הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שיטות לזיהוי תהודת ה-NMR של 13C-dimethyl N-terminal אמין על חלבונים שעברו מתילציה רדוקטיבית

5.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50875

⸱

12 בדצמבר 2013

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Louisiana State University

במאמר זה

סיכום

מתוארות שתי שיטות להקצאת אותות התהודה המגנטית הגרעינית של α ו-ε-dimethylamine של ליזין N-terminal 13C-methylated. שיטה אחת משתמשת בסלקטיביות הנגרמת על ידי pH של תגובת המתילציה הרדוקטיבית, והשנייה משתמשת באמינופפטידאז כדי להסיר באופן סלקטיבי את הליזין הטרמינלי N.

תקציר

ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR) היא טכניקה מוכחת למבנה חלבונים ומחקרים דינמיים. כדי לחקור חלבונים עם NMR, איזוטופים מגנטיים יציבים משולבים בדרך כלל באופן מטבולי כדי לשפר את הרגישות ולאפשר הקצאת תהודה רציפה. מתילציה C-13רדוקטיבית היא שיטת תיוג חלופית לחלבונים שאינם ניתנים לביטוי יתר של מארח חיידקים, השיטה הנפוצה ביותר לשילוב איזוטופים. מתילציה 13C-רדוקטיבית היא תגובה כימית המבוצעת בתנאים מתונים המשנה את קבוצות האמינו העיקריות של חלבון (קבוצות אמינו ε ליזין וקבוצת האמינו α הטרמינלית) ל-13קבוצות C-דימתילאמינו. המבנה והתפקוד של רוב החלבונים אינם משתנים על ידי השינוי, מה שהופך אותו לחלופה בת קיימא לתיוג מטבולי. מכיוון שמתילציה C-13רדוקטיבית מוסיפה תוויות דלילות ואיזוטופיות, שיטות מסורתיות להקצאת אותות NMR אינן ישימות פותחה שיטת הקצאה חלופית המשתמשת בספקטרומטריית מסה (MS) כדי לסייע בהקצאת אותות NMR של חלבון 13C-dimethylamine. השיטה מסתמכת על כמויות חלקיות ושונות של 13תיוג C בכל קבוצת אמינו ראשונית. מגבלה אחת של השיטה מתעוררת כאשר שאריות ה-N-terminal של החלבון הן ליזין מכיוון שלא ניתן למדוד בנפרד את קבוצות ה-α וה-ε-dimethylamino של Lys1 עם טרשת נפוצה. כדי לעקוף מגבלה זו, מתוארות שתי שיטות לזיהוי תהודת ה-NMR של 13C-dimethylamines הקשורים הן ל-N-terminal α-אמין והן לשרשרת הצד ε-אמין. אותות ה-NMR של ה-N-terminal α-dimethylamine ושרשרת הצד ε-dimethylamine של ליזוזים חלבון ביצת תרנגולת, Lys1, מזוהים בספקטרום קוהרנטיות חד-קוונטי הטרו-גרעיני של 1 H-13C.

מבוא

ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR) היא כלי רב ערך להבהרת מבנה עבור חלבונים1. ניתן להשתמש בספקטרוסקופיה של NMR כדי לקבוע את מבנה התמיסה של חלבון במצבו המקורי. כדי להתגבר על השפע הטבעי הנמוך של איזוטופים מגנטיים יציבים, יש צורך לשלב 13C ו-15N בחלבון המבוקש. השיטה הנפוצה ביותר בשימוש היא ביטוי רקומביננטי במארח חיידקים2-3. עם זאת, שני חסרונות של ביטוי יתר של מארח חיידקים הם שהוא אינו יכול לייצר שינויים לאחר התרגום ואינו עובד עבור כל החלבונים3-4. כאשר ביטוי חיידקים אינו דרך בת קיימא לייצור חלבון, ניתן להשתמש בביטוי יתר במארחים לא חיידקיים, אך תיוג איזוטופי הוא קשה ויקר5. שיטות ביטוי חלופיות לשילוב איזוטופים של 13C ו-15N בחלבונים לניתוח NMR כוללות טכניקות תיוג דלילות המשתמשות בקודמים מטבוליים לתיוג מתיל6 ויחיד 13C, 15N חומצות אמינו7-9. גישה כימית לתיוג דליל המשמשת כאן היא תגובת מתילציה 13C-Methylation הרדוקטיבית המבוססת היטב (איור 1), שבה קבוצות האמינו העיקריות על חלבון - ה-N-terminal α-אמין והליזין, שרשרת צד ε-אמינים - עוברות מתילציה. לאחר היווצרות מונומתילאמינים, האמין עובר מתילציה שוב, בשל ערך ה-pKa הגבוה יותר, ליצירת דימתילאמינים.

מתילציה רדוקטיבית הוצגה לראשונה כשיטה לשינוי כימי של חלבונים על ידי Means ו-Feeney10. היתרונות של תגובה זו הם תחולתה הרחבה ותנאי התגובות המתונות שלה ב-pH חוצץ, פיזיולוגי וטמפרטורות נמוכות11,12. בנוכחות פורמלדהיד וחומר מחזר, כגון קומפלקס דימתילאמין בוראן (DMAB), קבוצות ε-אמינו הליזין וקבוצת ה-α-amino N-terminal עוברות מתילציה סלקטיבית לייצור אמינים דימתיליים. למרות שידוע שפורמלדהיד מקשר חלבונים באמצעות היווצרות גשרי מתילן, תהליך זה נחסם על ידי חומר ההפחתה13,14.

מתילציה רדוקטיבית שימשה בהצלחה לחקר חלבונים הן עם NMR והן עם קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. מתילציה רדוקטיבית משמשת כדי להקל על התגבשות חלבונים עקשניים אחרת15. ליזוזים חלבון ביצת תרנגולת היה החלבון הראשון שהתגבש בצורתו הדימתילית. ההבדל הריבועי הממוצע בין האטומים הכבדים במבני הליזוזים המתיליים והלא-מתילציה הוא 0.40 Å16. השוואה זו מדגימה כי ניתן לשמור על מבנה החלבון לאחר מתילציה רדוקטיבית, מה שהופך את התגובה לכלי תיוג בר-קיימא להבהרת מבנה.

על ידי שימוש ב-13פורמלדהיד עם תווית C בתגובת המתילציה הרדוקטיבית, מיוצרים 13אמינים C-dimethylated. 13C-dimethylamines הם בדיקות הניתנות לזיהוי NMR שנעשה בהן שימוש נרחב לחקר דינמיקה, מבנה ותפקוד חלבונים. NMR ו-reductive 13C-methylation שימשו לחקר אינטראקציות חלבון-ליגנד וחלבון-חלבון עבור הקולטן האדרנרגי β2 17, ריבונוקלאז A18, ליזוזים19, חלבון גן fd 520 וציטוכרום c21. באופן דומה, תכונות מבניות ותפקודיות נחקרו באופן רדוקטיבי של 13ריבונוקלאז C מתילציה A22, ליזוזים23, חלבון 5 גן fd24, קלוסטרידיום פסטוריאנום פרדוקסין25, שבר Fc של IgG26, אפוליפופרוטאין A-I27 ו-MIP-1α28 הדינמיקה של 13קבוצות C-dimethylamino נחקרה על concanavalin A29-30 וקלמודולין31.

למרות שנעשה שימוש נרחב ב-13C-methylation רדוקטיבי לחקר חלבונים עם NMR, שיטת התיוג תמיד הוגבלה על ידי הקשיים בהקצאת תהודה של NMR26. רוב אסטרטגיות ההקצאה עבור 13חלבונים שעברו מתילציה C באופן רדוקטיבי הסתמכו על מספר קטן של אתרים,20,28 תכונות מבניות ידועות11,19,23,26,31,32. או שינויים גנטיים נרחבים33. אף אחד מהמחקרים הללו לא הקצה בהצלחה את כל 13פסגות C-dimethylamine למעט מחקר הקלמודולין, שבו הפסגות הוקצו על ידי מוטגנזה מכוונת אתר של כל ליזין33. במחקר על היווצרות דימר MIP-1α, דווח לראשונה על השימוש בספקטרומטריית מסה (MS) כדי לסייע בהקצאת NMR של 13אמינים שעברו מתילציה C באופן רדוקטיבי28. יינון יינון לייזר בעזרת מטריקס (MALDI-TOF) MS שימש לזיהוי הליזין בממשק הדימר. הליזינים שעברו מתילציה חלקית של פפטידים טריפטיים MIP-1α אנושיים זוהו עם MS והיו בקורלציה עם הופעת אותות מונו-ודימתילאמין של החלבון השלם שנצפו בספקטרום 2D 1 H-13C HSQC NMR28. הקבוצה שלנו הרחיבה את השימוש בטרשת נפוצה והציגה שיטת הקצאה שאינה דורשת ידע מוקדם על מבנה החלבון או תכונותיו מלבד רצף חומצות האמינו34. שיטה זו ישימה לרוב החלבונים. יוצא מן הכלל אחד הוא כאשר לחלבון יש ליזין N-terminal מכיוון שלא ניתן למדוד באופן עצמאי את הפרופיל האיזוטופי של MS של ליזין N-terminal α- ו-ε-13 C-dimethylamines.

כאן אנו מציגים שתי שיטות, אחת כימית ואחת אנזימטית, לזיהוי אתרי α-dimethylamine N-terminal ושרשרת הצד ε-dimethylamine של שאריות ליזין N-terminal. השיטה הראשונה נוצרה בהשראת קורדובה ואחרים.שהשתמש ב-pH כדי לשלוט בסלקטיביות של אצטילציה של חלבון35. התגובה מעדיפה את ה-N-terminal α-אמין ב-pH נמוך ואת שרשרת הצד ε-אמינים ב-pH גבוה, מה שמאפשר להבחין בין קבוצות החלבון α ו-ε-אמינו, במחקריהם, עם אלקטרופורזה נימית35. אנו מדגימים כיצד משתמשים ב-pH גבוה ונמוך כדי לשנות את התיוג של קבוצות אמינו חלבונים באמצעות תגובת מתילציה C-13הרדוקטיבית ולאפשר יישום של אסטרטגיית ההקצאה בסיוע MS. השיטה השנייה להקצאת ה-N-terminal α- ו-ε-13C-dimethylamines מנצלת את ההסרה הסלקטיבית של שאריות ה-N-terminal באמצעות Aeromonas proteolytica aminopeptidase רקומביננטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. מתילציה רדוקטיבית של ליזוזים

  1. הכן 500 מ"ל של מאגר נתרן פוספט של 50 מ"מ ב-pH 7.5. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
  2. סמן שלושה צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1 מ"ל עבור דגימה עם תווית מלאה (FLS), דגימה עם תווית חלקית של pH נמוך (LpH) ודגימה עם תווית חלקית של pH גבוה (HpH).
  3. שקלו 10 מ"ג ליזוזים והמיסו ב-2 מ"ל של מאגר נתרן פוספט ליצירת תמיסה מימית בריכוז של 5 מ"ג/מ"ל. מכסים את הצינורות בנייר אלומיניום כדי להגן על הפורמלדהיד מפני השפלה עקב חשיפה לאור. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת ליזוזים לכל צינור.
  4. הכינו תמיסות טריות של 1.0 M של קומפלקס דימתילאמין בוראן (DMAB) ו-13C-פורמלדהיד. יש לאחסן בטמפרטורה של 0 מעלות צלזיוס.
  5. עבור הדגימה המסומנת במלואה, השתמש ביחס מולארי של 1:10 (אמין תגובתי: פורמלדהיד), ועבור הדגימות המסומנות חלקית, השתמש ביחס של 1:5. לחלופין, ניתן לייעל את היחס. לדוגמה, כדי לראות את הדומיננטיות של שיא α-13C-dimethylamine ב-pH נמוך, נדרש יחס של 2:7.
  6. הוסף 6.1 מיקרוליטר של 1.0 M DMAB ל-FLS, הוסף 3.2 מיקרוליטר של 1.0 M DMAB ל-LpH ו-HpH, ומערבולת בעדינות. לאחר מכן הוסף 12.3 מיקרוליטר של 1.0 M 13C-פורמלדהיד ל-FLS ו-6.1 מיקרוליטר של 1.0 M 13C-פורמלדהיד ל-LpH ו-HpH. לנער את תערובות התגובה ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
  7. הוסף עוד מנה של 1.0 M DMAB ו-13C-formaldehyde כמו בשלב הקודם ונער את תערובת התגובה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס לזמן תגובה כולל של 18-24 שעות.
  8. החלף את מאגר הדגימה לפוספט ב-pH 7.5 כדי להסיר עודפי ריאגנטים ותוצרי לוואי באמצעות מסנן צנטריפוגלי (חתך משקל מולקולרי של 3 kDa).
  9. עבור הדגימות המסומנות חלקית, מתילציה רדוקטיבית של הדגימות ב-pH 7.5 עם פורמלדהיד בשפע טבעי ליצירת חלבון שונה באופן הומוגני. הכן תמיסות חדשות של 1.0 M של DMAB ופורמלדהיד בשפע טבעי.
  10. מכסים את צינורות הדגימה בנייר כסף, מוסיפים 6.1 מיקרוליטר DMAB ל-LpH ו-HpH, ומערבולת בעדינות. לאחר מכן הוסף 12.3 מיקרוליטר של פורמלדהיד בשפע טבעי. מנערים את תערובות התגובה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
  11. הוסף עוד מנה של 1.0 M DMAB ופורמלדהיד בשפע טבעי כמו בשלב הקודם ונער את תערובות התגובה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס לזמן תגובה כולל של 18-24 שעות. לאחר מכן החלפת חוצץ באמצעות שלבים 2.5-2.6 ואחסן דגימות של 50 מיקרוגרם ב-20 מעלות צלזיוס עבור MS.

2. הכן את המדגם לניתוח NMR

  1. הכן תמיסת חיץ נתרן בוראט 2.0 M ב-pH 8.5 ב-H2O.
  2. הוסף 375 מיקרוליטר של תמיסת חיץ נתרן בוראט 2.0 M לארבעה צינורות חרוטיים של 15 מ"ל. פרפילם את החלקים העליונים ותוקע חורים. מניחים את הבקבוק בבקבוק ליופיליזציה ומקפיאים את הדגימה.
  3. מניחים את הדגימה הקפואה על ליופילייזר לייבוש. הסר כשהוא יבש.
  4. בעזרת פיפטה מוסיפים 15 מ"ל של D2O לכל צינור ומערבבים.
  5. סמן שלושה מסננים צנטריפוגליים של 4 מ"ל (חתך משקל מולקולרי של 3 kDa) עם FLS, LpH ו-HpH. הוסף את הדגימה המתאימה לצינורות המסנן (~500 מיקרוליטר). הוסף 3.0 מ"ל של מאגר נתרן בוראט 50 מ"מ ב-pH 8.5 לכל צינור. הכינו צינור איזון לצינור השלישי ורכזו את הדגימות ל-500 מיקרוליטר באמצעות צנטריפוגה עם רוטור זווית קבועה של 35° ב-4 מעלות צלזיוס ו-7,500 rcf.
  6. רוקן את המלכודת מתחת לכל פילטר. הוסף עוד 3.0 מ"ל של מאגר לדגימות ורכז את הדגימות שוב ל-500 מיקרוליטר. חזור על שלב 2.5 4x.
  7. באמצעות בדיקת החלבון חומצה ביצינצ'ונינית (BCA)36, קבע את הריכוז של כל דגימה. מדללים את דגימות הליזוזים עם מאגר נתרן בוראט של 50 מ"מ כדי ליצור דגימות של 150 מיקרומטר.
  8. העבר 530 μl לשפופרת NMR 5 מ"מ או 250 μM לצינור תואם רגישות מגנטית של 5 מ"מ.
  9. הכן תמיסת מלאי של 80 מ"מ של 1,2-דיכלורואתאן-13 C2 ב-D2O. אחסן תמיסת מלאי זו ב-80 מעלות צלזיוס. נתח את הדגימות באמצעות תמ"ג. הערה: הפעל 1D 1 H-13C HSQC ושלב את אזורי השיא עבור כל תהודה. אזורי השיא צריכים להיות זהים עבור דגימה עם תווית מלאה.

3. פירוק אמינופפטידאז של ליזוזים

  1. הכינו תמיסה של 5 מ"ג/מ"ל של ליזוזים במים טהורים במיוחד.
  2. הוסף 250 מיקרוליטר מתמיסת הליזוזים לצינור צנטריפוגה נקי של 1 מ"ל.
  3. הוסף 25 מיקרוליטר של תמיסת טריצין 0.1 M, pH 8.0 ו-6 מיקרוליטר של תמיסת Aeromonas proteolytica aminopeptidase.
  4. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות.
  5. הוסף לדגימה 6 מיקרוליטר נוספים של תמיסת אמינו-פפטידאז של 2.16 מיקרוגרם/מ"ל לקבלת יחס מולרי של 1:50 של אמינופפטידאז לליזוזים. יש לדגור למשך 20 שעות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  6. יש להמליץ 30 מיקרוליטר מהדגימה באמצעות עמודת ספין C18, (עקוב אחר פרוטוקול היצרן). אחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לניתוח MALDI MS.
  7. הכן את דגימת החלבון הנותרת לתמ"ג כמתואר בפרוטוקול 2).

4. הכן דגימות לספקטרומטריית מסה

  1. באמצעות 50 מיקרוגרם של הדגימה השמורה בשלב 2.3, החלף את המאגר ל-100 מ"מ אמוניום ביקרבונט, pH 8.0, והתרכז לכ-50 מיקרוליטר באמצעות מסנן צנטריפוגלי של 1 מ"ל (חתך משקל מולקולרי של 3 kDa). מעבירים את הדגימה לצינור צנטריפוגה של 1 מ"ל ועוטפים בנייר אלומיניום.
  2. הוסף 2.0 מיקרוליטר של 500 מ"מ דיתיותרייטול כדי להפחית את קשרי הדיסולפיד. דגרו את התמיסה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה.
  3. הוסף 2 מיקרוליטר של 500 מ"מ יודואצטמיד טרי שהוכן כדי לאלקילאט את קבוצות התיול. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
  4. הסר את נייר הכסף והוסף 1.0 מיקרוליטר מתמיסת הדיתיוטרייטול של 500 מ"מ כדי להרוות את התגובה.
  5. הוסף 2.0 מיקרוגרם של טריפסין בדרגת ריצוף כדי לעכל את החלבון. דגרו את התערובת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16-24 שעות.
  6. הוסף TFA עד שה-pH נמוך מ-2 כדי להרוות את העיכול. (ניתן להשתמש גם בחומצות פורמיות ואצטיות)
  7. יש להמליח את הדגימה על עמוד ספין C18 ולהוציא את החלבון ב-80% אצטוניטריל/0.1% TFA. יבש את הדגימה באמצעות רכז ואקום.
  8. הרכיבו מחדש את הדגימה ב-5.0 מיקרוליטר של 50% אצטוניטריל/0.1% TFA לניתוח MALDI MS. מערבבים נפחים שווים של הדגימה המשוחזרת ותמיסה רוויה של תמיסת מטריצת חומצה 2,5-דיהידרוקסיבנזואית על לוחית היעד של MALDI. נתח את הדגימות ב-MALDI MS. הערה: השתמש ב-MS טנדם כדי לאשר את זהותן של פסגות פפטיד. החלק את ספקטרום המסה ונתח. עבור כל פפטיד המכיל דימתילאמין, קבע את עוצמת השיא ושטח השיא של כל איזוטופ בפרופיל. חשב את האחוז של 13התאגדות C כמתואר קודם לכן34.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מתילציה רדוקטיבית ו-pH

תגובת מתילציה רדוקטיבית כימוסלקטיבית של 13C המושרה על ידי pH הודגמה בליזוזים. ב-pH נמוך, התגובה מעדיפה את ה-α-amine בקצה ה-N על פני ה-ε-amines בשרשרת הצד, ולהפך ב-pH גבוה. בתמיסה, קבוצות האמינו של החלבון נמצאות בשיווי משקל בין האמין החופשי לבין החומצה הצמודה, שניתן לכוון אותו באמצעות ה-pH. טווח ה-pH האופטימלי לתגובה זו תלוי בחומר המreducer שבו משתמשים. במקרה זה, ל-dimethylamine borane יש pH אופטימלי של 7.0-9.0. עבודה מחוץ לטווח האופטימלי של החומר המreduc...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הקצאת אותות ה-NMR של 13חלבונים שעברו מתילציה C באופן רדוקטיבי נחוצה כדי לנצל באופן מלא את שיטת התיוג האיזוטופית הזו. השימוש בטרשת נפוצה כדי לסייע בהקצאת אותות ה-NMR באמצעות מתאם של 13נתוני שילוב C חלקיים הוא טכניקה מבטיחה. היתרון של טכניקה זו על פני שיטות הקצאה אחרות הוא שיש צורך רק ברצף חומצות האמינו הראשוני. שיטת ההקצאה בסיוע MS מוגבלת כאשר חומצת האמינו N-terminal היא ליזין מכיוון שלא ניתן למדוד את שילוב 13C ב-α-dimethylamine ו-ε-dimethylamine בנפרד עם MS. ניסויי טיטרציה מראים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין לנו מה לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי פרס מספר R00RR024105 מהמרכז הלאומי למשאבי מחקר, המכון הלאומי לבריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אצטוניטרילסיגמא34851
אמיקון אולטרה 4 מ"ל מסנן צנטריפוגלי (3k MWCO)פישר סיינטיפיקUFC800308 (8pk)
אמינופפטידאזCreative Biomartאמינופפטידאז-86A
אמוניום ביקרבונטסיגמאA6141
אמוניום סולפטסיגמאA5132
קומפלקס בוראן-דימתילאמיןSigma180238יש להכין תמיסה טרייה של 1 M לפני השימוש.
חומצה בוריתSigmaB6768
אינסולין לבלב בקרSigmaI5500
C18 עמודות ספיןThermo Scientific89870
תחמוצת דאוטריוםמעבדות איזוטופ קיימברידג'DLM-4-100
1,2-דיכלורואתאן-13C2Sigma714321תמיסת מלאי של 80 מ"מ מאוחסנת ב-80 מעלות צלזיוס. משמש כהתייחסות בספקטרום NMR ב-24 מ"מ.
פורמלדהיד (36.5% משקל/משקל)Sigma33220יש להכין תמיסה טרייה של 1 מ' לפני השימוש.
13C-formaldehyde (99%)Cambridge Isotope LaboratoriesCLM-806-1יש להכין תמיסה טרייה של 1 M לפני השימוש.
ליזוזים (חלבון ביצת תרנגולת)סיגמאL6376
נתרן פוספט (הפטהידרט דו-בסיסי)סיגמאS9390
נתרן פוספט (חד-בסיסי)סיגמאS9638
טריצ'יןסיגמאT0377
חומצה טריפלואורואצטיתסיגמא302031
700 מגה-הרץ וריאן VNMRS עם בדיקה 5 מ"מ HCN 5922Agilent טכנולוגיות
Bruker UltrafleXtreme MALDI TOF/TOFBruker

מקורות

  1. Bax, A., Grzesiek, S. Methodological Advances in Protein NMR. Accounts of Chemical Research. 26 (4), 131-138 (1993).
  2. Shimba, N., Yamada, N., Yokoyama, K., Suzuki, E. Enzymatic Labeling of Arbitrary Proteins. Analytical Biochemistry. 301 (1), 123-127 (2002).
  3. Palomares, L., Estrada-Moncada, S., Ramírez, O. Production of Recombinant Proteins. Recombinant Gene Expression. Balbás, P., Lorence, A. 267, Humana Press. New York City, New York, USA. 15-51 (2004).
  4. Graslund, S., et al. Protein Production and Purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  5. Terwilliger, T. C., Stuart, D., Yokoyama, S. Lessons from Structural Genomics. Annual Review of Biophysics. 38, 371-383 (2009).
  6. Goto, N. K., Kay, L. E. New Developments in Isotope Labeling Strategies for Protein Solution NMR Spectroscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 10 (5), 585-592 (2000).
  7. Lian, L., Middleton, D. Labelling Approaches for Protein Structural Studies by Solution-State and Solid-State NMR. Progress in Nuclear Magn. Reson. Spectroscopy. 39 (3), 171-190 (2001).
  8. Mason, A., Siarheyeva, A., Haase, W., Lorch, M., van Veen, H., Glaubitz, C. Amino Acid Type Selective Isotope Labelling of the Multidrug ABC Transporter LmrA for Solid-State NMR Studies. Febs Lett. 568 (1-3), 117-121 (2004).
  9. Chen, C., et al. Preparation of Amino-Acid-Type Selective Isotope Labeling of Protein Expressed in Pichia pastoris. Proteins:Structure Function and Bioinformatics. 62 (1), 279-287 (2006).
  10. Means, G., Feeney, R. Reductive Alkylation of Amino Groups in Proteins. Biochem. 7 (6), 2192 (1968).
  11. Jentoft, J. E., Jentoft, N., Gerken, T. A., Dearborn , D. G. C-13 NMR-Studies of Ribonuclease-A Methylated With Formaldehyde-C-13. J. Biol. Chem. 254 (11), 4366-4370 (1979).
  12. Rayment, I. Reductive alkylation of lysine residues to alter crystallization properties of proteins. Macromolecular Crystallography, Pt A. 276 (97), 171-179 (1997).
  13. French, D., Edsall, J. T. The Reactions of Formaldehyde with Amino Acids and Proteins. Adv. Protein Chem. 2, 277-335 (1945).
  14. Jentoft, N., Dearborn, D. G. Labeling of Proteins by Reductive Methylation Using Sodium Cyanoborohydride. J. Biol. Chem. 254 (11), 4359-4365 (1979).
  15. Walter, T., et al. Lysine Methylation as a Routine Rescue Strategy for Protein Crystallization. Struct. 14 (11), 1617-1622 (2006).
  16. Rypniewski, W., Holden, H., Rayment, I. Structural Consequences of Reductive Methylation of Lysine Residues in Hen Egg-White Lysozyme - An X-ray Analysis at 1.8-Angstrom Resolution. Biochem. 32 (37), 9851-9858 (1993).
  17. Bokoch, M. P., et al. Ligand-specific regulation of the extracellular surface of a G-protein-coupled receptor. Nat. 463 (7277), (2010).
  18. Jentoft, J., Gerken, T., Jentoft, N., Dearborn, D. C-13] Methylated Ribonuclease-A - C-13 NMR Studies of the Interaction of Lysine 41 with Active Site. 256 (1), 231-236 (1981).
  19. Sherry, A., Teherani, J. Physical Studies of C-13-Methylated Concanavalin A - pH and Co2+-Induced Nuclear Magn. Reson. Shifts. J. Biol. Chem. 258 (14), 8663-8669 (1983).
  20. Dick, L., Sherry, A., Newkirk, M., Gray, D. Reductive Methylation and C-13 NMR Studies of the Lysyl Residues of fd Gene 5 Protein - Lysines 24, 46, and 69 May be Involved in Nucleic Acid Binding. J. Biol. Chem. 263 (35), 18864-18872 Forthcoming.
  21. Moore, G. R., et al. N-epsilon,N-epsilon-dimethyl-lysine cytochrome c as an NMR probe for lysine involvement in protein-protein complex formation. Biochem. J. 332, 439-449 (1998).
  22. Jentoft, J. E., Gerken, T. A., Jentoft, N., Dearborn, D. G. Studies of the Active-Site Lysine of Ribonuclease-A By C-13 NMR. Biophys. J. 25 (2), 56 (1979).
  23. Gerken, T., Jentoft, J., Jentoft, N., Dearborn, D. Intramolecular Interactions of Amino Groups in C-13 Reductively Methylated Hen Egg-White Lysozyme. J. Biol. Chem. 257 (6), 2894-2900 (1982).
  24. Dick, L. R., Geraldes, C., Sherry, A. D., Gray, C. W., Gray, D. M. C-13 NMR of Methylated Lysines of fd Gene-5 Protein - Evidence for A Conformational Change Involving Lysine-24 Upon Binding of A Negatively Charged Lanthanide Chelate. Biochem. 28 (19), 7896-7904 (1989).
  25. Gluck, M., Sweeney, W. V. C-13-NMR of Clostridium-Pasteurianum Ferredoxin After Reductive Methylation of the Amines Using C-13 Formaldehyde. Biochimica Et Biophysica Acta. 1038 (2), 146-151 (1990).
  26. Jentoft, J. E. Reductive Methylation and C-13 Nuclear-Magnetic-Resonance in Structure-Function Studies of Fc Fragment and Its Subfragments. Methods in Enzymology. 203, 261-295 (1991).
  27. Sparks, D., Phillips, M., Lundkatz, S. The Conformation of Apolipoprotein A-I in Discoidal and Spherical Recombinant High Density Lipoprotein Particles - C-13 NMR Studies of Lysine Ionization. J. Biol. Chem. 267 (36), 25830-25838 (1992).
  28. Ashfield, J., et al. Chemical Modification of a Variant of Human MIP-1 Alpha, Implications for Dimer Structure. Protein Science. 9 (10), 2047-2053 (2000).
  29. Goux, W., Teherani, J., Sherry, A. Amine Inversion in Proteins - A C-13-NMR Study of Proton Exchange and Nitrogen Inversion Rates in N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha-[C-13]Tetramethyllysine, N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha[C-13]Tetramethyllysine Methyl-Ester, and Reductively Methylated Concanavalin-A. Biophysical Chemistry. 19 (4), 363-373 (1984).
  30. Sherry, A. D., Keepers, J., James, T. L., Teherani, J. Methyl Motions in C-13 Methylated Concanavalin-as Studied by C-13 Magnetic-Resonance Relaxation Techniques. Biochemistry. 23 (14), 3181-3185 (1984).
  31. Huque, M., Vogel, H. C-13 NMR Studies of the Lysine Side Chains of Calmodulin and Its Proteolytic Fragments. Journal of Protein Chemistry. 12 (6), 695-707 (1993).
  32. Brown, L., Bradbury, J. Proton-Magnetic-Resonance Studies of Lysine Residues of Ribonuclease-A. Eur. J. Biochem. 54 (1), 219-227 (1975).
  33. Zhang, M., Vogel, H. Determination of the Side Chain pKa Values of the Lysine Residues in Calmodulin. J. Biol. Chem. 268 (30), 22420-22428 (1993).
  34. Macnaughtan, M., Kane, A., Mass Prestegard, J. Spectrometry Assisted Assignment of NMR Resonances in Reductively C-13-Methylated Proteins. J. Am. Chem. Soc. 127 (50), 17626-17627 (2005).
  35. Cordova, E., Gao, J., Whitesides, G. M. Noncovalent Polycationic Coatings for Capillaries in Capillary Electrophoresis of Proteins. Anal. Chem. 69 (7), 1370-1379 (1997).
  36. Smith, P. K., et al. Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  37. Larda, S. T., Bokoch, M. P., Evanics, F., Prosser, R. S. Lysine methylation strategies for characterizing protein conformations by NMR. J. Biomolec. NMR. 54 (2), 199-209 (2012).
  38. Bradbury, J. H., Brown, L. R. Determination of Dissociation Constants of Lysine Residues of Lysozyme by Proton-Magnetic-Resonance Spectroscopy. Eur. J. Biochem. 40 (2), 565-576 (1973).
  39. Frey, S. T., Guilmet, S. L., Egan, R. G., Bennett, A., Soltau, S. R., Holz, R. C. Immobilization of the Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica on Mg2+/Al3+ Layered Double Hydroxide Particles. Acs Appl. Mater., & Interfaces. 2 (10), 2828-2832 (2010).
  40. Poncz, L., Dearborn, D. G. The Resistance to Tryptic Hydrolysis of Peptide-Bonds Adjacent to N-epsilon,N-Dimethyllysyl Residues. J. Biol. Chem. 258 (3), 1844-1850 (1983).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הקצאת תהודות NMRמתילציה רדוקטיבית של C13סימון חלבוניםאנליזת ספקטרומטריית מסותמודיפיקציה של ליזוזיםקוהרנטיות קוונטית יחידה הטרונוקליארית (HSQC)פירוק על ידי אמינו פפטידאזפרוצדורה להחלפת בופרשילוב איזוטופ פחמןזיהוי אמין N-טרמינלי
שיטות לזיהוי תהודת ה-NMR של 13C-dimethyl N-terminal אמין על חלבונים שעברו מתילציה רדוקטיבית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.