קולונוסקופיה גמישה בעכברים כדי להעריך את חומרת קוליטיס ומעי הגס גידולים באמצעות מערכת Validated אנדוסקופי ניקוד

סיכום

במהלך השנים האחרונות, אנדוסקופים דור חדשים צמחו כעזרי מחקר אבחונים חשובים להערכת קוליטיס העכברי וגידולי מעי גס. אנו מציגים במסמך פרוטוקול מפורט לשיטת ניקוד חדשה שמשתמשת במזהים עשרוניים לתעד את החומרה אנדוסקופית של קוליטיס וגידולי מעי גס הערכה אנדוסקופית של דלקת וגידולי מעי גס בעכברים, כמו גם.

תקציר

השימוש באנדוסקופיה המודרנית למטרות מחקר יש להקל באופן משמעותי את ההבנה של פתולוגיות במערכת העיכול שלנו. בפרט, אנדוסקופיה הניסיונית כבר שימושית מאוד עבור מחקרים הדורשים הערכות חוזרות ונשנות בבעלי חיים במעבדה אחת, כגון אלה הערכת מנגנונים של מחלת מעי דלקתית כרונית וההתקדמות של סרטן מעי גס. עם זאת, השיטות ששמשו על פני לימודים הן משתנה מאוד. לפחות שלוש מערכות ניקוד אנדוסקופית כבר פורסמו לקוליטיס העכברי ופורסמו פרוטוקולים להערכה של גידולי מעי גס אינם מתייחסים לנוכחות של דלקת במעי הגס במקביל. מחקר זה עוסק בפיתוח ומאמת שיטת ניקוד אנדוסקופית לשעתק המשלבת הערכה של שניהם דלקת וגידולים בו זמנית. שיטת ניקוד הרומן הזה יש שלושה מרכיבים עיקריים: 1) הערכה של ההיקף והחומרה של דלקת מעי גס (המבוסס על ממצאים סביב פי טבעת, שקיפות של וולl, דימום הרירי, ונגעי מוקד), 2) הקלטת כמותי של נגעים סרטניים (מפת רשת וגרף עמודות), ו3) מיון מספרי של מקרים קליניים לפי רלוונטי פתולוגי ומחקר שלהם מבוססים על יחידות עשרוניות עם קטגוריות שהוקצו של נגעים שנצפו ו סיבוכי אנדוסקופית (מזהים עשרוניים). הווידאו וכתב היד שהוצג במסמך זה הוכנו, בעקבות פרוטוקולים שאושרו IACUC, כדי לאפשר לחוקרים להבקיע עכברי הניסוי שלהם באמצעות מתודולוגיה אנדוסקופית תוקף היטב ושחזור מאוד, עם אפשרות המערכת כדי לבדל דיסטלי מקוליטיס אנדוסקופית פרוקסימלי (D-שרירי חזה ).

מבוא

אנדוסקופיה Murine בוצעה ככלי מחקר שימושיים במשך למעלה מעשור ^1-3. עד כה, רוב מחקרי העסקת אנדוסקופיה העכברית השתמשו אנדוסקופים נוקשה, למרות שחלקם השתמש גם סיגמואידוסקופיה גמישה. אנדוסקופיה Murine מספקת תוצאות מיידיות והערכה אובייקטיבית יותר של המידה של נורמליות מעי, חומרת הדלקת, והתקדמות גידול בהשוואה לאמצעים עקיפים, כגון ירידה במשקל גוף, שלשולים, והיסטולוגיה (שהוא הכי מוצלח כאשר נגעים הם לא אחידים), ואילו מציע תובנות על הבריאות הכללית של המעי הגס. בעיקר, אנדוסקופיה מאפשרת להערכה החוזרת ונשנית של מודלים של בעלי חיים במעבדה לאורך זמן, בניגוד לבדיקה היסטולוגית מסורתית המחייבת את בעלי החיים כדי להיות מורדמים ונקודות להיות שנקטפו לניתוח ^1. למרות יתרונות אלה, השימוש בטכנולוגיה אנדוסקופית עכברית לא היה נפוץ ומוגבל על ידי חוסר פרוטוקולים סטנדרטיים לimplementatiובניקוד של ממצאים פתולוגיים. אנדוסקופיה מיושמת כהלכה, עכברית טומנת בחובו הבטחה גדולה כדי להקל על ההבנה והאפיון של מודלים של בעלי החיים של מדינות רבות כרוניות במערכת העיכול מחלות, כולל מחלות מעי דלקתיות, דלקת המעי הגס, וגידולי מעי גס שלנו עוד יותר.

תועלתה של טכנולוגיה אנדוסקופית עכברית צירים על שחזור שלה ואובייקטיביות, המחייב את מערכת עקבית, שאינו מיותרת, ואמינה ניקוד לפתולוגיות מעיים קיומם של נהלי בדיקה סטנדרטיים ו. לפחות שלוש מערכות תיאורי ניקוד להערכה אנדוסקופית של קוליטיס ^4-6, כמו גם לגידולים במעי הגס ^4,7,8 בעכברים כבר פורסמו. עם זאת, גישות אלו דיווחו ומערכות ניקוד לא ניתן להשוות בקלות על פני לימודים. במקרים רבים, אין הגדרה ברורה של הקריטריונים ששמשו לסיווג של נגעים, וכאשר ניתנים קריטריונים, הם משתנים במידה רבה. יתר על כן,אין מערכות ניקוד דיווחו כי לשלב את ההערכה של שני קוליטיס וגידולים, שתי פתולוגיות מעי הגס הנפוצות ביותר שיכול להתרחש בו זמנית ויש השפעות אינטראקטיביות על תוצאה, לכלי מדידה יחיד. לבסוף, לעתים קרובות יש מערכות ניקוד אנדוסקופית שאכן קיימות עבור קוליטיס קטגוריות דלקתיות עם אפליה מוגבלת (כלומר. אפשרויות צרות ניקוד על סולמות שלמים קצרים, לעתים קרובות 1-4) כדי לייצג כראוי תרחישי התקדמות מחלה ולאפשר את השימוש בניתוח סטטיסטי פרמטרית.

במאמר זה, אנו מתארים את השימוש באנדוסקופ גמיש על מנת להעריך את חומרת קוליטיס העכברית וגידולים במעי הגס ומתאר פרוטוקול סטנדרטי לשימוש בטכנולוגיה זו בהערכה האנטומי של האזור פי הטבעת, פי הטבעת, ומעי גס דיסטלי. אנו מדגימים לפתרון בעיות יעילות במהלך אנדוסקופיה כדי למזער את חפצי טראומה ותמונה, ואנו מתארים שיטת ניקוד לשחזורהמבוסס על תוקף פרמטרים קליניים שפורסמו. שיטת הניקוד משלבת הערכה של שניהם דלקת מעיים וגידולים תוך שימוש ברמה גבוהה של אפליה עם 12 ציונים אפשריים של דלקת, מיפוי גידול ואפשרויות קשירת קשר, ומערכת חדשנית עשרוני יחידה (כלומר, מזהה עשרוני) כדי להדגיש את הממצאים עם ערך אבחון ספציפי ( התפתחות גידול כלומר, סיבוכים במהלך אנדוסקופיה, וכו '). השימוש במזהים עשרוניים מאפשר מעקב מהיר של ערכות נתונים רלוונטיות לניתוח נוסף במורד הזרם. לבסוף, אנו מבצעים אמינות ובדיקת תקפותה של שיטת הניקוד במודלים עכבריים מרובים של קוליטיס והסרטן הקשורים לדלקת מעי גס (נתרן גופרתי dextran (DSS) הנגרם דלקת המעי הגס, זיהום Clostridium difficile, וazoxymethane / סרטן מעי הגס הנגרם DSS).

פרוטוקול

1. הגדרת מערכת אנדוסקופיה

1. להגדיר את מערכת אנדוסקופיה לפני הרדמת העכברים, בעקבות הוראות היצרן. השתמש ureteroscope וידאו מיועד לבני אדם לפרוטוקול זה (איור 1). הקוטר החיצוני של צינור הכניסה נמצא 9.9 Fr (3.3 מ"מ), הקצה הדיסטלי שלה הוא 8.5 Fr (2.8 מ"מ), והקוטר הפנימי של ערוץ המכשור הוא 6 Fr (1.2 מ"מ).
2. למרות השימוש באנדוסקופים לא היה קשור להעברת מחלה [9], לעקר את אנדוסקופ ועדשה עם אתנול 70% ¹⁰ או עם טכניקות מתאימות כאשר עובדים עם מיקרואורגניזמים נבג יוצרים. להכין חומר סיכה סטרילית bacteriostatic ולא גירוד לנגב רקמות כדי להרוות את קצה אנדוסקופ.
3. צרף מזרק 3 מיליליטר מלא באוויר (או תערובת גז מתאימה CO ₂₎ לחלק העליון של ערוץ המכשור.
4. הפעל את מחשב, ולהגדיר את האיזון הלבן באור לבן רגיל,מצב, כמו גם צר הדמיה להקה (NBI), כאשר הדבר ישים. מאז 2001, NBI סיפק יתרונות הדמיה לאבחון כפי שהוא מדגיש מבנים בסדר כלי דם בקרום רירי, כוללים נגעים כיבית וtumorous, שיש כלי דם לא תקינים אופייניים ^11. מצב NBI-מסנן מגביל את אורך הגל של אור שנתפס ל390-445 ננומטר ו530-550 ננומטר, אשר מדגיש מבנים עם המוגלובין.
5. הדפס את טופס ניקוד הערכה (איור 2) כדי להקליט את הממצאים שלך. הכר את תמונות צפויות נורמליות וNBI (איור 3 א) והגדרה וציונים של כל קריטריון לפני הבחינה (ראה סעיף 6.1).
6. הכן פתרון מבוסס צבען על פוספט שנאגרו מלוח (PBS) במשך chromoendoscopy, אם תרצה בכך. בchromoendoscopy, הבחינה מתבצעת באמצעות צבע כחומר ניגוד להדגשת שינויים ברירית. השתמש תילן כחול (0.1-1%) וארגמן אינדיגו (0.1%) פתרונות (איור 3 ב). פתקכי מתילן הכחול הוא סוכן הפחתת חמצון שיכול לייצר רדיקלים חמצון, cross-linking העקיף של שאריות חומצת אמינו, והשפלה DNA ^12, אשר יכול להפריע לניתוח מדגם.

2. כללי הרדמה של העכבר

1. בחר את מסלול סוכן וממשל ההרדמה. התייעץ עם וטרינר ממתקן משאב בעלי חיים או ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש מוסדי (IACUC) לגבי הפרעה אפשרית של תרופות במערכת החיסונית ומטרות מחקר. תרופות מסוימות עשויות להשפיע על ביטוי פרופיל ציטוקינים בבעלי חיים, ובם מכרסמים ^13. השתמש tribromoethanol בזריקות לנהלים או isoflurane מסוף לendoscopies הישרדות, יחד עם שליטה ובקרה נאותה.
2. לזירוז, לנהל 4-5% מisoflurane ב100% חמצן בקצב של 0.2-0.5 ליטר / דקה; להשתמש 0.5-2% לצורך התחזוקה. פרוטוקול זה אינו מתאים לכל בעלי החיים. יש להתייעץ עם הווטרינר שלך מתקןלקבלת הוראות והכשרה מתאימות. לציית להמלצות IACUC רלוונטיות כדי להשיג את הסטנדרטים הגבוהים ביותר לרווחת בעלי חיים. ודא כי בעכבר, אם בהרדמה מלאה.
3. 'רצועה' העכבר הרדים לשולחן משטח תומך בגב או תנוחת הגחון באמצעות דבק מעבדה. היזהר מהנטייה אנטומיים על מסך אנדוסקופ. Secure הגפיים התחתונים שלה וזנב. להקה של סרט גם יכולה להיות ממוקמת מעל החזה כדי למנוע תנועה ממכשיר ההנשמה, אך להימנע מהגבלת תנועות נשימתית בית החזה.

3. מפורטת אנדוסקופי בחינה

1. חפש נגעים פי טבעת לפני הכנסת אנדוסקופ לתוך פי הטבעת, ולאחר מכן לקדם את ההיקף דרך פי הטבעת.
2. מעיל אנדוסקופ עם סיכה ניתוחית סטרילי. הקפד שלא מעייל את פני השטח של חיישן CCD (התקן צמוד מטענים).
3. הכנס את אנדוסקופ ולהתחיל בהקלטה. קטעי וידאו מוקלטים שימושיים למ 'הערכת eticulous של אנדוסקופיה במידת צורך לאחר הבדיקה. נסה לבצע אנדוסקופיה באורך של לפחות זמן האפשרי כדי למזער את הגירוי במעיים / ברירית.
4. החל אוויר באמצעות מזרק כדי להגדיר לאט לגזרים את דופן המעי. בהתאם לגודל של העכבר, השתמש 1-2 מיליליטר של אוויר. הימנע מניפוח אוויר מוגזם, זה עלול לגרום למצוקה ומוות בדרכי הנשימה של העכבר בהרדמה.
5. לקדם את אנדוסקופ קדימה כפי שאתה לנקות את הדרך עם אוויר או סיבוב עדין של היקפה. לא לקדם את אנדוסקופ אם אתה לא רואה את חלל המעי. נקבים או קרעים בפי הטבעת / במעי הגס יכולים להתרחש בשלב זה, בעיקר בעכברים צעירים (<8-10 שבועות). קח את התמונות בהתאם לצורך.
6. כהיקף מקדם, להעריך אם יש דימום ספונטני (שהוגדר כדימום הרירי המתרחש באופן טבעי אינו קשור לאנדוסקופיה הטראומטית). דימום ספונטני יכול להיות שנצפה כאנדוסקופ נכנס החלחולת ומעי גס.
7. כמוsess השקיפות של קיר המעי הגס. שקיפות מוגדרת כיכולת לחזות את כלי דם התחרות הפנימיים במעי הגס וזה של הקרביים שמסביב האחרים (איור 4). תנועה עדינה של ההיקף (גב קדימה, בכיוון השעון, נגד כיוון השעון) תעזור לקבוע אם ניתן לראות את כלי דם בהקשר של קרבים אחרים. ניתן גם לראות רקמת שומן mesenteric. שים לב אם פי הטבעת בתוך חלל האגן מופיעה שקופה פחות מקיר המעי בחלל הבטן.
8. בדוק כדי לקבוע את הסוג ומספר נגעי מוקד (אזורי בצקים, שחיקות, כיבים, מסות tumorous). זה יירשם בצורת הניקוד באמצעות ציון דלקת במעי הגס ומזהים העשרוניים שפותחו.
9. ברגע שהוא הגיע לאזור שבו המעי הגס מכופף caudally לתוך המעי הגס הפרוקסימלי, למשוך את אנדוסקופ לאט ולחפש את נוכחותו של קשר דימום (אשר מתרחשת עקב רירי פריר לאחראנדוסקופ הוא מתקדם או להסיר). אין זה הכרחי כדי לגרד את פני השטח המעי הגס במכוון. רירית מעי גס בריאה לא לדמם לאחר בדיקה אנדוסקופית נאותה.

4. ביופסיה

1. כאשר יש צורך בביופסיות, הכנס את המלקחיים הביופסיה דרך תעלת אנדוסקופ ייעודית עבור מכשור. לפקח על ההתקדמות של המלקחיים על מסך אנדוסקופ למנוע ניקוב מעי.
2. פתח את כוסות ביופסיה של המלקחיים על זווית כוס לכוס 60-80 °, ולהפנות אותם לאזור של עניין. מלקחיים או לחץ נפתחו יתר על המידה עשויים לתפוס שכבות נוספות של רקמת מעי, וכתוצאה מכך ניקוב-Induced ביופסיה של דופן מעי שקופה בריאה. אם ניקוב מתרחש, להרדימו במהלך ההרדמה בעקבות המלצות IACUC שלך. נקבים לגרום endotoxemia ודלקת הצפק.
3. סגור את כוסות ביופסיה, ולמשוך אותם החוצה, תוך שמירה על המלקחיים סגורים.
4. רמויש דגימה מהמלקחיים על ידי שטיפת הרקמה עם פתרון זה הוא עדין לרקמות והמלקחיים. RNA מאוחר יותר וPBS פתרונות עבודה משותפים; במידת צורך, השתמש במחט כדי לסלק את המדגם. הימנע נשחק כוסות מלקחיים או חיתוך קצוות.

5. התאוששות מהרדמה

1. עם השלמת הבדיקה, לספק סביבה חמה לעכבר עד שהוא מתאושש. להשתמש גם אור חשמל, או כרית חמה להגדיר ב37 ° C. הימנע מחימום יתר; התרחבות היקפית פשרות התאוששות של בעלי חיים. לפקח על העכבר באופן הדוק עד להחלמה מלאה.

6. מערכת המשולבת אנדוסקופי ניקוד של המעי הגס בריאות עם מזהים עשרוניים

1. השתמש בטופס הניקוד (איור 2) והגדרות הפרמטר להלן (אנדוסקופי הערכת Murine המעי הגס הדלקת וגידולים תוך שימוש במערכת עשרונית משוקללת ניקוד: הגדרות פרמטר, ופרוטוקול) עבורדוגמאות ו'מערכת דיסטלי-הפרוקסימלי אנדוסקופי קוליטיס הבקיע 'האופציונלי (D-שרירי חזה) כקווים מנחים להערכת nonbiased ותיעוד מפורט.
2. ציון ארבעה הפרמטרים של דלקת מעי גס שתוארו בטופס שיטת ניקוד (איור 2). בקפדנות להעריך את האזור פי הטבעת, שקיפות מעי, הסוג של מעיים דימום (אם קיימים), ונוכחות וכמות נגעי מוקד (סחף, כיבית, ו / או tumorous).
3. כאשר להערכת גידולים למטרות מחקר, בדוק את הכמות, המיקום והגודל, ולתאר אותם באמצעות המפה הגס וגרף עמודות בטופס הניקוד. הסכום המספרי של הציונים שהתקבלו ומספר הנגעים (כאשר רלוונטי) יקבע את דלקת רקע המעי הגס, סוג הדומיננטי ביותר של נגע, ואת מספר הנגעים.

תוצאות

הפרוטוקול והתמונות שהוצגו במחקר זה היו מוכנים עם אנדוסקופ אולימפוס URF-V גמיש ¹⁴ וNBI ^11,15. תמונות וידאו נשמרו בפורמט MPEG-2 ותמונות JPG, TIF, PNG, או פורמט DICOM עם 1,280 x 1,024 פיקסלים מרביים, להעברה לזכרונות ניידים פלאש USB סטנדרטיים. NBI משפר את הניגוד החזותי של רקמות המכיל המוגלובין. אור רגיל וההדמיה NBI הם תכונות עיקריות כדי להמחיש את האנטומיה התקינה של רירית המעי הגס ואת ההבדלים בין כלי דם נורמלים ולא נורמליים בכיב והתפתחות גידול (3A דמויות ו...

דיון

ישנם מספר שיקולים לגבי שינוי ופתרון בעיות של הטכניקה אנדוסקופית בעכברים. היבטים קריטיים של ההליך שצריך להיות שולטים בשימוש באנדוסקופיה גמישה כוללים התאמה של האוויר הדרוש כדי למנוע נפיחות בטנית ופשרה בדרכי הנשימה של עכבר הנפח, והיבטים טכניים קטין שליטה תצוגה עם תיאום של בקרות הזווית ומומנט . שליטת מומנט חשובה כדי למזער את הסיכון של ניקוב מעי. כאשר טיפל כראוי, אנדוסקופיה גמישה העכברית הופכת הליך בטוח מאוד, מהיר, המאפשר הדמיה ישירה ודגימת ביופסיה של אזורי מעיים של עניין מחקר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Isoflurane, USP	Webster חומר סיכה כירורגי וטרינרי
	מעבדות	פרא ניתוח, 0281-0205-45
פוספט חוצץ	מלח תרמו מדעי	SH30256
RNAlater	Ambion	AM7021
מתילן כחול 1% תמיסה מימית	פישר חינוך מדעי	S96393
אורטרוסקופ דיגיטלי גמיש	אולימפוס אמריקה	URF-V
מרכז מערכת וידאו	אולימפוס אמריקה	VISERA Pro OTV-S7 Pro
קסנון מקור אור	אולימפוס אמריקה	VISERA Pro CLV-S40 Pro
מקליט וידאו	MediCapture, Inc.	MediCap USB200
מלקחיים גמישים לביופסיה	אולימפוס אמריקה	FBC-3115
מכונת הרדמה	Euthanex Corporation	EZ-7000 מערכת