הדמיה של זרימה ציטופלזמית במהלך ריפוי פצע של תא בודד ב-Stentor coeruleus

סיכום

הריסנית הענקית Stentor coeruleus היא מערכת קלאסית לחקר התחדשות וריפוי פצעים בתאים בודדים. על ידי הדמיית תאי סטנטור בו זמנית בהגדלה נמוכה וגבוהה ניתן למדוד זרימות ציטופלזמיות לפני, במהלך ואחרי פציעה.

תקציר

למרות שלעתים קרובות מטפלים בריפוי פצעים ברמת רקמות שלמות, במקרים רבים תאים בודדים מסוגלים לרפא פצעים בתוך עצמם, ולתקן קרום תא שבור לפני שהתוכן התאי דולף החוצה. האורגניזם החד-תאי הענק Stentor coeruleus, שבו תאים יכולים להיות בגודל של יותר ממילימטר אחד, היה אורגניזם מודל קלאסי לחקר ריפוי פצעים בתאים בודדים. ניתן לחתוך תאי סטנטור לשניים ללא אובדן כדאיות, ואף ניתן לחתוך אותם ולהשתיל אותם יחד. אך הסובלנות הגבוהה הזו לחיתוך מעלה את השאלה מדוע הציטופלזמה לא פשוט זורמת החוצה מגודל החיתוך. כאן אנו מציגים שיטה לחיתוך תאי סטנטור תוך הדמיה של תנועת הציטופלזמה בקרבת החיתוך ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה. המפתח לשיטה שלנו הוא שימוש בתצורת מיקרוסקופ "דו-קומתי" בה הניתוח מבוצע תחת מיקרוסקופ מנתח הממוקד בתא הנצפה בו זמנית מלמטה ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם עדשת NA גבוהה. הגדרה זו מאפשרת רמה גבוהה של שליטה על ההליך הכירורגי תוך מתן אפשרות למעקב ברזולוציה גבוהה אחר ציטופלזמה.

מבוא

התחדשות וריפוי פצעים הם תהליכים ביולוגיים חשובים שהמנגנונים שלהם נשארים תחומי מחקר פעילים. ואכן, היכולת לרפא פצעים ולחדש חלקים פגומים היא אחת התכונות המבדילות יצורים חיים מחפצים דוממים. בדרך כלל, התחדשות נחשבת מתווכת על ידי התמיינות של תאי גזע לסוגי תאים שונים הדרושים לבנייה מחדש של חלק בעל חיים פגום או קטוע, בעוד שריפוי פצעים נתפס במונחים של תאים חדשים הפולשים לפצע כדי לבנות מחדש אפיתל שלם. לפיכך, נראה כי שני התהליכים מתווכים על ידי קולקטיבים של תאים בודדים, ולכן נראים כתהליכים רב-תאיים מובהקים. לכן זה מפתיע שתאים בודדים מסוגלים, במקרים מסוימים, לתקן פצעים ולחדש רכיבים שאבדו¹. ריפוי פצעים בתוך תאים בודדים יכול לכלול מספר מסלולים כולל התכווצות חוט ארנק אקטין-מיוזין סביב הפצע ותיקון הממברנה על ידי איחוי מהיר של שלפוחיות אקסוציטוטיות^1-3. אף על פי שסוגי תאים רבים מסוגלים לרפא פצעים ברמה מסוימת^4-6, אולי הדוגמה הדרמטית ביותר היא הריסנית הענקית Stentor coeruelus⁷, שמוצגת באיור 1. תאי סטנטור בודדים הם באורך 1 מ"מ, ומכוסים בשורות של ריסים. תאי סטנטור הם בצורת חרוט עם מנגנון אוראלי, המורכב מאלפי ריסים, בקצה אחד, ומבנה אחיזה צר בקצה השני. סטנטור היה אורגניזם מודל קלאסי לחקר התחדשות מכיוון שאם חלק כלשהו של התא נחתך, הוא יכול היה להתחדש⁷. לדוגמה, בסדרת ניסויים קלאסית, תומאס האנט מורגן⁸ הראה שניתן לחתוך תא סטנטור לשניים וכל חצי ייצר מחדש תא בעל פרופורציות נורמליות תוך שעות^ספורות. המסלולים המולקולריים האחראים להתחדשות בסטנטור נותרו לא ידועים לחלוטין.

היכולת של תאי סטנטור לשמש כמערכת מודל התחדשות מסתמכת על היכולת המדהימה של תאים אלה לרפא את עצמם לאחר שנחתכו. מדוע הציטופלזמה של תא סטנטור אינה דולפת החוצה כאשר התא נחתך? ריפוי פצעים אינו נובע מהתכווצות מיידית של קליפת התא, מכיוון שאפשר לקחת שני תאי סטנטור, לחתוך אותם ואז לחבר את שני התאים החתוכים יחד בתצורות שונות⁷. במהלך ניסויי השתלה כאלה, הציטופלזמה של שני התאים חייבת להישאר חשופה מכיוון שהיא מתמזגת כאשר התאים נדחפים זה לזה. איכשהו, הציטופלזמה חשופה מספיק למדיה שמסביב כדי לאפשר השתלה, אך עדיין היא לא זורמת החוצה מהתא. האם הציטופלזמה של סטנטור אלסטית מספיק שהיא פשוט לא יכולה לזרום החוצה גם כאשר נוצר חור גדול בקרום הפלזמה? האם תאים מגבירים את צמיגות הציטופלזמה באופן מקומי סביב פצע כדי למנוע מהציטופלזמה לזרום החוצה? ציטופלזמה היא חומר פעיל מורכב ביותר^9-11, ותגובת ריפוי הפצע של סטנטור מייצגת הזדמנות ייחודית לחקור זרימות ומכניקה ציטופלזמית במהלך ריפוי פצעים של תא בודד. עם זאת, השימוש בשיטות כירורגיות כדי לגרום לפציעה בסטנטור מהווה אתגר טכני. על מנת לחתוך תא באורך 1 מ"מ באמצעות מחטי זכוכית, הפרדיגמה הכירורגית הקונבנציונלית, יש צורך לפעול בהגדלה נמוכה עם מרחק עבודה ארוך. בתנאי הדמיה אלה, לא ניתן לעקוב אחר זרימת הציטופלזמה, וכל מה שניתן לקבוע הוא האם הציטופלזמה נשארת בתוך התא או לא. השאלה האמיתית שאנו רוצים לשאול היא כיצד התנועה והצמיגות של הציטופלזמה עשויות להשתנות במהלך החיתוך והריפוי. זה דורש הדמיה ברזולוציה גבוהה. כאן אנו מציגים התאמה של פרוטוקול טרטר לחיתוך סטנטור⁷ המאפשר לבצע את החיתוך באופטיקה בהגדלה נמוכה יותר כדי לראות את התא כולו תוך התבוננות בזרימת הציטופלזמה ברזולוציה גבוהה, מה שמאפשר להשתמש במערכת זו כפלטפורמה לחקר המנגנונים של ריפוי פצעים של תא בודד.

פרוטוקול

1. תרבית תאים ואיסוף

1. השג תאי Stentor coeruleus מבריכות טבעיות כמתואר על ידי טרטר⁷ או מספק מסחרי (ראה ריאגנטים).
2. שמור על תרבויות על ידי גידול בחושך בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס במדיום סטנטור שונה (MSM), המותאם ממתכונים שתוארו על ידי טרטר⁷ ודה טרה¹² המכילים 0.75 מ"מ Na₂CO₃, 0.15 מ"מ KHCO₃, 0.15 מ"מ NaNO₃, 0.15 מ"מ KH₂PO₄, 0.15 מ"מ MgSO₄, 0.5 מ"מ CaCl₂, ו-1.47 מ"מ NaCl.
3. השלם את מדיום ה-MSM עם מקור פחמן על ידי הוספת טרף חי למדיום. לגדל תרביות של מדיום Chlamydomonas reinhardtii TAP בשיטות גידול סטנדרטיות¹³. לפני ההאכלה יש לשטוף את תאי הכלמידומונס ב-MSM. האכילו 300 מ"ל תרביות סטנטור ~ 3 x 10⁷ תאי כלמידומונס 2-3x בשבוע.
4. אסוף תאי סטנטור לניתוח באמצעות פיפטה. סטנטור נוטה לעגן לתחתית ולדפנות צלחת התרבית וכך, על מנת לאסוף תאים, לעורר את התרבית על ידי בעבוע אוויר דרך קצה פיפטה עד שהתאים מתחילים להתנתק ולשחות בחופשיות.
5. לכוד תאי שחייה באמצעות פיפטה המצוידת בקצה רחב כדי למנוע גזירה של התאים.
6. שטפו תאים שנאספו ב-MSM טרי.

2. הכנת כלים למיקרוכירורגיה

1. החזק שני מוטות ערבוב זכוכית מעל מבער בונסן או להבה אחרת עד שהקצוות מתחילים להמיס.
2. גע בקצות שני המוטות יחד כך שהזכוכית המותכת תתמזג.
3. לאחר יצירת טיפה קטנה של זכוכית מותכת בין שני המוטות, הסר אותם מהלהבה, הניח להתקרר במשך 1-2 שניות ולאחר מכן הפריד אותם כדי ליצור הפסקה נקייה. באופן אידיאלי, הזכוכית תימשך החוצה לחוטים דקים ותישבר בצורה חלקה כאשר הזכוכית מתקררת וכתוצאה מכך מחט באורך של כ-1-2 ס"מ עם חוד דק בקצה (איור 2).
4. אם המחט המתקבלת אינה אופטימלית, הקצוות עלולים להישבר לפסולת זכוכית וניתן לעשות שימוש חוזר במוטות.

3. הרכבה של תאים למיקרו-כירורגיה ותצפית (ניתוח רגיל)

1. הכן תא מרובע עם קירות וזלין באמצעות חותמת גומי מרובעת המצופה בווזלין ונלחץ על כיסוי זכוכית.
2. הוסף MSM המכיל 2% מתיל צלולוז לריבוע הווזלין.
3. הנח את הכיסוי במתאם פלסטיק, המאפשר למקם את הכיסוי על מיקרוסקופ עם מחזיק שקופיות סטנדרטי (איור 3).
4. הוסף תאים שטופים משלב 1.6 ל-MSM בתוספת מתיל צלולוז כדי לעכב את התנועתיות של תאי הסטנטור כך שיישארו במקומם במהלך הניתוח.
5. סדר תאים במתיל צלולוז כך שהם יהיו מרווחים באופן שווה ונדחפים קרוב מספיק לפני השטח של החלקת הכיסוי כדי להיות ממוקדים במהלך ההדמיה.

4. הדמיה ברזולוציה גבוהה של ריפוי פצעים בסטנטור חי

כדי לדמות בו זמנית תא סטנטור ברזולוציה גבוהה תוך חיתוך כירורגי בהגדלה נמוכה, בנה מיקרוסקופ "דו-קומתי" עם סקופ חיתוך המחובר לראש העינית של הסקופ ההפוך כך שהוא ממוקד בחלק העליון של השקופית בעוד הסקופ ההפוך ממוקד מתחת לשקופית.

1. שים שקופית על הסקופ ההפוך (השתמש ב-Zeiss Axiovert 200M או ב-Olympus IX80).
2. הסר את גוף המיקרוסקופ המנתח מהמעמד שלו וקבע מיקום משוער מעל עינית המיקרוסקופ ההפוכה להצבת היקף חיתוך כדי לאפשר הדמיה של השקופית בהגדלה נמוכה.
3. שנה קופסת קרטון כך שתהיה בעובי זהה למרווח הרצוי בין ראש עינית היקף הפוך לטווח הניתוח, ולאחר מכן הדביק לתוך היקף הפוך באמצעות סרט מעבדה שניתן להסיר בקלות בסיום הניסוי. התאם את עובי הקופסה בהתאם לתצורה המדויקת של ראש העינית של המיקרוסקופ ההפוך ולפי גודל המיקרוסקופ המנתח, כך שהדגימה תהיה בשדה הראייה ללא צורך להזיז את היקף החיתוך לאחר חיבורו.
4. החזק את טווח החיתוך כנגד הקופסה, הזז אותו עד שהשקופית תהיה ממוקדת, ולאחר מכן הדבק שוב על הקופסה באמצעות סרט מעבדה. התצורה הסופית מוצגת באיור 4.
5. תאי תמונה באמצעות היקף הפוך באמצעות אופטיקה DIC ועדשת אובייקט אוויר פי 20. השתמש במעבה DIC למרחק עבודה ארוך כדי לספק מספיק מקום לביצוע המיקרו-כירורגיה מלמעלה.
6. קבל תמונות בקצב פריימים של 2 תמונות לשנייה באמצעות מצלמת CCD של 512 x 512.
7. התחל ברכישה לפני שמתחילים לחתוך את התאים כדי ללכוד את דפוס הזרימה הציטופלזמי הראשוני ולהתבונן בכל שלבי תהליך הפציעה וריפוי הפצעים.
8. הפסקת הרכישה כאשר התא חזר למראה תקין ו/או תנועתיות פעילה, על מנת לדמיין ולמדוד תנועות ציטופלזמיות לאורך תהליך ההתחדשות.

5. ניתוח זרימה ציטופלזמית במהלך ריפוי פצעים

מדוד זרימה ציטופלזמית באמצעות מהירות תמונת חלקיקים (PIV). טכניקה זו היא שגרתית בחקר דינמיקת זורמים, ויכולה ליצור שדות זרימה בהיעדר חלקיקים הניתנים למעקב בנפרד בנוזל. PIV שימש למדידת זרימות של ציטופלזמה על סמך הדמיית שלפוחיות תת-תאיות ותכונות אחרות הנראות בציטופלזמה על ידי מיקרוסקופ אור^{מועבר 14}.

1. הורד את PIVLab, חבילת MATLAB עבור PIV, מאתר האינטרנט http://pivlab.blogspot.com/.
2. טען את ערימת התמונות tiff עבור כל רצף וידאו לתוכנית PIV בתוך MATLAB.
3. צרו מסיכה ידנית לכל אוסף תמונות כדי להסוות אזורים של הנתונים הגולמיים מחוץ לגוף של Stentor.
4. הגדר את PIVLab להשתמש בהגדרת ההמרה המהירה של פורייה ובגודל סל של 64 x 64 פיקסלים, שיכניס את הפיקסלים בכל מסגרת לפיקסלים מרובעים גדולים יותר.
5. הפעל את PIVLab כדי לחשב מתאמים צולבים בין הפיקסלים בכל מסגרת עם פיקסלים סמוכים בפריים הבא כדי להניב וקטור זרימה תלוי זמן המרוכז בכל פיקסל מאוחסן, בעל רזולוציית זמן זהה לנתונים הגולמיים שלנו.
6. חשב ממוצעי זמן של פלט השדה הווקטורי המתקבל כדי ליצור קווי יעילות להשוואה בין נתונים שנלקחו עם ה-Stentor לפני החיתוך ובמהלך ריפוי הפצעים, וחשב היסטוגרמות של מהירויות זרימה (כדי לחקור את חוזק הזרימה) ושינוי המהירות בפיקסל נתון לאורך זמן (כדי לחקור תנודות זרימה).
7. עבור רצפי תמונה עם סטנטור חצוי לשניים וציטופלזמה דולפת באופן גלוי למאגר שמסביב, חשב את השטף הכולל של ציטופלזמה בחזרה לגוף התא הנכון על ידי הכפלת מהירות הזרימה הממוצעת בשטח החתך של בסיס הבועה החוץ-תאית של הציטופלזמה.

תוצאות

באמצעות הפרוטוקולים שתוארו לעיל, נמצא כי הציטופלזמה של סטנטור דינמית להפליא, הן לפני החיתוך והן אחריו. סרטון 1 מציג את הזרימה הנרחבת של ציטופלזמה הקיימת בתאים לא חתוכים. למרות הציפייה המקורית שלנו שיכולתו של סטנטור לשרוד את החיתוך תהיה כרוכה בהתקשות או ג'ל של ציטופלזמה, למעשה כאשר תאי סטנטור נחתכים באלימות מספקת כדי למשוך את הציטופלזמה החוצה מהתא, הציטופלזמה נשארת דינמית מאוד ומצליחה לזרום בחזרה לתא בצורה מכוונת מאוד (וידאו 2).

בנוסף להדגמת דרגה של תנועה ציטופלזמית שלא נחשדה בעבר במהלך ריפוי הפצע, ניתן להשתמש ברזולוציה הגבוהה של ההדמיה בבדיקה כדי לכמת את קצבי הזרימה באמצעות מהירות תמונת חלקיקים. היכולת לבצע מדידות כאלה תאפשר בדיקה קפדנית של השפעת מעכבים כימיים.

איור 1. מורפולוגיה של תא סטנטור חי. תמונת שדה אפל של תא סטנטור חי שהוזן בכלמידומונס כמתואר בנוהל 1.3, הנראה כחומר ירוק בתוך ואקואולים של מזון. המנגנון האוראלי שדרכו התא אוכל נראה כשפת ריסים בחלק העליון של התמונה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2. הכנת מחט זכוכית לניתוח. (A) המחט נשלפת מקצה מוט זכוכית מוצק. (B) מבט בהגדלה גבוהה של קצה המחט שמציין את האורך והחדות הדרושים לניתוח. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3. מחזיק כיסוי מותאם אישית למיקרו-כירורגיה. על מנת לאפשר גישה פתוחה לניתוח תוך מתן תנאי הדמיה אופטימליים, התאים מותקנים על כיסוי ולא על מגלשת כיתה עבה. על מנת לאפשר לכיסוי להתאים לשלב המיקרוסקופ ניתן לייצר מחזיק פלסטיק באמצעות מדפסת תלת מימד. למחזיק יש מידות זהות לשקופית מיקרוסקופ רגילה בעוד שהשקע באמצע תואם את מידות הכיסוי. חור בפינה אחת מאפשר להוציא את הכיסוי מהמחזיק. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 4. תצורת מיקרוסקופ דו-קומתי. ראש מיקרוסקופ מנתח מותקן על גבי ראש העינית של מיקרוסקופ הפוך. סרט מעבדה מאפשר להרכיב ולפרק את המכשיר במהירות עם השלמת הניסוי. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

וידאו 1. דוגמה לזרימה ציטופלזמית שנצפתה בתא סטנטור חי. תא מצולם עם אובייקט פי 10 עם אופטיקה של שדה כהה בקצב של 2 פריימים לשנייה.

וידאו 2. אנימדמיין תא סטנטור כשהוא נחתך ומשובש עם מחט זכוכית. לאחר החיתוך נשלפה כמות משמעותית של ציטופלזמה מגוף התא הראשי, אך היא זורמת במהירות חזרה לתא.

דיון

היישום החשוב ביותר של שיטה זו יהיה להשתמש בה כדי לקבוע את המסלולים המולקולריים המווסתים את הזרימה הציטופלזמית במהלך ריפוי פצעים בסטנטור. קיים מגוון רחב של מעכבים כימיים המכוונים לחלבונים מוטוריים כמו גם לרכיבים של השלד הציטולוגי. מעכבי איתות סידן יהיו גם מועמדים סבירים. כמו כן, יהיה מעניין להסיר או להפחית את גרגירי הפיגמנט (אקסטרוזומים) המכילים את הפיגמנט הכחול סטנטורין, ששחרורו מהתא מופעל תחת לחץ, ולשאול כיצד השחרור האקסוציטוטי של סטנטורין עשוי להשפיע על זרימת הציטופלזמה הסמוכה. ניתן לרוקן את הפיגמנט באמצעות טיפול הלבנה פשוט¹⁵ שניתן לעשות ממש לפני החיתוך. לא נראה שיש דרך פשוטה לבצע את בדיקת ריפוי הפצע בצורה מקבילה מכיוון שצריך לחתוך ולדמות את התאים אחד בכל פעם. לפיכך, באמצעות מיקרוסקופ יחיד, ניתן יהיה לנתח ולמדוד תאים בקצב של בערך 1 ל-0.5 שעה, כך שבמהלך יום עבודה בודד אמור להיות אפשרי להשיג מספיק נקודות נתונים עבור תרכובת בודדת כדי לקבוע אם יש לה השפעה מובהקת סטטיסטית על התהליך. בעוד שהשיטה אינה אפוא בשום מובן תפוקה גבוהה, יהיה אפשרי לחלוטין לסנן קבוצה נבחרת של תרכובות מועמדות ספציפיות לכמה מסלולי מטרה שנבחרו בקפידה.

מגבלה עיקרית של הגישה הנוכחית היא השיטה הגסה יחסית להרכבת המיקרוסקופ הדו-קומתי. בהנחה שהמיקרוסקופ ההפוך המשמש להדמיה הוא מכשיר לשימוש כללי שעובדים אחרים צריכים להשתמש בו למטרות אחרות, שיקול חשוב הוא הקלות שבה ניתן לפרק ולהרכיב מחדש את המכשיר. בעוד שהשיטה הנוכחית המשתמשת בסרט מעבדה היא אכן מהירה ומפורקת בקלות, היא דורשת יישור קפדני על ידי המשתמש במהלך ההרכבה בכל פעם. שינוי חשוב יהיה אפוא בניית מחזיק נשלף מותאם אישית עם חריצים לראש העינית של הסקופ ההפוך ולגוף משקף הניתוח. זה אמור להיות קל לייצור באמצעות טכנולוגיית מדפסת תלת מימד מודרנית.

מגבלה שנייה של הגישה היא ההסתמכות על הדמיית DIC של אברונים תוך-תאיים כסמני זרימה. מכיוון שזהותם של אברונים אלה שנצפו במיקרוסקופ אינה ידועה כיום, לא ניתן לדעת את גודלם או את האינטראקציות הפוטנציאליות שלהם עם רכיבים תאיים אחרים. לכן זה עשוי להיות יתרון להזריק עוקבים חיצוניים כגון חרוזים פלואורסצנטיים ולהשתמש בהם כדי לעקוב אחר הזרימה. עם זאת, זה ידרוש שלב נוסף - מיקרו-הזרקה - לפני שניתן יהיה לבצע את הניסוי, ובכך להאט עוד יותר את הבדיקה.

מגבלת המפתח הסופית היא ההסתמכות על מישור תמונה יחיד לרכישת נתונים. החשיבות העיקרית של בדיקה זו היא שהיא חורגת מסתם לשאול אם פצע נרפא או לא, ומאפשרת לקבל ניתוח מפורט של דפוס הזרימה. בהקשר זה, יהיה חשוב ביותר להרחיב את ההדמיה להדמיה תלת מימדית. השיטה הנוכחית מצלמת מישור מוקד יחיד ולכן כאשר מבוצע ניתוח PIV, התוצאה היא פרוסה דרך שדה הזרימה התלת מימדי המלא. זה אינפורמטיבי אבל לא שלם. על ידי רכישת תמונות תלת מימד בכל שלב זמן, אמור להיות אפשרי להשיג שדה זרימה תלת מימדי מלא. זה יהיה קריטי במיוחד להתבוננות כיצד בדיוק הציטופלזמה נעה בסביבה הקרובה של אתר הפצע.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Stentor coeruleus תרבית חיה	Carolina Biological 131598
Methyl Cellulose, 1,500 cP	Sigma	M0387
ציוד:
שם החומר שם	החברה	מספר
ערבוב זכוכית רכה 5 בארוכה	פישר סיינטיפיק	11-380A
צלחת תרבות 4.5 ב-250 מ"ל  זכוכית	קרוליינה ביולוגית	741004
IX81 מיקרוסקופ הפוך	אולימפוס
Axiovert 200M מיקרוסקופ הפוך	Zeiss
Stemi 2000 מיקרוסקופ סטריאו	Zeiss
Evolve 512 x 512 EMCCD מצלמה	פוטומטרית
תוכנית Apo 20X אובייקטיבי	אולימפוס	UPLSAPO