שימוש במשטח סורקים לאיסוף תמונות-פקע זמן ברזולוציה גבוהה של ארבידופסיס רוט Gravitropic התגובה

אוסף של נתונים פנוטיפי ברזולוציה גבוהה הוא שימושי במחקרים שמטרתם להבין את יחסי הגומלין בין הגנטיקה והסביבה בתיווך ^1,2 תפקוד האורגניזם. מחקרים מסוג זה הם גם גדולים מטבעם בקנה מידה, מה שהופך אותו בנוסף יש צורך כי שיטות ננקטות למדידת פנוטיפים בהקשר זה להיות גבוהות ^ב3,4 התפוקה. בקביעת שיטות למחקר Phenomics קנה מידה, פשרות בין התפוקה ורזולוציה נכנסות לשחק. שיטות שאינן גבוהים יותר בתפוקה גם נוטות להיות נמוך יותר ברזולוציה, ולכן קשה יותר לזהות השפעות קטנות של גנטיקה או סביבה ^5. לחלופין, שיטות המודדות את הפנוטיפ רצוי בזהירות רבה יותר גם נוטות להיות נמוך יותר בתפוקה, ולכן קשה ליסקור השפעות גנטיות וסביבתיות רחב. בנוסף, שיטות ידניות לפנוטיפים כימות, כוללים בדיקה ויזואלית, יכולות להיות נתונות לשינויים בשל הבדלים לאדםception ^6.

טכנולוגיות הדמיה יכולות לספק גשר שימושי בין התפוקה ורזולוציה בהשגת תצפיות פנוטיפי ^7-9. באופן כללי, תמונה היא קלה יחסית כדי ללכוד, להקל את התפוקה, וכאשר נלקחו ברזולוציה מספיקה, ניתן לאתר בפנוטיפים עדינים ^1,2,7. טכנולוגיות הדמיה נוטות להיות לשינוי כדי שיתאים למערכת או תהליך של עניין ובאופן כללי ניתן להרחבה ^10-12. בגלל זה, טכנולוגיות הדמיה הן אידיאליים לפיתוח מחקרים בקנה מידה גדולה של תפקוד האורגניזם.

התגובה של השורש העיקרי לגירוי כוח משיכה היא תהליך פיסיולוגי מורכב המתרחש בתוך איבר מורפולוגית פשוט. התגובה כרוכה בהפעלה של מסלולי איתות שלהפיץ דרך איבר השורש וההתקדמות שלה נקבעה על ידי גורמים סביבתיים וגנטיים, כוללים גורמים גנטיים מושפעים מהסביבה ^12-14 12,14,15 פלסטיות תגובה. השגת הבנה מפורטת של הדינמיקה של תגובה זו היא חשוב במציאת הדרכים לשפר את היכולת של שתילים להצלחה להפוך הוקם בתוך סביבת נתונה ^16. בנוסף, הצורה של השורש עושה את זה נוח עבור יישומי עיבוד תמונה ^8,12,17. יחדיו, תגובת gravitropic השורש היא מערכת אידיאלית לפיתוח טכנולוגיית הדמיה תפוקה גבוהה לצורך ביצוע מחקרים ברמת הגנומיקה של תפקוד האורגניזם.

בדו"ח זה, תפוקה גבוהה, שיטה ברזולוציה גבוהה ללכידת תמונה של תגובת gravitropic השורש באמצעות סורקים זולים, זמינים מסחרי גרר מוצגת. הסקירה שלפרוטוקול מוצג באיור 1. שתילים ניטעו על צלחות אגר הוצבו בסורקים שטוחים אנכי אוריינטציה מצוידת מחזיקי צלחת פלסטיק מותאם אישית. תמונות נאספו כל כמה דקות ב4,800 dpi ונשמרו בכונן מקומי או בשרת נתונים. מידע נוסף הקשורים לכל סדרת תמונה מאוחסן במסד נתונים ותמונות המאוחסנים מעובדים. הגישה משתמשת בתוכנת VueScan עבור לכידת תמונה. VueScan יכול לשמש כדי להפעיל על 2,100 סורקים שונים ב-Windows, Mac או מערכת הפעלה לינוקס (ראה לוח חומרים). רזולוציה של 4,800 dpi סורק הייתה בשימוש ביישום זה כדי להתאים את הרזולוציה שהושגה במחקרים קודמים באמצעות ^1,8,12 מצלמות קבועות CCD. הגמישות של תוכנת VueScan יחד עם הממשק המשותף משמשת אותה לכל סורק שהוא פועל מאפשר למשתמשים לאמץ בקלות כמעט כל חומרת סורק ברזולוציה מספיקה לפרוטוקול שהוצג במאמר זה. תפוקה נוכחית מאפשרת לאיסוף216 תגובות בודדות ליום. הטכנולוגיה ניתנת להתאמה וניתן להרחבה לשימוש במוסדות, החל מבתי ספר גבוהים למחקר באוניברסיטאות. יתר על כן, התמונות שנאספו הן באיכות מספיק עבור יישומי ניתוח תמונה.

1. תמונת רכישת פרוטוקול

שיקולים:

פרוטוקול זה מתבצע בצורה היעילה ביותר עם שני אנשים, למרות שזה אפשרי עבור אחד כדי לעבוד לבד. סידור עבודה הטוב ביותר במעבדה זו היה עבור אדם אחד כדי להכין צלחות לסריקה בזמן עבודות אחרת בהתקנה של סורק, ואז שניהם לעבוד יחד כדי למקם צלחות בסורקים ולהתחיל בתהליך הסריקה.

חשוב גם לציין כי הסורקים בפרויקט זה הם בכיוון אנכי עם מכסי הסורק נחו על גביו של הסורק. תמיכה מותאמת אישית נעשתה להחזיק כלים במצב אנכי והוצמדה אל פני השטח השטוח עם רצועות 3M פיקוד (איור 2). מכסה המסמך הנשלף שמגיע עם הסורק בשימוש בפרוטוקול זה (V700 Epson) היה מצופה בצד אחד עם לבד שחורים. מכסה המסמך הוצב נגד הגרר עם כבל באנג'י כדילהחזיק את הצלחות במקום ולספק ניגוד תמונה (איור 3).

כל סורק ברזולוציה מספקת יכול לשמש ללכידת תמונה. V700 שלמות Epson נבחר בגלל הפרופיל שלו מרובע (מה שהופך אותו קל למצב אנכי), ברזולוציה הגבוהה שלה, ואת האפשרויות נוספות כדי לסרוק משתי המיטה והמכסה ולהשתמש בערוץ אינפרא אדום. אפשרויות נוספות אלה לא היו בשימוש בפרוטוקול זה.

לאחר הצלחות הוסרו מחדר הצמיחה, זוהי החובה של הפרוטוקול להמשיך עד הסוף.

הכנת צלחת

מנות סטנדרטיות פטרי המכילות 10 מיליליטר של מדיום שקוף ו9 זרעים שניטעו לאורך מרכז כל צלחת היו בשימוש. ניתן למצוא נהלים לתיוג צלחת, הכנת תקשורת ושתילה ב: http://www.doane.edu/doane-phytomorph

1. החל טריטון X-100 (חומרי ניקוי) למכסה עם Kimwipe - להיות נדיב.
   (שים לב שטריטון X-100 עוזר למנוע ההצטברות של עיבוי על המכסה כצלחת נסרק. יישום נדיב (מספיק כדי ליצור סרט על פני השטח המכסה) יעזור לוודא כי המכסה נשאר שקופה לאורך כל ריצת הסורק .)
2. עטוף את הצלחת עם קלטת micropore כדי לאבטח את המכסה, וכדי לאפשר אוורור.

התקנת סורק ואוסף תמונות

פרוטוקול זה מבוסס על ההנחה שנמצא בשימוש סורק יותר מ 1, ומספק הוראות כדי להתחיל סורקים מרובים ממחשב אחד.

4. ליצור תיקיות לאחסון תמונות מסורק. סורק כל אחד יחזיק שתי צלחות, כדי לשמור את זה בחשבון בעת ​​יצירת תיקיות. אחדייתכן שיבחר להשתמש מטה כמרכיבים של שם הקובץ, כגון תעודות זהות ייחודיות לכל צלחת, גילאי שתיל, גודל זרע, ואת תעודות זהות של המניות נטועות. דוגמא לשם תיקייה המשמשת לאיסוף נתונים המכילים מטה אלה היא "1,652-2-SM-9-92-17-1653-2-LG-88-79-161".
5. להגדיר טיימרים פורקן מיועד זמן איסוף (9 שעות היו בשימוש במעבדה זו). הקפד להגדיר תוספת זמן (כשעה) להכנה.
   (שים לב שסורקים צריכים להיות מחוברים לטיימרים לשקע כדי להגדיר את זמן הרכישה. בעוד תוכנת VueScan מאפשרת למשתמש לאסוף תמונות שוב ושוב, זה לא מאפשר למשתמש לציין כמה תמונות כדי לאסוף או כמה זמן לאסוף תמונות עבור .)
6. הפעל את הסורק הראשון ולהמתין כ 10 שניות לסורק כדי לעבור החם קופצים הראשוני שלה.
7. פתח את תכנית VueScan פעם אחת. גרסת VueScan 9.0.20 הייתה בשימוש בפרוטוקול זה (ראה לוח חומרים), ניתן להשתמש בו למרות שגרסות חדשות יותר עם modific הקטןation. ודא שלחצן 'עוד' כבר לחץ על הפנל התחתון של ממשק המשתמש כדי להציג את אפשרויות תפריט מתוארות להלן.
8. הגדרה החוזרת האוטומטי: תיבה נפתחת לאף אחד תחת לשונית הקלט ותחת לשונית יבול אזור תצוגה מקדימה נקבע: למרבית (איור 4). לחץ על "תצוגה מקדימה".
9. ליצור תיבת יבול שהיה ללכוד את האזור של עניין על ידי שימוש בעכבר כדי ללחוץ ולגרור על פני האזור של עניין בתמונת התצוגה המקדימה. הגדרות עשויות להשתנות לאזור של עניין בכרטיסיית היבול. ההגדרות טיפוסיות המשמשות לתיבת החיתוך היו: קיזוז-x .675; 1.924 ב, אם כי זה היה מותאם כדי ללכוד את אזור השתיל לכל סורק לקזז y. גודל תיבת החיתוך השתמש היה 7.246 ברחבים על ידי 1.1 בגובו (איור 5).
10. כדי להזיז את תיבת החיתוך, החזק את מקש Shift לחוץ בזמן גרירה עם העכבר. ודא שתיבת החיתוך מכילה את כל השתילים לסריקה בתוספת כל מטה רצוי שעשויות להיות כלול בתווית (איור 5).
11. תחת לשונית היבול, להגדיר את אזור התצוגה המקדימה: לתיבת יבול ו'התצוגה המקדימה 'לעיתונות.
12. עבור לכרטיסיית Output ובחר את הקובץ הנכון עבור הסורק (איור 5).
13. חזור על שלבים 1.7-1.12 על כל הסורקים למחשב אחד. בחר את האפשרות "כן" בתשובה לשאלה אם יש מקום לפתוח יותר ממופע אחד של VueScan.
14. עבור הדרך כל כרטיסייה ולוודא שההגדרות נכונות. (שים לב שניתן לשנות את כל המפרט שיתאים לצרכימים של מעבדה בודדת כולל צבע תמונה, רזולוציה, וכו '. עם זאת, הגדרות שימוש בפרוטוקול זה יכולה להיות מיושמים באופן ישיר לרשות הפלסטיניתrticular סריקת חומרה של מעבדה ניתנה בשל הממשק המשותף של תוכנת VueScan. עיין ברשימה המצורפת המפרט כדי להציג את הפרמטרים המשמשים בפרויקט זה, תוך שימוש בגרסה VueScan 9.0.20).
15. תחת לשונית הקלט לבחור רציף בחוזר האוטומטי: שדה, או לבחור מרווח זמן ארוך יותר בין תמונות אם תרצה בכך. מרווח הזמן הוא משך הזמן שהסורק עוצר לאחר שמירת התמונה האחרונה ומתחיל אוסף של התמונה הבאה. במצב רציף, ניתן להשיג 3-4 ברזולוציה דקות ב 4,800 dpi.
16. חזור על שלבים 1.14-1.15 למשך שארית הסורקים מחוברים למחשב בודד.
17. הנח צלחות ערוכים סורקים הנכונים עם שתילים בכיוון אופקי (לא gravistimulate).
18. באופן זמני למקם שחור, הרגיש רקע נגד הצלחות כך שהם לא נופלים מתבנית פרספקס. חזור על פעולה עבור כל הסריקהners.
    (הערה: בפרויקט זה, חתיכות שחורות של הלבד היו מצורפים למסמך מכסה מסופק עם הציוד כדי למנוע סנוור ולספק ניגוד נגד רקמת שורש צבע הרקע הספציפי בשימוש יהיה תלוי בצבע של להיות הדמיה רקמות.).
19. יש אדם אחד להפוך את הצלחות 90 ° (צלחות הופנו נגד כיוון השעון בפרוטוקול זה) ומייד להחליף את הרקע המורגש.
20. האדם האחר צריך להיות עומד במחשב, כך שהם יכולים ללחוץ על הכפתור "הסריקה" באופן מיידי.
21. אבטח את הרקע לסורק עם כבל באנג'י (איור 3). יש אדם אחד להחזיק את הרקע במקום בעוד עמדות אחר כבל באנג'י.
    (הערה: מייד לאחר gravistimulation (סיבוב של הצלחות ב -90 °) ומיקום של הרקע המורגש, צריכה להיות לחוץ "סריקה").
22. חזור על שלבים 1.17-1.21 לשארית של הסורקים בcomput אחתאה.
23. חזור על שלבים 1.6-1.22 לסדרה הבאה של סורקים במידת צורך.
24. אל תשאירו את הסורקים עד כמה תמונות כבר נאספו כדי לוודא שהם שומרים בצורה נכונה.
25. הוא אידיאלי כדי לשמור על הסורקים באזור זה יהיה נקי מהפרעות בפעם הסריקה הייעודית. זה גם נבון לשקול את התנאים הסביבתיים באזור הסריקה כדי להבטיח את תגובות פנוטיפי אידיאלית.
26. כאשר איסוף הנתונים הושלם, לחץ על הלחצן בטל הירוק על כל חלון VueScan שעולה בקנה אחד עם כל סורק.
27. סגור את כל התוכניות במחשב.
28. הפעל מחדש את המחשב ולכבות את כל הסורקים לפני תחילת סבב של אוסף תמונה אחר.

נציג תמונות

גישה זו מאפשרת ייצור מהיר של סדרת זמן ברזולוציה הגבוהה של צמיחת שתיל ארבידופסיס. תמונות הראשונות והאחרונה של ריצת סורק מוצגות ב7A דמויות ו7B. איורים 7C ו7D להראות תוצאות אופטימליות ממחצית מתמונת סורק מלאה. כמה בעיות שיכולות להשפיע על איכות תמונה מוצגות ב7A דמויות ו7B. נושאים אלה כוללים וריאציה בנביטה, וריאציה בשתיל מסלול צמיחה בתחילת הריצה, והצטברות של עיבוי במהלך סריקה. עיבוי במידה רבה יכול להיפתר על ידי הגדלת הכמות של טריטון X-100 מוחלת על החלק הפנימי של המכסה הצלחת. גורמים אחרים שיכולים לעכב אוסף תמונה מדויק הם תצורה שגויה של תיבת החיתוך ביחס לצלחות עמדת צלחת ומיצוב כזה שהם מוטים ביחס לתיבת החיתוך.

יישומי ניתוח תמונה: דחיסת תמונה
ברגע שרצף של תמונות סורק בזמן שהושג, הוא חייב להיות מאוחסן באופן מאובטח באופן נגיש ברשת כדי להקל על ניתוח תמונה. קבצי התמונה שמראה את טווח סורק פרט תופסים כמות משמעותית של שטח בכונן קשיח. קובץ TIFF יחיד שנאסף ב4,800 dpi הוא כ 220 MB וריצת סורק טיפוסית מייצרת 200 קבצי תמונה. לכן, על 44 GB של שטח כונן קשיח נדרש לריצה. כדי להפחית את עלויות אחסון ושידור ברשת הקשורים לניתוח תמונה רצוי להפחית את כמות השטח הדרושה לנתוני תמונה בחנות ובו בזמן למזער אובדן נתונים. ניתוח במורד הזרם יהיה כרוך בזיהוי של כל שתיל בקבצי תמונה הבאים הקשורים לניסוי ארוך. לכן, פילוח את שתילים בודדים מתמונת הסורק יכול להקל על ניתוח במורד הזרם. מכיוון שפילוח של השתיל משאר התמונת דואר יכולה גם להפחית את האחסון של פיקסלים רקע מיותרים באופן משמעותי, גישה זו מובילה גם להפחתה משמעותית של גודל הנתונים. יתר על כן, אם ניתוח במורד הזרם הוא ברקמת שורש ממוקד זה לא יכול להיות הכרחי כדי לשמור על מידע בצבע מאז פיקסלים השורש צרים יחסית במרחב הצבעים שלהם. פרוטוקול עיבוד תמונה במחשב וקוד כדי להקטין את גודל הנתונים על ידי שני פילוח את שתילים בודדים והמרת תמונות לאפור בקנה מידה פותח. גישת התוצאה היא הפחתת 60% בדרישות אחסון.

זרימת העבודה המשמשת כדי להשיג דחיסת הנתונים אלה מתוארת בשלבים הבאים:

1. התחל עם סדרת זמן של קבצי תמונת סורק בתיקייה אחת.
2. עבור כל תמונה, להמיר מ RGB לאפור בקנה מידה (איור 8 למעלה).
3. לפצל את התמונה לצדדים ימני ושמאליים.
4. לחלץ כל שתיל מהתמונה לקובץ משלה (איור 8).הדבר נעשה על ידי החלת סף להמיר פיקסלים לשחורים או לבן ולאחר מכן חישוב עוצמת פיקסל הכוללת של כל שורת תמונה. השורה עם העצמה הגבוהה ביותר מזוהה וכל פיקסל מסווג כ 'מפעל' או 'nonplant' מבוסס על האינטנסיביות של שכנותיה. המרכז של כל 'מפעל' בשורה זו נמצא ומנקודה שתיבת יבול של גודל קבוע מראש מצוירת (איור 8, למטה).
5. צור תיקייה נפרדת לכל צד של התמונה (שמאל וימין) עם תיקיות משנה נפרדות לכל שתיל לאחסון של קבצי תמונת סדרת זמן בודד.
6. ארכיון התיקיות שנוצרו לתוך קובץ ZIP דחוס.

קוד שמשיג את הפעולות הבאות פותח באמצעות פייתון שפת תכנות 20. האלגוריתם מאפשר הפחתה של כ -60% בגודל הנתונים ומצליח בזיהוי כל השתילים הבודדים ב90% ממתארים לעצמי הסורקקבצי דואר ניתחו עד כה. הקודים הם זמינים באופן חופשי להורדה תחת גרסת הרישיון הציבורי הכללי של גני 3 (ראו לוח חומרים).

איור 1. הליך הסריקה מתחיל בנטיעת זרעים (עד תשעה זרעי ארבידופסיס לכל צלחת) ומסתיים עם אחסון נתונים ועיבוד תמונה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2. Emplate T לבנייה של תמיכת צלחת פטרי. Ple xiglas נחתך כך שיתאים לרוחב משטח אופקי (במקרה זה 227 מ"מ) והאורך היה 128 מ"מ. שני עיגולים בקוטר 88 מ"מ נחתכו מהחתיכה כזו שהם חולקו באופן שווה לאורך הרוחב והאורך של התמיכה שנותרה. התמיכה הוצמדה למשטח האופקי עם רצועות 3M פיקוד. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3. תצורת סורק לאחר שתילים כבר gravistimulated ואת מכסה מסמך המיקום. זה הוא התצורה של הסורק בצעד 1.21 של התקנת סורק ואוסף תמונות."_blank"> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 4. צילום מסך של הגדרות שנבחרו לצעד 1.8 של התקנת סורק ואוסף תמונות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 5. צילום מסך של תוכנת VueScan במהלך שלבי 1.9 1.10 של התקנת סורק ואוסף תמונות. התיבה האדומה מדגישה את גודל היבול תוך הקופסה הכחולה מדגישה הגדרות ספציפיות עבור r-X ומשמש על מנת ללכוד שתילים ומידע תווית לקזז y. האזור השטוח לסריקה מוצג כקו מקווקו באזור התצוגה המקדימה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 6. בחירת תיקיית יעד לצעד 1.12 של התקנת סורק ואוסף תמונות. לחיצה על הכפתור @ ליד תיבת תיקיית ברירת מחדל של שיח (חץ אדום) מאפשרת למשתמש לבחור את תיקיית היעד המתאימה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

מחדש 7 "עבור: תוכן width =" 5in "עבור: src =" / files/ftp_upload/50878/50878fig7highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50878/50878fig7.jpg "width =" "/> 600px
איור 7 (AD). התמונות לעיל הן דוגמאות לאלה שנאספו בשיטה המתוארת במאמר זה. פנלי A, B ו C, D הם התמונות הראשונות ואחרונה, בהתאמה, מתקופת סריקה בודדת., B להראות מלא סריקת אזור, ואילו C, D הוא אזור חתוך של האזור שנסרק, מראה צלחת אחת. ניתן לראות כמה סתירות. לוח מראה וריאציה בנביטה ובמסלול של צמיחה. לוח ב '(אותו שתילים כתמונה; 9 שעות מאוחר יותר) מראה שצלחות יכולות להצטבר התעבות. C ו-D פנלים נחשבים לתוצאות טובות בשל o צמיחה האיתנהו שתילים ואיכות תמונה לאורך כל הריצה. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 8. אלגוריתם דחיסת התמונה פיתח ממיר תמונת סורק לאפור בקנה מידה (למעלה). התמונה מחולקת לחצאים ימין ושמאל וגבולות תמונה הוסרו (לא מוצג). עמדותיהם של שתילים בודדים על כל מחצית מזוהות על ידי מציאת השורה עם סך עוצמת פיקסל הגדול ביותר. עמדות אלה המשמשים להגדרת אזור חיתוך חדש, יחול על כל השתילים בצלחת (התחתונה). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.