Microinjection מתא בודד לניתוח תקשורת נייד

סיכום

אנו מתארים כאן כיצד לבצע microinjection מתחיל מתא בודד הצהוב לוציפר לדמיין תקשורת סלולרית באמצעות-צומת פער בתאים חיים, ולספק כמה עצות שימושיות. אנו מצפים כי מסמך זה יעזור לכולם להעריך את מידת צימוד הסלולר בשל צומת פער פונקציונליים. הכל המתואר כאן יכול להיות, באופן עקרוני, מותאמי צבעי ניאון אחרים עם משקל מולקולרי להלן 1,000 Daltons.

תקציר

צמתים של פער הם ערוצים בין-תאיים המאפשרים תקשורת של תאים שכנים. תקשורת זו תלויה בתרומה של חצי ערוץ על ידי כל תא שכן ליצירת צומת הפער. בתאי יונקים, תעלת החצי נוצרת על ידי שישה קונקסינים, מונומרים עם ארבעה תחומים טרנסממברניים ומסוף C ו- N בתוך הציטופלזמה. צמתים מרווחים מאפשרים החלפת יונים, שליחים שניים ומטבוליטים קטנים. בנוסף, יש להם תפקידים חשובים בצורות רבות של תקשורת תאית בתהליכים פיזיולוגיים כגון העברה סינפטית, התכווצות לב, צמיחת תאים והתמיינות. אנו מפרטים כיצד לבצע מיקרו-הזרקה של תא בודד של לוציפר צהוב כדי לדמיין תקשורת תאית באמצעות צמתים מרווחים בתאים חיים. צפוי כי בצמתים של פערים פונקציונליים, הצבע יתפזר מהתא הטעון לתאים המחוברים. זוהי טכניקה שימושית מאוד לחקר צמתים מרווחים מכיוון שאתה יכול להעריך את דיפוזיה של הקרינה בזמן אמת. אנו דנים כיצד להכין את התאים ואת המיקרופיפטה, כיצד להשתמש במיקרומניפולטור ולהזריק צבע פלואורסצנטי בעל משקל מולקולרי נמוך בקו תאי אפיתל.

מבוא

צמתים הפער הם ערוצי אינטר המאפשרים אינטרקום בין תאים שכנים ^1. תקשורת זו המחברת בין שני תאים או יותר השכנות, שבהן כל אחד תורם עם connexon או hemichannel כדי ליצור את ערוץ אינטר. בתאי יונקים, את connexon נוצר על ידי שישה connexins, מונומרים עם ארבעה תחומים הטרנסממברני ו- C ו- N מסוף בתוך הציטופלסמה ^2. צמתים הפער לא רק לאפשר מעבר של יונים, שליחים משניים מטבוליטים קטנים, אלא גם לתרום הרבה צורות של תקשורת סלולרית בתהליכים פיזיולוגיים רבים, כגון העברה סינפטית, התכווצות הלב, צמיחת תאים ו ^{-3 בידול, 4, ....}

פרוטוקול

1. הכנת תאים

1. יש לשמור על תרבות של קו תא אפיתל הרתי (IT76M1) או תא להיבדק באינקובטור (37 ° C / 5% CO _2).
2. שוטפים את התאים עם PBS 1x (לחזור פריט זה 3x).
3. להוסיף טריפסין על התאים למשך 5 דקות.
4. הוסף בינוני (פעמים מהיקף טריפסין הוסיף בסעיף 1.3) עם 10% FBS (בסרום שור עוברי) אל התאים עם טריפסין ו צנטריפוגות (800 XG במשך 5 דקות).
5. ספירת ....

תוצאות

תא אפיתל הרתי קו IT-76MI שמש להעריך צימוד לצבוע ידי צומת פער כמו תאים אלה תוארו להביע צומת פער פונקציונליים נוצרו על ידי connexin 43 ^21. איור 1 מציג את הזריקה של לוציפר צהוב כשהם מיושמים בתא אחד מתחת קצה פיפטה. לאחר כמה דקות, תאים המחוברים להיות ניאון (כוכביות) המציין את הדיפוזיה של צבע פלואורסצנטי דרך צמתים הפער. מספר התאים והזמן הפך פלורסנט מזוהה ישירות עם מידת תקשורת סלולרית בין תאים אלה. איור 2 מציג את ה.......

דיון

כדי לאמת את הנוכחות של צומת הפער בין תאית פונקציונלי, להשתמש באמצעים, אשר קרום חדיר, למרות חדיר ידי ערוצי אינטר נדרשים ^16. והעמסה, צבע פלואורסצנטי הראשון להבחין תא אל תא צימוד ^22, הוא חדיר בין ממברנות הלא junctional ³ ו הוחלפה ולכן על ידי צבע צהוב לוציפר ^15. בשלב זה, כדי למצוא את הבחירה הטובה ביותר בין הסוגים השונים של קליעים נותבים ניאון תלוי בהיקף ותנאי הניסוי. ההליך של טעינת תא עם צב.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
לוציפר צהוב	Sigma	L0259
ליתיום כלוריד	Sigma	L4408
PBS טבליות	סיגמא	P4417
RPMI	Sigma	R4130
סרום עוברי בקר	Cultilab
Trypsin	Sigma	T4799
שולחן מבודד רעידות	ניופורט	VH3036W-OPT	יש צורך בשולחן מבודד רטט כדי להגן על הניסויים מפני רעידות ולמנוע נזק לתאים
מיקרומניפולטור	Narishige	MMO-203	ציוד זה מאפשר התאמות מדויקות של המיקרופיפטה, הדרושה להזרקת מיקרו תאים.
מחולל נוכחי	Digitimer	DS2	כדי לייצר את זרימת הצבע דרך המיקרופיפטה, ניתן זרם מתחת לננו אמפר אחד באמצעות מחולל זרם עם אלקטרודה בתוך המיקרופיפטה או מגבר בעל מעגל פיצוי קיבול (אלקטרומטר ישן) או פונקציות הזרקת זרם של מגברי מהדק תיקון חדשים, וחוט ההארקה שקוע בצלחת הצלחת. לחלופין, ניתן להזריק את הצבע על ידי מיקרו-מזרק פנאומטי, בהתאם להמלצות המפעל.