מאמר שיטה

הקמת הריכוז החיידקי המינימלי של סוכן מיקרוביאלית לתאים פלנקטוניים (MBC-P) ותאי ביופילם (MBC-B)

DOI:

10.3791/50854

⸱

2 בינואר 2014

1Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מאפשר השוואה ישירה בין התנגדות פלנקטונית וביופילם לזן חיידקי שיכול ליצור ביופילם במבחנה באמצעות צלחת מיקרוטיטר 96 באר. חיידקי פלנקטוניים או ביופילם נחשפים לדילול סדרתי של הסוכן האנטי-מיקרוביאלי המועדף. הכדאיות נפגעת על ידי צמיחה על צלחות אגר.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מאפשר השוואה ישירה בין התנגדות פלנקטונית וביופילם לזן חיידקי שיכול ליצור ביופילם במבחנה. חיידקים מחוסנים לתוך בארות של צלחת מיקרוטיטר 96-היטב. במקרה של בדיקה פלנקטונית, דילול סדרתי של הסוכן מיקרוביאלית של בחירה מתווספים השעיות חיידקים. ב biofilm assay, פעם מחוסן, החיידקים נשארים ליצור biofilm על פני תקופה מוגדרת של זמן. תאים לא מחוברים מוסרים מן הבארות, התקשורת מתחדשת ודילול סדרתי של הסוכן מיקרוביאלית של בחירה מתווספים. לאחר חשיפה לסוכן מיקרוביאלית, התאים הפלנקטוניים הם assayed לצמיחה. עבור מבחני הביופילם, התקשורת מתרעננת עם מדיה טרייה חסרה את הסוכן מיקרוביאלית ותאי הביופילם נשארים להתאושש. הכדאיות של תאי הביופילם מתבצעת לאחר תקופת ההחלמה. MBC-P עבור הסוכן מיקרוביאלית מוגדר כריכוז הנמוך ביותר של סמים שהורג את התאים בתרבות הפלנקטונית.  לעומת זאת, MBC-B עבור זן נקבע על ידי חשיפת biofilms מעוצבים מראש לריכוזים הולכים וגדלים של חומר מיקרוביאלית במשך 24 שעות. MBC-B מוגדר כריכוז הנמוך ביותר של חומר מיקרוביאלית שהורג את התאים בביופילם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחני עמידות לאנטיביוטיקה פותחו בתחילה כדי לנסות עמידות של תרבויות פלנקטוניות (שחייה חופשית) של חיידקים. מכיוון שזיהומים חיידקיים רבים כרוכים בביופילמים (תאים המחוברים לפני השטח), התעניינו בפיתוח שיטה לעמידות לאנטיביוטיקה ספציפית לביופילם. עם זאת, רוב מבחני עמידות לאנטיביוטיקה אינם מתאימים למדידת ההתנגדות של biofilms. לדוגמה, קביעת הריכוז המעכב המינימלי (MIC) הוא תקן הזהב לקביעת עמידות לאנטיביוטיקה של תרביות חיידקים פלנקטוניים 1. זה assay כרוך ערבוב תרבות פלנקטונית מדוללת עם סדרת דילול של אנטיביוטיקה.  ריכוז האנטיביוטיקה המעכבת את הצמיחה הנראית לעין של התאים הפלנקטוניים הוא ה- MIC. מאז בדיקה זו מסתמכת על עיכוב של צמיחה, מעצם הגדרתו, זה לא יכול לעבוד עם תרביות biofilm, אשר דורש בחינת הרגישות האנטיביוטית של תאים בביופילם גדל מראש. במקום למדוד עיכוב גדילה, מבחני MBC-B המתוארים כאן קובעים את ריכוז האנטיביוטיקה שהורג תאים שכבר קיימים בביופילם. לכן, זו assay שואפת לחקות טיפולים אנטיביוטיים של זיהומים biofilm הוקמה, ולספק תצוגה רלוונטית יותר של עמידות לאנטיביוטיקה חיידקי vivo.

מאז biofilms הם בדרך כלל עמידים יותר לאנטיביוטיקה מאשר תרבויות פלנקטוניות 2-4 , היה צורך לתכנן שיטה המקשרת ישירות את עמידות לאנטיביוטיקה של biofilm לזה של תרבות פלנקטונית. לכן מטרה נוספת של שיטה זו היא להיות מסוגל להשוות ישירות את רמת עמידות לאנטיביוטיקה בין תאים פלנקטוניים וביופילם. מבחני MBC-P ו- MBC-B המתוארים כאן מאפשרים זאת מכיוון שהתאים מתרבתים בתנאים דומים. השתמשנו בשיטה זו כדי לחקור מספר גנים חשובים לעמידות לאנטיביוטיקה ספציפית לביופילם 5-8 .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. MBC-B

  1. גידול ביופילם (מותאם מאוטול9).
    1. לגדל תרבות של זן סוג פראי של עניין זן מוטציה במשך 16 שעות במדיום עשיר ב 37 °C (69 °F).
    2. לדלל את תרבויות לילה רווי 1:100 לתוך מדיום טרי עבור בדיקות עמידות לאנטיביוטיקה. מדיום סטנדרטי עבור P. aeruginosa הוא M63 בינוני מינימלי בתוספת מגנזיום גופרתי ארגינין (ראה טבלה 1). מדיום זה מגרה היווצרות של ביופילם חזק יותר.
    3. מוסיפים 100 מיקרוליטר מהדילול לבאר בצלחת מיקרוטיטר של 96 באר (ראו טבלה 1). מאז מבחנים אלה מבוצעים בדרך כלל משולש עבור כל זן, צריך להיות 24 בארות של כל זן.
    4. דגירה צלחת microtiter במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. חשיפת הביופילם בעל המבנה הקדם-מעוצב לשיפוע ריכוזי של אנטיביוטיקה
    1. הכן סדרה 10x דילול של אנטיביוטיקה עבור 7 בארות. דוגמה: עבור אנטיביוטיקה tobramycin, הריכוזים הסופיים בבארות הם 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125, ו 0.006 מ"ג / מיליליטר 5-8 . מתוך מלאי של 25 מ"ג / מ"ל, להכין 10x דילול של 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, ו 0.06 מ"ג / מיליליטר. תשאירו על הקרח.
    2. הסר את supernatant בילה (המכיל תאים פלנקטוניים) באמצעות פיפטה רב ערוצית (ראה טבלה 1).
    3. הוסף 90 μl M63 (Mg / Arg) לכל בארות.
    4. הוסף 10 μl של כל ריכוז אנטיביוטי 10x על מנת להשיג את הריכוזים הסופי הרצוי. הוסף 10 מים μl (ללא שליטה באנטיביוטיקה) לבאר הסופית עבור כל שכפול ומתח.
    5. דגירה צלחת microtiter במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
  3. רענון המדיה ומתן אפשרות לניתוק תאים חיים.
    1. הסר את supernatant בילה (המכיל תאים פלנקטוניים) באמצעות פיפטה רב ערוצית.
    2. הוסף 115 μl M63 (Mg / Arg) לכל בארות.
    3. דגירה צלחת microtiter במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
  4. מבחנים לתאים חיים.
    1. תווית שתי צלחות אגר LB לכל צלחת microtiter 96-גם.
    2. לעקר את המכשיר multiprong (ראה טבלה 1)על ידי טבילת שיניים 100% אתנול והעברת שיניים על פני הלהבה הפתוחה של מבער Bunsen. חוזר. תן לשיניים להתקרר מעט. באמצעות המכשיר multiprong, להעביר ~ 3 μl (סכום זה נשמר בדרך כלל על קצות השיניים) של תרבות פלנקטונית מכל באר של צלחת microtiter אל פני השטח של צלחת אגר LB.
    3. דגירה צלחות אגר LB במשך 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
    4. לקבוע ריכוז בקטריצילי מינימלי של האנטיביוטיקה על ידי זיהוי, לפי עין, את הניתוק לצמיחת חיידקים (איור 1).

2. MBC-P

  1. הכנת זנים חיידקיים
    1. לגדל תרבות של זן סוג פראי של עניין זן מוטציה במשך 16 שעות במדיום עשיר ב 37 °C (69 °F).
    2. לדלל את תרבויות לילה רווי 1:100 לתוך מדיום טרי עבור בדיקות עמידות לאנטיביוטיקה. מדיום סטנדרטי עבור P. aeruginosa הוא M63 בינוני מינימלי בתוספת מגנזיום גופרתי ארגינין (ראה טבלה 1).
    3. הוסף 90 μl של דילול לבאר בצלחת microtiter 96-היטב (ראה טבלה 1). מאז מבחנים אלה מבוצעים בדרך כלל משולש עבור כל זן, צריך להיות 24 בארות של כל זן.
  2. חשיפת תאים פלנקטוניים לשיפוע ריכוז של אנטיביוטיקה
    1. הכן סדרת דילול 10x של אנטיביוטיקה עבור 7 בארות. דוגמה: עבור אנטיביוטיקה tobramycin, הריכוזים הסופיים בבארות הם 0.032, 0.016, 0.008, 0.004, 0.002, 0.001, ו 0.0005 מ"ג / מיליליטר. מתוך מלאי של 25 מ"ג / מ"ל, להכין דילול של 0.32, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02, 0.01, ו 0.005 מ"ג / מיליליטר. תשאירו על הקרח.
    2. הוסף 10 μl של כל ריכוז אנטיביוטי 10x על מנת להשיג את הריכוזים הסופי הרצוי. הוסף 10 מים μl (ללא שליטה באנטיביוטיקה) לבאר הסופית עבור כל שכפול ומתח.
    3. דגירה צלחת microtiter במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
  3. מבחנים לתאים חיים.
    1. תווית שתי צלחות אגר LB לכל צלחת microtiter 96-גם.
    2. לעקר את המכשיר multiprong (ראה טבלה 1)על ידי טבילת שיניים 100% אתנול והעברת שיניים על פני הלהבה הפתוחה של מבער Bunsen. חוזר. תן לשיניים להתקרר מעט. באמצעות המכשיר multiprong, להעביר ~ 3 μl (סכום זה נשמר בדרך כלל על קצות השיניים) של תרבות פלנקטונית מכל באר של צלחת microtiter אל פני השטח של צלחת אגר LB.
    3. דגירה צלחות אגר LB במשך 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
    4. לקבוע ריכוז בקטריצילי מינימלי של האנטיביוטיקה על ידי זיהוי, לפי עין, את החתך לצמיחת חיידקים (איור 2).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחני MBC-P ו- MBC-B בוצעו, והשוו את הרגישות של סוג הפרא PA14 עם PA14 ∆ndvB. טוברמיצין שימש כאנטיביוטיקה. מוצגות תוצאות המתאימות לשלב 1.4.4 (איור 1) ולצעד 2.3.4 (איור 2). PA14 ו- ∆ndvB חוסנו לתוך מבחני MBC-P ו- MBC-B המשולש. לאחר השלמת שלבים 1.0-1.4 של פרוטוקול MBC-B ושלבים 2.0-2.3 של פרוטוקול MBC-P, התאים קיימא היו מצופים על צלחת אגר LB. ריכוזים של tobramycin(μg /ml) מסומנים בצד שמאל של התאים. MBC-B עבור PA14 הוא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עמידות לאנטיביוטיקה בתאים פלנקטוניים מוגדרת כעלייה בריכוז המעכב המינימלי (MIC) של אנטיביוטיקה עקב שינוי קבוע בתאים (למשל מוטציה). המנגנונים של התנגדות או סובלנות ספציפיים לביופילם שזוהו עד כה הם תוצאה של ביטוי של גנים מסוג בר בתוך biofilms. לפיכך, ההגדרה הקלאסית של התנגדות אינה חלה על ביופילמים. עם זאת, קבוצה נוספת של הגדרות הוצגה: מנגנוני התנגדות למנוע את האנטיביוטיקה גישה ליעדה, בעוד מנגנוני סובלנות לסגור את המטרות שלאנטיביוטיקה 10. מנגנוני עמידות לאנטיביוטיקה ספציפיים לביופילם מקיפים את שתי ההגדרות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברת מצהירה כי אין לה אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחבר רוצה להודות ללי ג'אנג, שיאן-ג'י לי, אהרון הינץ ואולם קלייטון על העזרה הערכית בכתב היד הזה. מבחנים אלה פותחו בתחילה במעבדתו של ג'ורג' אוטול, בית הספר לרפואה גייזל בדארטמות'. המחקר במעבדתו של ד"ר מאה נתמך על ידי מענקים ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה וסיסטיק פיברוזיס קנדה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<עמ>1x  M63

הכנה כ-5x  מלאי M63 על ידי המסה של 15 גרם KH2PO4, 35g K2HPO4 ו-10g (NH4)2SO4 ב-1 ליטר מים. אין צורך בחיטוי מלאי זה וניתן לאחסן אותו בטמפרטורת החדר. לדלל פי 5  מלאי 1:5, חיטוי, קירור, ואז הוסף את הרכיבים הרצויים.

KH2PO4

Fisher

P285-500

>

K2HPO4

פישר

P288-500

(NH4)2SO4

Sigma

A5132

מגנזיום גופרתי

פישר

M63-500

הוסף לריכוז סופי של 1 מ"מ.  יש להכין כציר של 1 מיליון במים ובחיטוי.

Tobramycin

Sigma

מכינים 50 מ"ג/m  מניות. Aliquot ואחסן בכתובת -20°C.

ארגינין

סיגמא

A5131

הוסף ל-0.4% ריכוז סופי.  הכינו כציר של 20% במים ומסננים לעקר.  מקור פחמן/אנרגיה חלופי זה יכול להחליף גלוקוז וחומצות קסאמינו

96-well microtiter plates

Corning

3595

סטרילי, תחתית שטוחה, אידוי נמוך

Tranferpette (פיפטה רב-ערוצית)

BrandTech

2703610

8-channel, 20-200 μ l

Multiprong device

Dan-Kar

MC48

48 משתלבים ב-½ של צלחת מיקרוטיטר של 96 בארות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard-eighth edition. , Ninth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2009).
  2. Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
  3. Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
  4. Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
  5. Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
  6. Zhang, L., Mah, T. F. The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics. J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).
  7. Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance. J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).
  8. Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
  9. O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437(2011).
  10. Lewis, K. Multidrug tolerance of biofilms and persister cells. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).
  11. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement. 31, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2011).
  12. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and Analyzing Static Biofilms. Curr. Protoc. Microbiol. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.1.1-1B.1.17 (2005).
  13. Ramey, B. E., Parsek, M. R. Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters. Curr. Protoc. Microbiol. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.3.1-1B.3.14 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

96LB

מאמרים קשורים