמצעות מלקחיים קהים והניח לדורה להתייבש עד שהיא דביקה מעט.
- מלאו במהירות את צינור המיקסר מסיליקון (Kwik-sil) והוציאו סיליקון על שקופית נקייה עד שלא יוצאות בועות מהקצה. יש לתת מיד חרוז סיליקון קטן לאורך קו האמצע של חוט השדרה החשוף.
- אחזר את החלונות הנקיים באמצעות מלקחיים קהים והניח מיד מעל הסיליקון. בעזרת המלקחיים הבוטים, הפעל כמות קטנה של לחץ על החלון כדי לפזר את הסיליקון לשולי החלון והחזק במקומו למשך ~1 דקה.
הערה: לפני הערבוב, יש לאחסן סיליקון מתחת ל-27 מעלות צלזיוס אחרת זמן הריפוי יכול לגדול משמעותית והוא לא יידבק לחלון או לדורה מאטר מה שיוביל לבהירות אופטית מופחתת. - שחרר לאט לחץ מהחלון. אם החלון לא זז, המשך מיד לשלב 2.21. אם, לעומת זאת, החלון עולה כאשר הלחץ משתחרר (כלומר החוליות זזות), המשך לשלב 2.21 תוך שמירה על לחץ על החלון כדי להחזיק אותו במקומו.
- החל ציאנואקרילט רוסטרל וזנב של החלון. אם הציאנואקרילט אינו מכסה את הקצוות הרוסטרליים והזנביים של החלון, השתמש בקיסם כדי להנחות חלק מהציאנואקרילט הנוזלי על קצוות אלה. לאחר מכן, הנחו את הדבק לאורך הקצוות הצדדיים של החלון (איור 1a) כדי לכסות את כל השרירים שמסביב. הערה: הציאנואקרילט צריך לכסות את פני הקצוות החיצוניים של החלון. יותר מדי ציאנואקרילט יכול לפגוע בבהירות האופטית, לא מספיק ציאנואקרילט יגרום לבועות אוויר בין הסיליקון לחלון.
- כדי להגן על הציאנואקרילט ולהגביר את השלמות המבנית של החדר, מרחו מלט דנטלי על כל האזורים המכוסים בציאנואקרילט (איור 1a). בדומה לציאנואקרילט, התחל בקצוות הרוסטרליים והזנביים והשתמש במקל עץ קטן כדי להנחות את המלט הדנטלי לאורך שולי החלון.
3. טיפול לאחר ניתוח, אינדוקציה של EAE ותחזוקת חלונות
- יש להזריק דקסמתזון (0.2 מ"ג/ק"ג) ורימדיל (5 מ"ג/ק"ג) על אזורי האגן. העבירו את העכבר לכלוב חם (~26 מעלות צלזיוס) עם חומר קינון. עכברים צריכים להיות ניידים לחלוטין, לחקור את הכלוב שלהם, ולטפח לאחר שהשפעות ההרדמה שככו לחלוטין (בדרך כלל 2-3 שעות). יש לשכן בעלי חיים בנפרד ולוודא שיש להם גישה נוחה למזון ומים במשך 1-2 הימים הראשונים. לאחר שהעכבר מתחיל להתאושש מההרדמה, יש להזריק בופרנורפין (0.05 מ"ג/ק"ג) s.q. לאחר החלמה מלאה מההרדמה, העכבר לא אמור להראות סימני כאב. הערה: לאחר התאוששות מלאה מההרדמה, כל סימן של כאב או פעילות מוטורית חריגה מעיד על כך שהחלון לא הושתל כהלכה.
- יש להזריק דקסמתזון (0.2 מ"ג/ק"ג) ורימדיל (5 מ"ג/ק"ג) כל 2 ימים במשך 10 הימים הראשונים לאחר הניתוח (איור 1a). כדי להזריק לעכברים חלונות, יש להרגיע קלות את החיה עם איזופלורן בתא אינדוקציה (~1.75% איזופלורן באוויר למשך 1-2 דקות). הוצא את העכבר מהתא והזריק מיד את התרופות. העכבר אמור להיות ער לחלוטין תוך <1 דקה.< > הערה: אין לקשקש עכברים עם חלונות מושתלים מכיוון שהדבר עלול לגרום להפרדת העור מהשתל. ניתן להזריק לעכברים ip ללא טשטוש על ידי מתן אפשרות לתפוס מכסה כלוב עם כפות רגליהם הקדמיות ולהרים בעדינות את הגפיים האחוריות. עם זאת, במצב זה העכבר לפעמים יתרחק ויגרום ללחץ על החלון המושתל. זה יכול להוביל לדימום בין החלון לחוט השדרה, ובכך לפגוע בבהירות האופטית.
- ניתן לגרום ל-EAE 2-3 שבועות לאחר הפסקת הטיפול האנטי דלקתי (~3-4 שבועות לאחר הניתוח). הרגע קלות את העכבר כמתואר בשלב 3.2. הסר את העכבר מתא האינדוקציה ושמור על ההרגעה עם מסכת איזופלורן המונחת על האף.
- להזריק פפטיד MOG35-55 (75 מיקרוגרם באדג'ובנט של פרוינד המכיל 800 מיקרוגרם של מיקובקטריום טוברקולוזיס) ל-3 מיקומי s.q. שונים (דו-צדדית מעל עצם הירך, ובבסיס הזנב), ורעלן שעלת (400 ננוגרם) i.p.14,15
הערה: עכברים עם EAE זקוקים לטיפול משלים בהשוואה לעכברים עם חלונות בלבד. שקלו עכברי EAE מדי יום וודאו שיש להם גישה נוחה למזון ומים בכל עת. תוסף תזונה עם ג'לי אגרוז 3% המכיל לשמירה על הידרציה ומשקל בעלי חיים. ניתן להוסיף גלוקוז (1-3%) לג'לי לקבלת קלוריות נוספות. - יומיים לאחר השראת EAE, חזור על פרוטוקול ההרגעה המתואר בשלב 3.2 והזריק מנה שנייה של רעלן שעלת (400 ננוגרם) i.p.
- כדי לדמות את חוט השדרה, תחילה יש להרגיע את בעל החיים כמתואר בשלב 3.2, ולהרדים קלות עם קטמין/קסילזין (100 מ"ג/ק"ג; 10 מ"ג/ק"ג) i.p. זה יספק ~ שעה אחת של הדמיה.
- עבור מפגשי הדמיה הנמשכים <שעתיים, ניתן לשמור על הרדמה קלה עם זריקות משלימות של קטמין/קסילזין (50 מ"ג/ק"ג; 5 מ"ג/ק"ג) כל 45-60 דקות. לחלופין, עבור מפגשי הדמיה ארוכים יותר, ניתן להרדים עכברים באופן רציף עם איזופלורן (0.75-1.25% איזופלורן באוויר לח).
הערה: ניתן לנקות חלונות במיקרוסקופ כירורגי על ידי ניגוב עדין של פסולת עם פינת טישו או ספוגית עם קצה כותנה. אל תשתמש באלכוהול לניקוי החלון מכיוון שהוא יכול לפגוע בסוגים מסוימים של מלט דנטלי וזה יכול לקרר את חוט השדרה. - לאחר הרדמה קלה, העכבר מחובר בחוזקה למחזיק מהדק על ידי החלק החשוף של מהדק הנייר המושתל (איור 1b).
- חוט השדרה מיושר בניצב לעדשת האובייקט על ידי התאמת מיקום הקליפ בתוך המחזיק, התאמת מיקום המחזיק והתאמת מיקום הבמה. המשטח הגבי של חוט השדרה מצולם במהירות, וכלי הדם הגביים משמשים לקביעת כיוון חוט השדרה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שימוש בחלונות זכוכית המושתלים באופן כרוני בשילוב עם מיקרוסקופיה דו-פוטונית תוך-חיה ומודלים של EAE עשוי להיות כלי שימושי להבנת המנגנונים התאיים העומדים בבסיס הפתולוגיה של מחלות דמיאלינציה אוטואימוניות. באמצעות שיטת ההשתלה שלנו, מצאנו שרוב החלונות היו שקופים בזמן השראת ה-EAE, ונשארו שקופים לאורך התקדמות ה-EAE (איור 1c). בגישה זו, מצאנו כי החלונות נשארים שקופים לאורך כל תקופת הפוסט-השתלה (ממוצע של ~68 d±7 s.e.m.; n = 21 עכברים), וניתן היה לבצע הדמיה דו-פוטונית באופן חוזר לפני או אחרי השראת EAE עד 12 פעמים ב...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תיארנו שיטה להשתלה ותחזוקה של חלונות זכוכית מעל חוט השדרה החשוף של עכברים בוגרים כדי לחקור את ההתקדמות הדינמית של EAE לאורך זמן. גישה דומה להשתלת חלונות זכוכית שימשה לחקר מודלים של פגיעות בחוט השדרה13 ועשויה להיות שימושית גם לחקר פתולוגיות אחרות של חוט השדרה כגון גליובלסטומות, דלקת קרום המוח או הפיזיולוגיה התאית של חוט השדרה הרגיל. עבור השיטה שלנו, ייצוב החוליות הושג על ידי בניית שלד חיצוני סביב ארבע חוליות קבועות היטב בזמן שחלון הזכוכית היה מעוגן לשלד החיצוני הזה. בניסויים אלה הושתלו חלונות ברמות החוליות T13-...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
אנו מודים ל-C. Ricard, M-C. Amoureux, A. Jaouen ו- S. Meijia-Gervacio על דיונים מועילים; M. Hocine ו-C. Meunier, וצוות מתקני ההדמיה של בעלי חיים ו-PicSIL של IBDML לתמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מוסדי מהמרכז הלאומי למחקר מדעי, ועל ידי מענקים מהאגודה למחקר של המדע המדעי (ARSEP) (ל-G.R. ו-K.K.F), הסוכנות הלאומית למחקר (ANR JCJC), הפדרציה למחקר על סרבו (FRC) Institut de Recherche sur la Moelle Epinière (IRME) (ל-FD). ק.ק.פ. נתמך על ידי מלגת ARSEP. ההדמיה בוצעה במתקן ההדמיה PIcSIL של IBDML.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מקדחה להסרת עצם | World Precision Instruments | IDEAL MICRO-DRILL | נמכר גם על ידי Harvard Apparatus. כל מקדחת עצם כירורגית באיכות גבוהה תספיק. |
| בור מקדחה (#1/4 או 1/2 קוצים עגולים קרביד) | World Precision Instruments | 501860 (#1/4) 501860 (#1/2) | נמכר גם על ידי Harvard Apparatus |
| Staples | Lyreco | 5.002.567 | כתר = 8 מ"מ רגל = 4 מ"מ |
| מהדק | כל מהדק נייר סטנדרטי 25 מ"מ | ||
| נהגי מחט | Fine Science | Tools 12003-15 | |
| מספריים | לרקמותכלי מדע עדינים | 14028-10 | |
| מלקחיים של אדסון | כלי מדע עדינים | 11027-12 | 1 x 2 שיניים |
| מלקחיים קהים | כלי מדע עדינים | 11293-00 | |
| מזלגות עמוד השדרה | מכשירי הרווארד 724813 | ||
| מלט שיניים | GACD | 12-565 & 12-568 | |
| דיוק | אלסטומר סיליקון | KWIK-SIL | זמין גם באמצעות Coherent Scientific ו-Fisher Scientific |
| Cyanoacrylate | Eleco-EFD | Cyanolit 201 | |
| מיקרוסקופ | Zeiss | 7MP | המיקרוסקופ שלנו נמצא בתצורה זקופה ומצויד ב-5 גלאי NDD. |
| עדשת אובייקט | Zeiss | W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC M27 75 מ"מ | מרחק עבודה = 1.8 מ"מ |
מקורות
- Kim, J. V., Dustin, M. L. Innate response to focal necrotic injury inside the blood-brain barrier. J. Immunol. 177 (8), 5269-5277 (2006).
- Xu, H. -T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. -B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nat. Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).
- Holtmaat, A., Bonhoeffer, T., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (23), 9459-9464 (2009).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal. 11 (5), 572-577 (2005).
- Ylera, B., Ertürk, A., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Curr. Biol. 19 (11), 930-936 (2009).
- Dibaj, P., Nadrigny, F., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).
- Dibaj, P., Steffens, H., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PloS One. 6 (3), (2011).
- Johannssen, H. C., Helmchen, F. In vivo Ca2+ imaging of dorsal horn neuronal populations in mouse spinal cord. J. Physiol. 588 (18), 3397-3402 (2010).
- Nikić, I., Merkler, D., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis). Nat. Med. 17 (4), 495-499 (2011).
- Di Maio, A., Skuba, A., et al. In vivo imaging of dorsal root regeneration: rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border. J. Neurosci. 31 (12), 4569-4582 (2011).
- Laffray, S., Pagès, S., Dufour, H., De Koninck, P., De Koninck, Y., Côté, D. Adaptive movement compensation for in vivo imaging of fast cellular dynamics within a moving tissue. PloS One. 6 (5), (2011).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. J. Physiol. 590 (16), 3665-3675 (2012).
- Kuerten, S., Angelov, D. N. Comparing the CNS morphology and immunobiology of different EAE models in C57BL/6 mice - a step towards understanding the complexity of multiple sclerosis). Ann. Anat. 190 (1), 1-15 (2008).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. Eur. J. Immunol. 25 (7), 1951-1959 (1995).
- Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted. Nat. Methods. , (2012).
- Moreno, B., Jukes, J. -P., et al. Systemic inflammation induces axon injury during brain inflammation. Ann. Neurol. 70 (6), 932-942 (2011).
- Lassmann, H., van Horssen, J. The molecular basis of neurodegeneration in multiple sclerosis. FEBS Lett. 585 (23), 3715-3723 (2011).
- Yenari, M. A., Han, H. S. Neuroprotective mechanisms of hypothermia in brain ischaemia. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 267-278 (2012).
- Kalmbach, A. S., Waters, J. Brain surface temperature under a craniotomy. J. Neurophysiol. 108 (11), 3138-3146 (2012).
- Pérez-Nievas, B. G., García-Bueno, B., Madrigal, J. L. M., Leza, J. C. Chronic immobilisation stress ameliorates clinical score and neuroinflammation in a MOG-induced EAE in Dark Agouti rats: mechanisms implicated. J. Neuroinflammation. 7, 60 (2010).
- Bjartmar, C., Kidd, G., Mörk, S., Rudick, R., Trapp, B. D. Neurological disability correlates with spinal cord axonal loss and reduced N-acetyl aspartate in chronic multiple sclerosis patients. Ann. Neurol. 48 (6), 893-901 (2000).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
