הפעלה של שלט מגנטי של בדיקות מיקרומטר<em&gt; באתר</em&gt; 3D מיפוי של תכונות פיסיקליות biofilm חיידקים

סיכום

מאמר זה מציג את המתודולוגיה מקורית המבוססת על actuation מרחוק של חלקיקים מגנטיים זורעים בbiofilm חיידקים וההתפתחות של פינצטה המגנטית ייעודית למדידה באתרו את התכונות מכאניות המקומיות של החומר החי המורכב שנבנה על ידי מיקרו אורגניזמים בממשקים.

תקציר

הידבקות חיידקים וצמיחה בממשקים להוביל להיווצרות של biofilms מבנים הטרוגנית תלת ממדים שנקרא. תאי מגורים במבנים אלה מוחזקים יחד על ידי אינטראקציות פיזיות מתווכות על ידי רשת של חומרים פולימריים תאיים. biofilms חיידקים להשפיע על פעילות אנושית רבות וההבנה של המאפיינים שלהם היא קריטית לשליטה טובה יותר של ההתפתחות שלהם - תחזוקה או חיסול - תלוי בתוצאה השלילית או חיובית שלהם. מאמר זה מתאר מתודולוגיה חדשנית במטרה למדוד באתרו את התכונות פיזיות המקומיות של biofilm שהיה, עד עכשיו, בדק רק מבחינה חומרית מקרוסקופית והומוגנית. הניסוי המתואר כאן כרוך בהחדרת חלקיקים מגנטיים לbiofilm גדל זרע בדיקות מקומיות שיכול להיות מופעלים מרחוק מבלי להפריע את המאפיינים המבניים של biofilm. פינצטה המגנטית ייעודי היתה developed להפעיל כוח מוגדר על כל חלקיק המוטבע בbiofilm. ההתקנה היא רכוב על הבמה של מיקרוסקופ כדי לאפשר ההקלטה של ​​תמונות של התקופה מושך חלקיקי זמן לשגות. אז מסלולי החלקיקים המחולצים הרצף מושך ופרמטרי viscoelastic המקומיים נגזרים מכל עקומת עקירת חלקיקים, וכך לספק את הפצת 3D-המרחבי של הפרמטרים. השגת תובנות הפרופיל המכני biofilm הוא חיוני מנקודת המבט של מהנדס למטרות בקרת biofilm, אלא גם מנקודת מבט בסיסית כדי להבהיר את הקשר בין המאפיינים האדריכליים והביולוגיה הספציפית של מבנים אלה.

מבוא

biofilms חיידקים הם קהילות של חיידקים הקשורים למשטחים ביולוגיים או מלאכותיים ^1-3. הם יוצרים על ידי מנגנון הידבקות צמיחה בשילוב עם הייצור של תאי מטריקס פוליסכריד עשיר שמגן ומייצב את המבנה ^4,5. biofilms אלה אינם מכלולים פשוט פסיביים של תאים נדבקו למשטחים, אבל מאורגן ומערכות ביולוגיות מורכבות דינמיות. כאשר חיידקים לעבור מפלנקטון לאורח החיים biofilm, שינויים בביטוי גנים ופיזיולוגיה של תאים הם נצפו, כמו גם התנגדות מוגברת לantimicrobials ולארח הגנה חיסונית להיות במקור של זיהומים מתמשכים וכרוניים רבים ^6. עם זאת, הפיתוח המבוקר של מבני חיים אלה מציעים גם הזדמנויות ליישומים תעשייתיים וסביבתיים, כגון bioremediation של אתרי פסולת מסוכנים, ביו סינון של מים או היווצרות של ביו מחסומים כדי להגן על קרקע ומי תהום מcontamin תעשייתייםation.

בעוד תכונות מולקולריות ספציפיות לדרך biofilm החיים מתוארות יותר ויותר, את המנגנונים המניעים את התפתחות הקהילה והתמדה עדיין אינם ברורים. שימוש בהתקדמות שחלה באחרונה במדידות microscale באמצעות אלקטרוכימיים סריקה או מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ארגוני חיים אלה הוכחו תערוכה ניכרת מבני, כימי וביולוגית ההטרוגניות ^7. עם זאת, עד עכשיו, מכניקת biofilm נבדק בעיקר macroscopically. למשל, התבוננות בסרטי biofilm עיוות עקב שינויים בשיעורי זרימת נוזל ^8,9, דחיסת uniaxial של חתיכות biofilm להרים ממדיום אגר או גדלה על הכיסוי מחליק ^10,11, גזירה של biofilm שנאסף מהסביבה ולאחר מכן הועבר למקביל rheometer צלחת ^12,13, ספקטרוסקופיה כוח אטומי באמצעות חרוז זכוכית ומצופה עם biofilm חיידקים מצורפים AFM שלוחה ¹⁴ או MICR ייעודישיטת ocantilever למדידת חוזק המתיחה של שברי biofilm מנותקים ^15,16 יושמו במהלך עשר השנים האחרונות, ומספקת מידע שימושי על טבע viscoelastic של החומר ^17. עם זאת, סביר להניח שמידע על תכונות מכאניות biofilm אתרו הולך לאיבוד כאשר החומר מוסר מהסביבה המקורית שלו, שהייתה קורים לעתים קרובות בגישות אלה. יתר על כן, הטיפול של biofilm כחומר הומוגני מחמיץ את המידע על ההטרוגניות האפשרית של התכונות פיזיות בקהילה. לכן, ההשלכות של מכניקת המבנה בהיווצרות biofilm ותכונות ביולוגיות כגון דפוסים ביטוי גנים או הדרגתיים כימי המדויקות בקושי יכולות להיות מוכרות. כדי להתקדם לכיוון תיאור microscale של התכונות פיזיות biofilm, כלים ייעודיים חדשים נדרשים.

מאמר זה מפרט את הגישה מקורית יזום כדי להשיגמדידה של פרמטרים מקומיים מכאניים באתר, מבלי להפריע את biofilm ומאפשר ציור של הפריסה המרחבית של תכונות חומר microscale ולאחר מכן ההטרוגניות מכאנית. העיקרון של הניסוי נשען על הסימום של biofilm גדל עם microparticles המגנטי ואחרי הטעינה מרחוק שלהם באמצעות פינצטה מגנטית בbiofilm הבוגר. עקירת חלקיקים תחת יישום כוח מגנטי מבוקר צילם מתחת למיקרוסקופ מאפשרת גזירת פרמטר viscoelastic מקומית, כל חלקיק דיווח הסביבה המקומית משלה. מתוך נתונים אלה, הפרופיל המכני 3D של biofilm ניתן להסיק, חושף dependences מצב מרחבית וסביבתי. כל הניסוי תוכלו לראות כאן על E. biofilm coli שנעשה על ידי זן מהונדס גנטי נושא פלסמיד כמו F-derepressed. התוצאות מפורטות במאמר האחרון ¹⁸ מספקות חזון ייחודי של הפנים של מכניקת biofilm ללא פגע.

פרוטוקול

1. חיידקי תרבות והכנת השעיה

1. פיק מושבה גדלה טרי מצלחת אגר Lysogeny מרק (LB), לחסן אותו ב 5 מיליליטר מדיום LB נוזלי המכיל 100 גר '/ מיליליטר אמפיצילין μ ו7.5 גר' / מיליליטר טטרציקלין μ ודגירה אותו במשך 5 עד 6 שעות ב 37 ° C ב רועד פלטפורמה.
2. לאחר מכן, להוסיף 100 l μ של תרבות החיידקים ב5 מיליליטר בינוני מינימום (M63B1) בתוספת גלוקוז 0.4% ואותם ריכוזי האנטיביוטיקה. דגירה לילה תרבות טרי בדילול זה על 37 מעלות צלזיוס על פלטפורמה רועדת.
3. לאחר 16 שעות של דגירה, להוסיף 100 μl תרבות הלילה עד 5 מיליליטר M63B1, גלוקוז 0.4%. שמור את הצינור על 37 C ° לפלטפורמה הרועדת עד 0.5 OD הוא הגיע. ההשעיה היא אז מוכנה להזרקה לתוך תעלת הניסוי ליצירת biofilm.

2. הכנת חלקיקים מגנטית

1. קח 10 חלקיקים מגנטיים μl -2.8 μ מ 'קוטר - מהמניות ולשטוף אותם פי 3 ב190 בינוני מינימום μl בעזרת מתלה מדגם מגנטי.
2. התאם את ריכוז חלקיקים ל5 x 10 ⁶ מיליליטר / חרוזים. בדרך כלל 50 μl של הפתרון חרוז שטף מעורבב עם l 950 μ נוסף של M63B1 עם גלוקוז 0.4%.

3. ערוץ הכנה וBiofilm צמיחה

1. השמה ערוץ
   1. חותך שתי נימי הזכוכית בורוסיליקט מרובעות (800 מ μ אורך צד) 10 סנטימטר ארוכה כדי להשיג חתיכות ארוכות שני 8 סנטימטר.
   2. מדביקים את שני חתיכות נימים בשתי שקופיות זכוכית - לחתוך במחצית ראשונה - מלבד 2 סנטימטר עם הסככה 1 סנטימטר בכל צד כמו באיור 1 באמצעות דבק הפועל במהירות cyanoacrylate (מה שנקרא סופר דבק).
   3. החיטוי וההתקנה כל צינורות הנדרשים לחיבור ערוץ נוסף.
   4. אסוף את כל החומרים סטריליים תחתזרימה למינרית: i) את הערוץ ומלכודת 1 הרכובים, ii) צינורות ומחברים, iii) שתי מלכודות בועה - מסנן הבועה נפוץ המשמש לאבטחה של ילדי האכלת טפטוף (מלכודת 1) ואת מלכודת בועת תוצרת הבית כצינור ארוך 4 סנטימטר בקוטר גדול יותר (מלכודת 2), ד) מהדק, v) 30 מיליליטר מזרקים מלאים בM63B1, גלוקוז 0.4%, וצמי) בקבוק פסולת.
   5. חברו את כל ההתקנה עם connecters Luer נעילה או צמתים לפי הסדר הבא: 50 מיליליטר נשלט על ידי משאבת המזרק, מסנן בועת ילדים, מלכודת בועת תוצרת בית, נימים (איור 1, לוח ב '), והצינור לבקבוק פסולת M63B1 המזרק. ואז למלא את ההתקנה עם M63B1 סטרילי, גלוקוז 0.4%, הפעלת משאבת המזרק בשיעור של כ -10 מיליליטר / שעה, גבוהה יותר מהשיעורים הניסיוניים. לעקוב בזהירות ולחסל את כל הבועות במעגל.
   6. זרימה בינונית באמצעות מערכת ל10-15 דקות; במקביל לערבב 1 מיליליטר של ההשעיה החיידקים ב0.5 OD מסעיף1.3 עם 1 מיליליטר של הפתרון חרוז שטף הכין בסעיף 2.2.
   7. צרף (אבל לא לסגור) מהדק לצינורות בשתי עמדות: לפני ואחרי את נימי הדם. לעבור את הזרימה כבויה.
   8. להציג את תערובת חיידקי החרוז לתוך הנימים לאחר מלכודת בועת תוצרת הבית באמצעות מזרק 1 מיליליטר, מקפיד להחזיק את הצינור מסתיים למניעת כניסת אוויר. לצרף מחדש את הצינור ולאחר מכן לסגור את מהדק.
   9. חזור על אותו ההליך לנימים השניה וסמן את כל הצינורות לבועות.
   10. העבר את המכשיר למיקרוסקופ ולאפשר לו לעמוד על 15-20 דקות כדי לאפשר לחיידקים להתיישב ולצרף אל פני השטח של הנימים. התקן את הנימים לבמה מיקרוסקופ עם מיכל הפסולת ברמה מעט גבוהה יותר. מקם את משאבת המזרק על גבי הדלפק ליד מיקרוסקופ. לרומם את מלכודת הבועה לפני הנימים מעט גבוהות יותר ממטוס הנימים ללכוד בועות.
2. Biofilm Growth
   1. התאם את קצב הזרימה במשאבת המזרק ולהתחיל את הזרימה, biofilm כעת לפתח על פני השטח הנימים במהלך התקופה הנדרשת - בדרך כלל 24 או 48 שעות בניסויים אלה.
   2. פוקוס על המטוס התחתון הנימים ולהתחיל את הקלטת הזמן לשגות של התמונות לדוגמא - בדרך כלל בתדירות רכישה של 2 תמונות / דקה תהיה מספק לדווח על צמיחת biofilm. צגי וידאו biofilm פוסט שליטה זו צמיחה (ראה תמציות בוידאו 1, 2 ו -3).

4. התקנה מלקטת מגנטי

1. בורג פינצטה המגנטית על micromanipulators XYZ נשלט באופן ידני ולדפוק את micromanipulators על הבמה מיקרוסקופ כדי להתאים את המיקום של פינצטה יחסית לנימים. הנח את פינצטה כמו באיור 2 כדי להבטיח את שיפוע השדה מגנטי המתאים מופק באזור התצפית.
2. חבר את t פינצטהo גנרטור הפונקציה באמצעות מגבר הכוח כדי ליצור תקופת 40 שניות של זמן עשויה 24 שניות אפס אות ו16 שניות של 4 נוכחית ישיר עם הדק נשלח לבהיר תריס אור השדה לאחר 20 שניות לסנכרון אות מתן רצף של אירועים כמו באיור 3.
   הערה: ניתן להשיג את שתי פעולות אלו בכל עת בין התקנת נימים ותחילת מדידה. ראה להתנסות סקיצה סקירה באיור 4.

5. הזחילה Curve רכישה

1. השתמש בבקרת תנועת XY של הבמה מיקרוסקופ כדי להביא את הקצה של הקוטב המגנטי השמאלי והשמאלי הקצה של הנימים באותו תחום התצפית. קח את המקור של הקשרים הניתוח בצומת של ה-X וה-Y צירים שהוגדרו על ידי הקצה של הנימים וקצה חתיכת המוט, בהתאמה (ראה איור 2).
2. התאם את המיקום האנכי של הנימים באמצעות קנס ג פוקוסידית ontrol של עמדת מיקרוסקופ. בדרך כלל בדק את המטוס הראשון ממוקם בין 4 עד 7 μ מ 'מעל תחתית הנימים. 1 הווידאו מתאים לשדה XY שיש לו הפינה השמאלית העליונה שלה במקור של הקשרים מרחביים.
3. לעורר את רצף 40 שניות של אירועים שתוארו בסעיף 4.2 ואיור 3 על ידי מעבר על הגנרטור הנוכחי ובה בעת, לעורר באופן ידני את רצף רכישת תמונה של 1 וידאו.
4. הזז את הנימים לשדה הימני השכן על ידי תרגום μ מ '250 של הבמה מיקרוסקופ לשמאל ולפעול כאמורים בסעיף 5.3 ליצור וידאו 2 של פרוסה 2 וכן הלאה כדי להשיג את קטעי הווידאו הנדרשים. 3 עד 4 בדרך כלל תחומי 250 x 250 μ מ ² נאספים לאורך ציר ה-x לפני שינוי המטוס וחוזר על אותן פעולות עבור המטוס החדש.

6. חיל כיול

1. הכן פתרון גליצרול על ידי ערבוב 39.8 גרם של גליצרול עם 190 μ ליטר של מים מזוקקים ודו 10 μl של חלקיקים מגנטיים ב2 x 10 ⁹ מיליליטר / חלקיקים ולמלא את הערוץ ניסיוני בתערובת זו ולמקם אותו על הבמה מיקרוסקופ כפי שתואר למדגם biofilm.
2. לאחר התקנת פינצטה המגנטית כאמור בסעיף 4, החל את הכוח המגנטי כאמור בסעיף 5.4 ולהפוך את הזמן לשגות תמונות כדי לחלץ כל חלקיק וחלקיק מהירות (V) ואת עמדתה בנימים כדי להפיק את קובץ הכיול. קובץ זה צריך להכיל את הכוח ליישם כפונקציה של מיקומו באזור של ניתוח של הנימים על פי חוק סטוקס, F = 6πRηv (R: רדיוס של החלקיקים).

7. ניתוח

1. השתמש בתוכנת "חלקיק גשש" לקבל קבצי טקסט עם עמדות חלקיקים בכל מסגרת לכל הערימות של תמונות שנרכשו כאמור בסעיף 5. מנצלg את תדירות רכישת מחסנית התמונה, לחשב את תזוזת החלקיק כפונקציה של זמן (למשל איור 5 ו -4 וידאו).
2. שימוש בקובץ כוח הכיול, להמיר את עקומות עקירה לעקומות ציות (תאימות כוללת של החומר - J (t) - כפונקציה של זמן) על פי נוסחת העמידה:
   
   אשר נותן את היחס בין מאמץ חומר ויישם מתח לחלקיקי בדיקה של R הרדיוס מוטבע במדיום viscoelastic בלתי דחיס, הומוגנית כפי שנקבעו בעבר על ידי Schnurr ועמיתים לעבודה ^19.
3. התאם את עקומות ציות השרץ למודל בורגרס הכללי לחומרי viscoelastic ולגזור את הפרמטרים viscoelastic, J _{0, 1} J, η _0, η ₁ עבור כל חלקיק ( איור 6) על פי הנוסחה 'בורגרס:
   
   הערה: ניתוח הפנומנולוגית זה כבר הועסק בעבר למגוון רחב של חומרים, כולל חומרים ביולוגיים כגון biofilms לפרש נתונים rheology מקרוסקופית ^20-22.

תוצאות

ניתוח טיפוסי יספק את הפריסה המרחבית של הפרמטרים viscoelastic בקנה מידת מיקרון בbiofilm חיים מבלי להפריע להסדר המקורי שלה. תוצאות אופייניות מוצגות באיור 7 שבו הערכים של ₀ J - ציות האלסטיות - מקבלים כפונקציה של Z-הציר לאורך העומק ושל ציר ה-Y לאורך ממד רוחב של biofilm. כל נקודה מתאימה לחרוז שניתוח עקום השרץ סיפק ערך J _0. נתוני המחקר מראה כי הציות מקומי מגוון לאורך העומק של biofilm על פני כמעט שלושה סדרי גודל, אלא גם כי הטרוגניות רוחב חזקה התרחש ...

דיון

חלקיקים מגנטיים זה זריעה ומושכים ניסוי אפשר במיפוי 3D באתרו של הפרמטרים viscoelastic של biofilm גובר במצבו המקורי. גישה זו חשפה את ההטרוגניות מכאנית של א ' biofilm coli גדל כאן ונתן רמזים להצביע על רכיבי biofilm תמיכה בתכונות פיזיות biofilm, חזק המצביעים על משמעות בסיסית של המטריצה ​​תאית ולייתר דיוק מידת cross-linking שלה.

זיהוי תבניות תכונות מכאניות בbiofilm חיידקים הוא ח...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>טבלה 1: ריאגנטים ותאים
חלקיקים מגנטיים	טכנולוגיות חיים	14307D	חלקיק מגנטי מיקרומטרי, 2.8 ומיקרו;
אמפיצילין (אנטיביוטיקה)	סיגמא-אולדריץ'	A9518
טטרציקלין (אנטיביוטיקה)	סיגמא-אולדריץ'	87128
זן חיידקי MG1655gfpF	UGB, מכון פסטר, צרפת		מייצר F פילי על פני השטח שלו, עמיד בפני אמפיצילין וטטרציקלין.
<חזק>טבלה 2: נימים וצינורות
מסננים לזלוף ילדים	Prodimed-Plastimed	6932002
נימים מרובעים חלולים	מתכת מרוכבת Scientific	8280-100	מיוצר בזכוכית בורוסיליקט. ריבוע 0.8 מ"מ x 0.8 מ"מ
צינורות סיליקון פרוקסיד	VWR בינלאומי	228-0512	קוטר 1 מ"מ
צינורות סיליקון פרוקסיד	VWR international	228-0700	קוטר 3 מ"מ
<חזק>טבלה 3: גידול ביופילם
תמיסת מרק ליזוגני (LB)	Amresco-VWR	J106-10PK	מדיום סטנדרטי המשמש לגידול חיידקים.
פתרון M63B1	תוצרת		מדיום מינימלי סטנדרטי המשמש לגידול חיידקים.
גלוקוז	סיגמא-אולדריץ'	G8270	משמש לייצור M63B1 בינוני עם 0.4% גלוקוז.
<חזק>טבלה 4:
מצלמת אלקטרוניקה EMCCD	Hamamatsu	C9100-02
בקר חימום	מכשירי דיוק עולמיים	מחולל
	טכנולוגיות Agilent	33210A
מגבר כוח	תוצרת		זה נותן אות זרם עם אמפליטודות של עד 4 A.
משאבות מזרקים	Kd Scientific	KDS-220
Shutter	Vincent Associates	Uniblitz T132
פינצטה מגנטית	תוצרת		שני קטבים אלקטרומגנטיים, כל אחד מהם עשוי סליל נחושת עם 2,120 סיבובים בקוטר 0.56 מ"מ חוט נחושת וליבות סגסוגת מגנטית רכה (Supra50-Arcelor Mittal, צרפת) בצורת ריבוע על פי התוכנית המוצגת ב<חזק>איור 10. שתי הליבות מותקנות בקוטב הצפוני הפונה לקוטב הדרומי, על מנת ליצור כוח מגנטי בכיוון אחד לאורך הנימים. ראה פרטי חיווט סליל ב<חזק>איור 11.
<חזק>טבלה 5: אופטיקה
מיקרוסקופ הפוך	Nikon	TE-300
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)	Nikon		זהו יעד למרחק עבודה ארוך המאפשר תצפית על הביופילם לעומק.
מסנני אפיפלואורסצנטיים: 1) לפלואורסצנטיות ירוקה: Exc 480/20 ננומטר; DM 495; ב 510/20  2) לפלואורסצנטיות אדומה: Exc 540/25 ננומטר; DM 565; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	תזוזה של חלקיקים בעת הפעלת כוח נרשמת באמצעות בלוק מסנן הפלואורסקס האדום.
טבלה 6: ניתוח תמונה
ImageJ	NIH - תוסף

בית פונקציות 300354 בית בית למעקב אחר חלקיקים