הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח דינמיקת חלבון באמצעות מימן Exchange ספקטרומטריית מסה

18K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50839

⸱

29 בנובמבר 2013

 , 
1Zentrum für Molekulare Biologie der Universität Heidelberg (ZMBH), University of Heidelberg

במאמר זה

סיכום

קונפורמציה בחלבון ודינמיקה הן מפתח להבנת הקשר בין מבנה חלבון ותפקודו. חילופי מימן יחד עם ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה הוא שיטה תכליתית כדי ללמוד את הדינמיקה קונפורמציה של חלבונים כמו גם באפיון אינטראקציות החלבון ליגנד וחלבונים, כוללים ממשקי מגע ואפקטי allosteric.

תקציר

כל התהליכים התאיים תלויים בתפקוד של חלבונים. אמנם את הפונקציונליות של חלבון נתון היא התוצאה הישירה של רצף חומצות אמינו הייחודי שלה, היא הבינה שרק על ידי הקיפול של שרשרת פוליפפטיד להסדר יחיד מוגדר תלת ממדים או יותר נפוץ להרכב של תצורות interconverting. חוקר את הקשר בין קונפורמציה בחלבון ותפקודו ולכן הוא חיוני להבנה של איך חלבונים מסוגלים למלא המגוון רחב של משימות שלהם הושלמה. אפשרות אחת ללמוד שינויי קונפורמציה חלבון עובר תוך כדי התקדמות דרך מחזור הפעילות שלה היא מימן-H 1/2 H-Exchange בשילוב עם ספקטרומטריית רזולוציה גבוהה מסה (HX-MS). HX-MS היא שיטה תכליתית וחזקה, שמוסיפה ממד חדש למידע מבני שהושג על ידי למשל קריסטלוגרפיה. הוא משמש כדי ללמוד קיפול חלבונים והתגלגלות, כריכה של mol הקטןligands ecule, אינטראקציות בין חלבונים, שינויי קונפורמציה קשורות לאנזים קטליזה, וallostery. בנוסף, HX-MS משמש לעתים קרובות כאשר כמות החלבון היא מאוד מוגבלת או התגבשות של החלבון היא לא ריאלי. כאן אנו מספקים פרוטוקול כללי ללימוד דינמיקת חלבון עם HX-MS ולתאר כדוגמא כיצד לחשוף את ממשק האינטראקציה של שני חלבונים במתחם.

מבוא

מספר המבנים גבישיים של חלבונים וקומפלקסי חלבונים גדל בקצב מהיר בשנים האחרונות. הם מציגים תמונות לא יסולא בפז של הארגון המבני של חלבונים אלה ולספק בסיס לניתוח תפקוד המבנה. עם זאת, הדינמיקה של חלבונים ושינויי קונפורמציה, שהם חיוניים לתפקודם, מתגלה לעתים רחוקות על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרן רנטגן. Cryo-electronmicroscopy, לעומת זאת, הוא מסוגל ללכוד מתחמי חלבון וחלבון בתצורות שונות, אך בדרך כלל לא יכול לפתור את שינויי קונפורמציה לרמת מבנה משני 1. דינמיקה קונפורמציה של חלבונים בתמיסה בפרטים אטומיים יכולה להיפתר רק על ידי תמ"ג, אך בשיטה זו היא עדיין מוגבלת לחלבונים בגדלים קטנים יחסית (בדרך כלל ≤ 30 KDA) וזקוק לריכוז גבוה של חלבונים (≥ 100 מיקרומטר), דבר המקשה ניסויים עם חלבונים נוטים oligomerization או צבירה 2. שיטה אחת שהוא מסוגל לגשר בין קריסטלוגרפיה ברזולוציה הגבוהה של קרני רנטגן, cryo-electronmicroscopy ושאינו מוגבל על ידי גודל חלבון או ריכוז הוא מימן-1 אמיד H / 2 H-חליפין (HX) בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (MS). בשנים האחרונות שיטה זו התפתחה לכלי אנליטי חשוב לניתוח דינמיקת חלבון, קיפול חלבון, חלבון יציבות ושינויי קונפורמציה 3-5. הבסיס המולקולרי של שיטה זו הוא באופי יציב של עמוד השדרה מימנים אמיד בחלבונים, שיחליפו עם אטומי דאוטריום כאשר החלבון ממוקם בD 2 O פתרון. העלייה שלאחר מכן במסת חלבון לאורך הזמן נמדדת עם רזולוציה גבוהה טרשת נפוצה.

בפפטידים בלתי מובנים קצרים HX רק תלוי בטמפרטורה, ריכוז זרז (OH -, H 3 O + כלומר pH, ראה איור 3) ורשתות צד חומצת אמינו של שיירים סמוכים בשל אינדוקטיביים, חתולהשפעות alytic וסטריות. השפעות אלה על ch k שער חליפין כימיים הפנימי היו לכמת באלגנטיות על ידי באי et al. 6 ותכנית זמינה (באדיבות ז''אנג), המחשבת ch k לכל חומצת אמינו בתוך פוליפפטיד התלוי בpH וטמפרטורה. ב-pH הניטרלי וטמפרטורות הסביבה ch k הוא בסדר הגודל של 10 1 -10 3 שניות -1. בחלבונים מקופלים HX יכול להיות 2-9 סדר גודל איטי בעיקר בשל קשרי מימן במבנה משני ובמידה קלה בשל גישה מוגבלת של התייבשות OH - יונים לפנים של חלבון מקופל ומהודק. HX בחלבוני ילידים לכן מסבך, החלפה חלקית או גלובלי התגלגלות כימית וקפל שוב למצב הטבעי על פי משוואה (1) ושעיר חליפין שנצפו k תצפיות תלויות באופ k שיעור פתיחה, CL k שער סגירה ואת חילופי הכימיים הפנימיים rate k ch על פי משוואה (2).

figure-introduction-1
בתנאי מדינה האם של אופ k הוא הרבה יותר קטן מאשר ch k ויכול להיות מוזנח במכנה. ישנם שני משטרי חילופי קיצוניים בשם EX1 וEX2. אם CL k הוא הרבה יותר קטן מאשר ch k (EX1) השיעור שנצפה הוא כמעט שווה לשיעור הפתיחה וHX מאפשר תצפית מיידית של התגלגלות של אלמנט מבני. כגון משטר חליפין, שבו כל תמורת הפרוטונים אמיד מייד עם פתיחתו של היסוד המבני, היא לצפות בקלות בטרשת הנפוצה על ידי הפצת bimodal של פסגות איזוטופ 7. אם CL k הוא הרבה יותר גדול מch k (EX2) השיעור שנצפה הוא יחסי ch k לפיה המתמיד המידתיות שווה לאיזוני התגלגלות קיפולי אופ K u = k הקבוע CL. בתנאים אלה, אירועי פתיחה וסגירה רבים הם הכרחיים לפני כל החלפת הפרוטונים אמיד לdeuterons, מה שמובילים לעלייה הדרגתית במסה ממוצעת בעת החלוקה איזוטופי נשארה בערך אותו הדבר. משטר EX2 מאפשר קביעת האנרגיה החופשית של התגלגלות ΔG u ולכן היציבות של אלמנט מבני. בתנאי מדינה האם של משטר EX2 הוא נפוץ ביותר. עלייה של pH ובנוסף סוכני chaotropic יכולה להזיז את מנגנון החליפין לEX1. לכן, HX-MS יכול לשמש כדי לחקור התרמודינמית וכן פרמטרים הקינטית של קיפול חלבונים ושינויי קונפורמציה.

כפי שצוין לעיל HX הוא במהותו pH וטמפרטורה תלויה ואת חילופי זמן מחצית החיים של פרוטון נחשף ממס לחלוטין מהקבוצה אמיד עמוד השדרה הוא בין 5-400 אלפיות שני ב-pH הפיזיולוגי (pH 7.6) ו30 מעלות צלזיוס, אבל 10 דקות ל> שעות 15 עם ממוצע של> שעה 2 ב-pH 2.9 ו0 °C (פרט לפרוטון של הקשר אמיד עמוד השדרה הראשון של פוליפפטיד, שמחליף עם זמן מחצית חיים של CA. 1-2 דק '). תחת תנאים כאלה איטיים החלפה אפשר לעכל את המדגם באמצעות פרוטאזות (למשל פפסין) הפועלים בתנאים אלה, עם יציאה החוצה לאבד את כל המידע הכלול בdeuterons המשולב. מאז כניסתה של מערכת העיכול פפטי בתנאי החלפה איטיים, ניתן לנתח לא רק את קינטיקה HX הכוללת של חלבונים באורך מלא, אבל HX יכול להיות מקומית לאזורים הספציפיים 8,9. רזולוציה מרחבית כרגע מוגבלת לגודל של שברים פפטי שנוצרו, שהוא באופן כללי בין 10-30 שאריות. עם זאת, שברים חופפים שנוצרו בשל האופי ספציפי של מחשוף ידי פפסין יכולים להוביל לעלייה ברזולוציה מרחבית. בנוסף, כמה פרוטאזות אחרות נמצאו להיות פעילים בתנאים להרוות, לעומת זאת, הרבה פחות יעיל מאשר עכלן 10. increa נוספתניתן להגיע se של רזולוציה מרחבית על ידי פיצול של פפטידים בשלב הגז על ידי שיטות ששמרו את דפוס deuteration כגון ניתוק לכידת אלקטרונים (ECD), ניתוק אלקטרון העברה (ETD) ודיסוציאציה multiphoton אינפרא אדום (IRMPD) 11-13. טכניקות אלו למנוע האובדן של רזולוציה מרחבית בשל הגירת intramolecular פרוטון ("ערבול"), אשר נצפתה על ידי ניתוק הנגרם התנגשות (CID) את טכניקת הפיצול הנפוצה ביותר. עם זאת, שיטות אלו דורשות אופטימיזציה לכל פפטיד בודד ולכן היא עדיין מאתגרת למדי.

HX-MS כבר בשימוש כדי לנתח אינטראקציות החלבון ליגנד וחלבונים כולל הרכבה הקופסית נגיפית 14-17. חלבון התגלגלות וקיפול מחדש, כמו גם שינויי קונפורמציה מושרה טמפרטורה נחקרו 7,18,19. זירחון וקונפורמציה הקשורות למוטצית חומצה אמינית אחת משתנים 16,20 וnucleotשינויי ide-induced נותחו 21,22. לכן, שיטה זו נראית מתאימה באופן אידיאלי לניתוח הרכבה ודינמיקה של מכונות מולקולריות. מועמד אחד אטרקטיבי, מנגנון שהוא עניין כללי גדול, הוא מורכב מלווה Hsp90.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. דוגמאות הכנת חוצצים וחלבון

  1. הכן H 2 O חיץ. חיץ סטנדרטי השימוש Hsp90 (40 HEPES מ"מ / KOH, pH 7.5, 50 מ"מ KCl, 5 מ"מ MgCl 2, גליצרול 10%) כH 2 O חיץ.
    הערה: אם המדגם היה dialyzed לפני הניתוח, השתמש במאגר הדיאליזה כH 2 O חיץ. זה חיוני כי החיץ O D 2 שונה מהחיץ H 2 O היחיד באיזוטופ המימן. מאגרים נדיפים כמו NH 4 רכיבי 4-אצטט או חיץ CO 3 או NH אינם מתאימים!
  2. הכן D 2 O חיץ ידי lyophilization של חיץ סטנדרטי Hsp90 באמצעות concentrator ואקום. לאחר אידוי של H 2 O מלא להוסיף D הטהור 2 O לצינור כדי להגיע לנפח הראשוני הכולל (למשל 1 מיליליטר חיץ עם גליצרול 15% דורשים תוספת של 850 D μl 2 O). חזור על האידוי של החיץ המוחלט וredissolve com חיץ / מלחponents בD 2 O 2x.
  3. הכן את החיץ להרוות (0.4 M KH 2 PO 4 / H 3 PO 4 pH 2.2).
    הערה: כדי לשפר את היעילות של לעכל פפטי של חלבונים יציבים מאוד ניתן להוסיף 4 M hydrochloride guanidine ו0.5 M טריס phosphine (2-carboxyethyl) (TCEP-HCl).
  4. הכן 100% מדגם שליטה (6 hydrochloride M guanidine, D 2 O). הוספת hydrochloride guanidine לaliquot Hsp90 להגיע לריכוז סופי של 6 מ 'לחלוטין להתאדות H 2 O מן המדגם ולהוסיף D 2 O לצינור כדי להגיע להיקף הכולל הראשוני (מדגם μl למשל 100 עם גליצרול 10% דורשים בנוסף של O D 2 μl 90). חזור על האידוי של החיץ המוחלט וredissolve רכיבי חיץ / מלח בD 2 O.
    הערה: 20-100 pmol של מדגם נדרש לכל זריקה. הכן מספיק מדגם יש שליטת 100% עבור כל יום של ניסויי HX-MS.
  5. הכן 50 pmol Hsp90 ב5 μl חיץ סטנדרטי Hsp90.
    הערה: כמות של 20-100 pmol של מדגם נדרש עבור כל נקודה של נתונים גולמיים. היקף המדגם בתגובה הוא 1-5 μl באופן אידיאלי. התאם את הריכוז כדי שיתאים לדרישות אלה. כל מאגר יכול לשמש כל עוד הוא אינו מכיל דטרגנטים או רכיבים תנודתיים.

2. הכנת המשותקת פפסין באלדהיד הופעל חרוזים

  1. ממיסים פפסין הטרי 80 מ"ג ב2 מיליליטר 50 נתרן ציטרט מ"מ (pH 5).
  2. ממיסים 20 מ"ג cyanoborohydride נתרן, להתמודד עם טיפול (רעיל מאוד!) ב 1 מיליליטר 2 M Na 2 SO 4 ולהוסיף לפתרון פפסין.
  3. דגירה תערובת במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר תוך כדי התססה (למשל ייקר תקורה) בעדינות.
  4. הוספת 600 חרוזים מ"ג עם קבוצות אלדהיד משותקים לתערובת ודגירה של 5-10 דקות בטמפרטורת חדר.
  5. הוספת 2.2 מיליליטר של 2 M Na 2 SO4 (pH 5) ב100 aliquots μl כל 3 דקות במשך שעה אחת למלח לאט את פפסין. בעדינות מערבב את המדגם בין תוספות שבייקר תקורה בטמפרטורת חדר.
  6. דגירה חרוזים פפסין ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 14-16 / לילה בייקר תקורה.
  7. להרוות את התגובה על ידי הוספה של ethanolamine 1 מיליליטר 1 M ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות.
  8. ספין למטה חרוזים בצינור בז 50 מיליליטר ב500 סל"ד, לבטל את supernatant ו resuspend את החרוזים 0.1% חומצה פורמית. חזור 2x שלב זה. לאחר שלב צנטריפוגה האחרון, להשליך supernatant ואומדן נפח של חרוזים. הוסף נפח שווה ערך של חומצה פורמית 0.1% ולאחסן ב 4 ° C.

3. הכנת עמודות למימן לבורסה אמידה

  1. להשתמש בעמודות שומר עם קוטר פנימי של 1 מ"מ להשמנת עמודות ועם 2 מ"מ עבור עמודות פפסין.
  2. הברג החוצה בצד אחד של טור השומר ולהסיר את המסנן. חוזקה בורג אריזת funnאל על הקצה הפתוח של העמודה. להשתמש במתאם 1/16 אינץ וצינורות לצרף מזרק ריק (5 מיליליטר) למשקע התחתון של העמודה. ודא כדי לתקן את זה גז הדוק לעמודת השומר.
  3. להחיל כמה טיפות של חומר חרוז תרחיף על גבי המשפך. משוך את הבוכנה של המזרק למצוץ התרחיף דרך המשפך לתוך טור השומר. החל חומרי חרוז slurry יותר על המשפך ולהמשיך את ההליך עד לעמודת השומר מלאה לחלוטין עם חומר חרוז. הסר את המשפך ולמקם את המסנן וטבעת מסנן על הסוף הפתוח. חוזקה לדפוק את כובע הטור על טור השומר ולהסיר את המזרק מהצד השני. לסגור את שני הקצוות של עמודות השומר עם אטמים כדי למנוע התייבשות של חומר עמודה.

4. הגדרת המערכת למימן Exchange ספקטרומטריית מסה (HX-MS)

  1. חבר את עמודת המלכודת עם מערכת HPLC (איור 1). לאזן את העמודה על ידי קביעת קצב הזרימה שלמשאבה ל0.4 מיליליטר / דקה עם חומצה פורמית 0.1% ממס כ. אל תחבר את עמודת פפסין ולא העמודה אנליטיים עדיין.
  2. כייל את ספקטרומטר המסה ולחבר את היציאה של HPLC למקור של ספקטרומטר המסה.

5. קביעת טווח דינמי של Exchange

  1. הכן ממס ultrapure (0.1% חומצה פורמית במים) ו-B ultrapure ממס (0.1% חומצה פורמית באצטוניטריל); ממסים מעורבים מוכנים זמינים מסחרי. טהר את משאבות HPLC. הגדרת כרומטוגרפיה ושיטות ספקטרומטריית מסה בתוכנת שליטה על ידי בחירת תכנית עם שיפוע צעד אחרי צעד desalting קצר. לאורך מלא Hsp90 להשתמש צעד desalting 1-2 דקות ואחריו מיתוג שסתום 6 יציאות מDesalt / לטעון לElute ושיפוע צעד מ90%% A/10 ממס B ממס עד 5% ממס% A/95 ממס B. לפני ההזרקה להגדיר את שסתום ההזרקה לעומס ואת שסתום 6 היציאות לDesalt / עמדת טעינה.
    פתק: אין להשתמש בפפסין או עמודה אנליטיים במהלך ניסוי זה.
  2. הכן 100-200 pmol של Hsp90 ב1-10 μl H 2 O חיץ דגירה עבור 10 דקות ב30 ° C. הוספת D יותאם טמפרטורת 2 O חיץ להביא את נפח הדגימה עד 100 μl ודגירה בדיוק לתקופה מוגדרת של זמן (למשל 10 שניות, 100 שניות, 1,000 שניות). הוספת 100 חיץ להרוות μl ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. הזרק מדגם 200 μl ליציאת ההזרקה של שסתום ההזרקה עם מזרק המילטון. הפעל את תכנית כרומטוגרפיה ולעבור את שסתום ההזרקה לתוך עמדה להזריק. לאחר 2 דקות לעבור את שסתום 6 יציאות מDesalt / טעינה לElute. חזור על פעולה זו לפחות שלוש נקודות זמן.
  3. חזור על שלב 5.2 אבל להוסיף עודף 2-3x של Sti1 מדגם Hsp90 לפני דוגרים 10 דקות ב 30 ° C.
  4. לקבוע את המוני חלבון באורך מלא על ידי deconvolution של ספקטרה בתוכנת ספקטרומטריית המסה. לחשב את מספר incorporated deuterons על ידי השוואת המשקל המולקולרי של באורך מלא עם Hsp90 ההמוני שנצפה אחרי כל הסיבוב (לדוגמא 10 שניות, 100 שניות, 1,000 שניות).
  5. העלילה deuterons התאגד לHsp90 בהיעדר ונוכחות של Sti1 (ציר y) לעומת זמן (ציר x). לקבוע את נקודת הזמן בטווח הדינמי שבו ההבדל בין שני העקומות הוא מקסימאלי. השתמש בערך זה לזמן הדגירה בD 2 O כאשר מזהים ממשק Hsp90-Sti1 ודינמיקה ברמת הפפטיד.

6. קביעת פפטי פפטידים באמצעות MS / MS ספקטרה

  1. חבר את עמודת פפסין ועמודה אנליטיים למערכת.
  2. להגדיר את הפרמטרים לכרומטוגרפיה וספקטרומטריית מסה בתוכנת שליטה על ידי בחירת סוג הצבע ושיטת ספקטרומטריית מסה. בחר שיפוע ארוך (למשל, יותר מ -90 דקות) כדי להבטיח רזולוציה chromatographic טובה. אפשר MS / MS ספקטרום בספקטרומטר המסה.
    הערה: resolu טובtion על HPLC ודיוק מסה גבוהה יש עדיפות הגבוהה ביותר בשלב זה.
  3. הכן 100-200 pmol של Hsp90 ב100 μl H 2 O חיץ. הוספת 100 חיץ להרוות μl ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. הזרק מדגם 200 μl ליציאת ההזרקה של שסתום ההזרקה עם מזרק המילטון. הפעל את תכנית כרומטוגרפיה ולעבור את שסתום ההזרקה לתוך עמדה להזריק. לאחר 2 דקות לעבור את שסתום 6 יציאות מDesalt / טעינה לElute עמדה.
    שים לב: אם חלבון אחד או יותר הוא להיות מנותח בHX-MS (ממשקי אינטראקציה בין חלבונים כלומר) פפטידים עבור כל חלבון צריכים להיקבע בנפרד.
  4. לזהות פפטידים פפטי של Hsp90 על ידי חיפוש במסד נתונים (כלומר קמע) לפפטידים שהתקבלו.
    הערה: אפשר להשתמש במסד נתונים מותאם אישית כמטרה היא לקבוע כמה פפטידים פפטי ככל האפשר וניתוח נעשה עם חלבון מטוהר. טוהר מדגם have להילקח בחשבון.
  5. חזור על שלב זה ללא MS / MS ועם השיפוע שישמש לניסוי HX בפועל. לHsp90 וSti1 להשתמש שיפוע 10 דקות מ90%% A/10 ממס B ממס ל45%% A/55 ממס ב 'ממס
    הערה: הדרגות הן בדרך כלל בין 5-15 דקות ומאוד תלויים במורכבות דוגמא ומפרט מערכת HX.
  6. זמן שמירה לקבוע את זמני שמירה של פפטידים פפטי זוהו ב6.4 בשיפוע המשמש ב6.5 וליצור רשימה הכוללת 1). רצף פפטיד 2). מדינת פפטיד תשלום ו3.). זה ישמש לזיהוי כל פפטיד לאחר ניסויי HX.
    הערה: שים לב שפפטידים עם הבדלים קטנים מ '/ z, מדינת תשלום זהה וזמן שמירה זהה יכולים להיות מקור של עמימות.

7. זיהוי של ממשקי אינטראקציה בין חלבונים

  1. להגדיר את השיפוע ושיטת ספקטרומטריית מסה בsoftwar השליטהדואר. השתמש בשיפוע ליניארית 10 דקות מ90%% A/10 ממס B ממס ל45%% A/55 ממס B. ממס טען שיטת ספקטרומטריית מסה כי הוא מותאם לצורך זיהוי של המונים בין 300-1,500 מ '/ z, אם כי רוב פפטידים יהיו מתחת 1,000 מ '/ z. הגדר את שסתום ההזרקה לעמדת טעינה, שסתום 6 יציאות במיקום הטעינה / desalting. הגדר את קצב הזרימה של משאבת הטעינה ל0.4 מיליליטר / דקה.
    הערה: אורך והסוג של שיפוע תלוי מדגם וייתכן שיהיה הצורך להיות מותאם. הדרגתיים יותר לשפר את הרזולוציה של כרומטוגרפיה אבל להקטין את השילוב של deuterons לחלבונים בשל גיבוי חליפין. השיטות שנבחרו צריכים להיות זהה עבור כל הניסויים כדי להשוות.
  2. להתייחסות unexchanged להכין 20-100 pmol של Hsp90 ב100 μl H 2 O חיץ. הוספת 100 חיץ μl קר כקרח להרוות, פיפטה מעלה ומטה פעמיים ולהזריק מדגם לתוך שסתום ההזרקה של HPLC. מייד להפעיל את תכנית כרומטוגרפיה ו SWלגרד את שסתום ההזרקה לתוך עמדה להזריק. לאחר 2 דקות לעבור את שסתום 6 יציאות מDesalt / טעינה לElute עמדה. האם זה עבור Hsp90 וSti1 בנפרד ולתערובת של חלבונים.
  3. הכן 20-100 pmol של Hsp90 בנפח של 1-5 μl. הוספת D יותאם טמפרטורת 2 O חיץ להביא את נפח הדגימה עד 100 μl ודגירה בדיוק לתקופה מוגדרת של זמן (למשל 30 שניות; לדינמיקת קונפורמציה ראה הערה). הוספה של חיץ קר כקרח להרוות, פיפטה מעלה ומטה 100 μl פעמיים ובמהירות להזריק 200 μl לשסתום ההזרקה של HPLC. מייד להפעיל את תכנית כרומטוגרפיה ולעבור את שסתום ההזרקה לתוך עמדה להזריק. לאחר 2 דקות לעבור את שסתום 6 יציאות מDesalt / טעינה לElute עמדה. האם זה עבור כל חלבון בנפרד, כדי לקבוע את שילוב deuteron לתוך כל פפטיד בהיעדר חלבון האינטראקציה.
    הערה: כאשר לומדים את הדינמיקה של conformational שינויים, לחזור על הניסוי עם זמני דגירה שונים של Hsp90 בD 2 O חיץ. נסה לכסות את לוח זמנים רחבים על ידי בחירת פעמים דגירה וגריתמיות (למשל 10 שניות, 30 שניות, 100 שניות, 300 שניות, 1,000 שניות, וכו '). D 2 חיץ חיץ ומדגם O חייב להיות בדיוק זהה, פרט לאיזוטופ המימן.
  4. הכן כמות שווה של 100% מדגם שליטה (20-100 pmol) ולהוסיף D 2 O חיץ להביא את נפח הדגימה עד 100 μl. הוספה של חיץ קר כקרח להרוות, פיפטה מעלה ומטה 100 μl פעמיים ובמהירות להזריק 200 μl לשסתום ההזרקה של HPLC. מייד להפעיל את תכנית כרומטוגרפיה ולעבור את שסתום ההזרקה לתוך עמדה להזריק. לאחר 2 דקות לעבור את שסתום 6 יציאות מDesalt / טעינה לElute עמדה.
  5. כדי לקבוע את פני השטח האינטראקציה לערבב Hsp90 עם עודף לפחות פי 2 מSti1 להעביר את שיווי המשקל למצב הקשור (ראה הערה) ודגירהבטמפרטורה הרצויה עד היווצרות מורכבת הוא בשיווי המשקל. הוספת D יותאם טמפרטורת 2 O חיץ להביא את נפח הדגימה עד 100 μl ודגירה בדיוק לתקופה מוגדרת של זמן (למשל 30 שניות). הוספה של חיץ קר כקרח להרוות, פיפטה מעלה ומטה 100 μl פעמיים ובמהירות להזריק לשסתום ההזרקה של HPLC. לאחר 2 דקות לעבור את שסתום 6 יציאות מDesalt / טעינה לElute עמדה. חזור על הניסוי הזה עם 20-100 pmol של Sti1 ועודף של Hsp90.
    הערה: הריכוזים מוחלטים תלויים בשיווי המשקל הקבוע דיסוציאציה של האינטראקציה. באופן אידיאלי, לאחר הדילול לD 2 O הריכוז של החלבון הוסיף בעודף צריך להיות לפחות 10x K D (המקביל ל> 85% מהחלבון המרוכז גבול התחתון).
  6. לנתח את הנתונים שנרכשו עם תוכנה מתאימה ולהשתמש בפעמי השמירה שנקבעו בשלב 6.5 למצוא אחד את הפפטיד בניתוח. החישוביםte centroid של הפצת איזוטופ לחלבון unexchanged (שלב 7.2) ועבור ניסויי HX (שלב 7.3).
    הערה: למרות שדפוסי איזוטופ של פפטידים החליפו נראים שונים מעמיתיהם unexchanged, שניהם את הידע על מדינת תשלום של הפפטיד ואת דיוק המסה הגבוה של ספקטרומטר המסה מאפשר להגדרה קלה של centroids.
  7. שקלו את השילוב של deuterons חלבון המטרה של לבד ועם עודף של כריכת שותף. ניתן לעשות זאת באופן אוטומטי עם תוכנה מסחרית או ידני עם תכנית גיליון אלקטרוני. ערכי מדגם שליטת 100% מציינים את חילופי מקסימאלי עבור כל פפטיד והוא יכול לשמש כדי לקבוע את הסכום של D 2 O תווית איבדה במהלך הניסוי בשל תמורה בחזרה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

Hsp90 הוא מלווה מולקולרי בשמרים וחבר של משפחת מלווה Hsp90. על ידי עובר מחזור ATPase מורכב זה מסייע בצעדי קיפול מאוחרים של לקוחות חלבון רבים. קיפול יעיל דורש העברה של לקוחות מHsp70 ואינטראקציה של Sti1/Hop שיתוף המלווה. Sti1 ישירות נקשר Hsp90 ומקל על לקוח מחייב על ידי עיכוב פעילות ATPase של Hsp90. אינטראקציה של Hsp90 עם Sti1 נחקרה לאחרונה באמצעות HX-MS 23. כאן אנו מציגים תוצאות נציג של הניסויים הבסיסיים הבאות בפרוטוקול לעיל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עקידת שותף אינטראקציה לחלבון באופן בלתי נמנע גורמת לשינויים בנגישות ממס על אתר הקישור. בנוסף, חלבונים רבים עוברים שינויים דינמיים קונפורמציה על כריכה, המשפיעים על אזורים אחרים מאשר הממשק מחייב בפועל. HX-MS היא שיטה חזקה כדי לעקוב אחר שינויים אלה, והוא אפילו מסוגל לחשוף שינויי קונפורמציה בחלבונים על לוחות זמנים ששיטות אחרות לא יכולות לכסות.

כדי לבצע בהצלחה HX-MS שלוש נקודות הן קריטיות: 1) הגדרת מערכת אופטימלית; 2)...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש לנו מה למסור.

תודות

אנו מודים מ 'Boysen להערות על כתב היד. פרויקט זה מומן על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (SFB638 ותואר שני 1278/4-1 לMPM, ואשכול של אקסלנס: CellNetworks EXC 81/1). MPM הוא חוקר של האשכול של אקסלנס: CellNetworks.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
maXis QTOFBruker
nanoAcquity UPLCWaters Corp.
Shimadzu 10AD-VPShimadzu
6 יציאות שסתום EPC6W עם מפעיל מיקרואלקטריValco#EPC6W
שסתום הזרקה (ידני)Rheodyne#7725
Poros AL20 מדיהיישומית Biosystems#1-6029-06
Poros R2Applied Biosystems#1-1118-02
Pepsinסיגמא#P6887השתמש במיקרובור פפסין טרי
(1 מ"מ)IDEX#C-128
מיקרובור (2 מ"מ)IDEX#C-130B
Acquity UPLC BEH C8 ColumnWaters Corp.#186002876
ThermomixerEppendorf#5355000.011
צינורות (בקטרים שונים)אביזרי IDEX
IDEX#PK-110 עם PK-100

מקורות

  1. Saibil, H. R. Conformational changes studied by cryo-electron microscopy. Nat. Struct. Biol. 7 (9), 711-714 (2000).
  2. Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
  3. Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
  4. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass. Spectrom. Rev. 25 (1), 158-170 (2006).
  5. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. -H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem Soc. Rev. 40 (3), 1224-1210 (2011).
  6. Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
  7. Rist, W., Jørgensen, T. J. D., Roepstorff, P., Bukau, B., Mayer, M. P. Mapping temperature-induced conformational changes in the Escherichia coli heat shock transcription factor sigma 32 by amide hydrogen exchange. The Journal of biological chemistry. 278 (51), 51415-51421 (1074).
  8. Englander, J. J., Rogero, J. R., Englander, S. W. Protein hydrogen exchange studied by the fragment separation method. Anal Biochem. 147 (1), 234-244 (1985).
  9. Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Sci. 2 (4), 522-531 (1993).
  10. Cravello, L., Lascoux, D., Forest, E. Use of different proteases working in acidic conditions to improve sequence coverage and resolution in hydrogen/deuterium exchange of large proteins. Rapid Commun. Mass Spectrom. : RCM. 17 (21), 2387-2393 (2003).
  11. Rand, K. D., Zehl, M., Jensen, O. N., Jørgensen, T. J. D. Protein hydrogen exchange measured at single-residue resolution by electron transfer dissociation mass spectrometry. Anal chem. 81 (14), 5577-5584 (2009).
  12. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Electron capture dissociation of electrosprayed protein ions for spatially resolved hydrogen exchange measurements. J. Am. Chem. Soc. 130 (35), 11574-11575 (2008).
  13. Yamada, N., Suzuki, E. -I., Hirayama, K. Identification of the interface of a large protein-protein complex using H/D exchange and Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 16 (4), 293-299 (2002).
  14. Lee, T., Hoofnagle, A. N., et al. Docking motif interactions in MAP kinases revealed by hydrogen exchange mass spectrometry. Mol. Cell. 14 (1), 43-55 (2004).
  15. Hasan, A., Smith, D. L., Smith, J. B. Alpha-crystallin regions affected by adenosine 5'-triphosphate identified by hydrogen-deuterium exchange. Biochem. 41 (52), 15876-15882 (2002).
  16. Lanman, J., Lam, T. T., Emmett, M. R., Marshall, A. G., Sakalian, M., Prevelige, P. E. Key interactions in HIV-1 maturation identified by hydrogen-deuterium exchange. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (7), 676-677 (2004).
  17. Wang, L., Lane, L. C., Smith, D. L. Detecting structural changes in viral capsids by hydrogen exchange and mass spectrometry. Protein Sci. 10 (6), 1234-1243 (2001).
  18. Pan, H., Raza, A. S., Smith, D. L. Equilibrium and kinetic folding of rabbit muscle triosephosphate isomerase by hydrogen exchange mass spectrometry. J. Mol. Biol. 336 (5), 1251-1263 (2004).
  19. Mazon, H., Marcillat, O., Forest, E., Smith, D. L., Vial, C. Conformational dynamics of the GdmHCl-induced molten globule state of creatine kinase monitored by hydrogen exchange and mass spectrometry. Biochem. 43 (17), 5045-5054 (2004).
  20. Lanman, J., Lam, T. T., et al. Identification of novel interactions in HIV-1 capsid protein assembly by high-resolution mass spectrometry. J. Mol. Biol. 325 (4), 759-772 (2003).
  21. Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. J. Biol. chem. 281 (24), 16493-16501 (2006).
  22. Graf, C., Stankiewicz, M., Kramer, G., Mayer, M. P. Spatially and kinetically resolved changes in the conformational dynamics of the Hsp90 chaperone machine. EMBO J. 28 (5), 602-613 (2009).
  23. Lee, C. -T., Graf, C., Mayer, F. J., Richter, S. M., Mayer, M. P. Dynamics of the regulation of Hsp90 by the co-chaperone Sti1. EMBO J. 31 (6), 1518-1528 (2012).
  24. Lou, X., Kirchner, M., et al. Deuteration distribution estimation with improved sequence coverage for HX/MS experiments. Bioinformatics. 26 (12), 1535-1541 (2010).
  25. Kreshuk, A., Stankiewicz, M., Lou, X., Kirchner, M., Hamprecht, F. A., Mayer, M. P. Automated detection and analysis of bimodal isotope peak distributions in H/D exchange mass spectrometry using HeXicon. Intl. J. mass spectrom. 302 (1-3), 125-131 (2011).
  26. Walters, B. T., Ricciuti, A., Mayne, L., Englander, S. W. Minimizing back exchange in the hydrogen exchange-mass spectrometry experiment. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23 (12), 2132-2139 (2012).
  27. Weis, D. D., Wales, T. E., Engen, J. R., Hotchko, M., Ten Eyck, L. F. Identification and characterization of EX1 kinetics in H/D exchange mass spectrometry by peak width analysis. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (11), 1498-1509 (2006).
  28. Fang, J., Rand, K. D., Beuning, P. J., Engen, J. R. False EX1 signatures caused by sample carryover during HX MS analyses. Intl. J. Mass Spectrom. 302 (1-3), 19-25 (2011).
  29. Deng, Y., Smith, D. L. Identification of unfolding domains in large proteins by their unfolding rates. Biochem. 37 (18), 6256-6262 (1998).
  30. Wales, T. E., Engen, J. R. Partial unfolding of diverse SH3 domains on a wide timescale. J. Mol. Biol. 357 (5), 1592-1604 (2006).
  31. Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by h/d exchange and covalent labeling: the glycerol facilitator. J. Mol. Biol. 416 (3), 400-413 (2012).
  32. Hebling, C. M., Morgan, C. R., Stafford, D. W., Jorgenson, J. W., Rand, K. D., Engen, J. R. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Anal chem. 82 (13), 5415-5419 (2010).
  33. Abzalimov, R. R., Kaplan, D. A., Easterling, M. L., Kaltashov, I. A. Protein conformations can be probed in top-down HDX MS experiments utilizing electron transfer dissociation of protein ions without hydrogen scrambling. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20 (8), 1514-1517 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ניתוח דינמיקה של חלבוניםאינטראקציות חלבון-חלבוןמיפוי פפטידיםשילוב דאוטריוםכרומטוגרפיה נוזליתזיהוי אתרי קישורשינויים קונפורמציונלייםקיפול חלבונים
ניתוח דינמיקת חלבון באמצעות מימן Exchange ספקטרומטריית מסה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.