גידול בתאי גזע עצבי מאזורים קונבנציונליים ולא קונבנציונליים של המוח מכרסם מבוגרים

סיכום

תאי גזע עצביים שנקטפו מהמוח הבוגר מתרבים מנוצלים ביישומים החל המחקר הבסיסי של התפתחות מערכת עצבים לחקור יישומים קליניים פוטנציאליים ברפואת רגנרטיבית. זה הופך את השליטה קפדנית בתנאי הבידוד וculturing משמשים לגידול תאים אלה קריטיים להישמע תוצאות ניסוי.

תקציר

מחקר שנערך לאחרונה מוכיח כי מערכת עצבים מרכזית התחדשות (CNS) וtumorigenesis כרוך אוכלוסיות של תאי גזע (SCS) תושב בתוך המוח הבוגר. עם זאת, מנגנוני תאים בדרך כלל שקטים אלה מעסיקים על מנת להבטיח תפקוד תקין של רשתות עצביות, כמו גם את תפקידם בהחלמה מפציעה וההפחתה של תהליכי ניוון עצבי הם הבינו מעט. תאים אלה מתגוררים באזורים המכונים "נישות" המספקות סביבה תומכת מעורבת אותות ויסות משני כלי הדם ומערכת חיסונית. הבידוד, התחזוקה, והבידול של SCS במערכת העצבים המרכזית בתנאי תרבות מוגדרים שלא לכלול גורמים לא ידועים, הופכים אותם נגיש לטיפול באמצעים תרופתיים או גנטיים, ובכך לספק תובנות על התנהגות in vivo שלהם. כאן אנו מציעים מידע מפורט על השיטות להפקת תרבויות של SCS מערכת העצבים המרכזית מאזורים שונים של המוח המבוגר וגישות להערכת דפוטנציאל ifferentiation לנוירונים, האסטרוציטים, וoligodendrocytes במבחנה. טכניקה זו מניבה אוכלוסיית תאים הומוגנית כתרבות monolayer שיכול להיות דמיינו ללמוד SCs פרט וצאצאיהם. יתר על כן, ניתן להחיל אותו על פני מערכות מודל של בעלי החיים שונות ודגימות קליניות, שהשתמש בעבר כדי לחזות את תגובות משובי במערכת העצבים למבוגרים הפגועה.

מבוא

הדוגמה המרכזית לנוירוביולוגיה, שנקבעה על ידי התצפיות הבסיסיות של cytoarchitecture המוח שנעשה על ידי רמון קחל י 'לפני למעלה ממאה שנים, קבעה כי נוירוגנזה הייתה סבירה לאחר גיל ההתבגרות בהתחשב במורכבות של הרשתות עצביות שנמצאו במערכת העצבים המרכזית ^1. למרות עבודתו של אלטמן ב1960s, ומאוחר יותר קפלן, הוכחת כי ³ H-תימידין אפשר היה לציין בתאים בוגרים מצביעים על כך שלמעשה היו נוירונים שנוצרו באזורים שונים של המוח הבוגר, הדוגמה המשיכה להחזיק ^{2, 3.} ראיות המשיכו לעלות עם המחקר של Nottebohm המתאר את השינויים העונתיים במספר הנוירונים במוח של ציפור השיר נוכחי ^4. זה לא היה עד 1999, כאשר גולד ואח' עבודה. פורסם על הדור של נוירונים בהיפוקמפוס העליות עם הביצועים של משימות למידה אסוציאטיביות בחולדה, כמו גם התצפיות של הפגנות Kornack וRakicטינג המשיך נוירוגנזה במקוק המבוגר שהקונספט של מוח פחות נוקשה, פלסטיק יותר, הוכר ^{5, 6.}

החיפוש אחר המקור הסלולרי לדה נובו הנוירונים שנוצרו אלה להוביל לגילוי של אוכלוסייה נפרדת של תאי גזע (SCS) שמתגוררות באזורים במוח המכונה נישות ^7. אזור subventricular והאזור גרעיני תת של ההיפוקמפוס נחשבים לשני האזורים העיקריים נוירוגנית ^8,9. תאים מבודדים ממקומות אלה להציג את המאפיין הקלאסי של SCS נגזר עוברי או עוברי, התחדשות עצמית ואת פוטנציאל התמיינות. במקרה של תאי גזע עצביים (NSCs), הם יכולים להיות מובחנים לנוירונים, האסטרוציטים, וoligodendrocytes. בנוסף, SCS אלה להכתים חיוביים לסמני NSC עובריים כגון nestin חלבון נימה ביניים ^10. עבודה מאוחרת יותר מדגישה כי SCs לא יכול להיות מוגבלת לאלה לאוו האזורים, והם למעשה מקומיים בכל רחבי המוח כאוכלוסייה במידה רבה שקטה של תאים בחוזקה הקשורים לכלי הדם ^11.

התצפיות שSCs מגויסים בתגובה לפציעה מציעה את האפשרות של להיות מסוגלים לנצל את התאים האלה למטרות משובי כדי לסייע בהחלמה מההפרעה ושבץ ^{12, 13} ניווניות. זה לא בניגוד לתפקיד שתאי גזע mesenchymal (MSCs) לשחק בריפוי של רקמות חיבור, אשר נמצא כתאי perivascular שיש לו את הפוטנציאל להפוך לosteoblasts, כונדרוציטים, ותאי שומן ^14. עם זאת, לא יכול להיות שנקטפו NSCs באותו אופן כמו MSCs ממח עצם על ידי שאיפה שגרתית וטכניקות צנטריפוגה שיפוע צפיפות ומנוצל לאחר מכן בטיפולים בתאים מבוססים עצמיים. כתוצאה מכך, מקורות אחרים של תאים, כגון השימוש בNSCs העוברי או מבשרים עצביים הנגזר מEMBתאי גזע ryonic נחקרו בהרחבה במחלות בעלי חיים ומודלי פציעה בדרגות שונות של הצלחה ¹⁵ של. טכנולוגיות תא גזע pluripotent מושרה ניצול מקורות תא סומטי להציע עוד שדרת פוטנציאל לייצור טיפולים מבוססי תאים שימושיים טיפולית למגוון רחב של יישומים, להתגבר על הזמינות המוגבלת ודאגות אתיות בנוגע לשימוש בתאים עובריים וברקמות עובריות ^16. עם זאת, תרגום קליני של ממצאים אלה הוכיח להיות משימה קשה, כפי שמודגם במאבקים של טיפול במצבים נוירולוגיים שונים עם טיפול מבוסס-SC גישות ^17,18, כמו גם במסלול מפותל לאישור רגולטורים. כגישה חלופית, הקדמה של טיפולים תרופתיים ספציפיים יכולה לווסת את מספרי המל"ל ולהקל על התאוששות במודלים של המחלה ושבץ ¹⁹ פרקינסון. לא משנה מה האסטרטגיה יכולה להיות, הבנה כיצד לתפעל ביעילות את התאים האלהדורש מערכת נגישה במבחנה.

תרבויות של NSCs יכולות להתבצע גם כתרבויות כוללת, הידוע גם neurospheres, או כmonolayer ^8,20. שני הטכניקות היו בשימוש נרחב, המאפשרות את הקמתה של תנאים מוגדרים תרבות, כלומר שימוש בעוריות Growth Factor (EGF) או בסיסי פיברובלסטים Growth Factor (bFGF) כמקור mitogen, המספקים להרחבה של מבשרי multipotent. בעוד תרבויות neurosphere עשויות להיות מתאימות יותר ללימוד יכולת התפשטות משובט של סוג תא מבודד, המערכת הוכח לייצר אוכלוסייה מעורבת של תאים במהלך התרחבות ^21. בנוסף, המבנה הסגור של neurospheres עושה מניפולציה תרופתית של התאים לא מעשית, ואת הפרשנות של ההשפעה עשויים להיות גורמים אלה יכול להיות מבולבל בשל microenvironment הוקם בתוך neurosphere עצמו. תרבויות חד שכבתי, לעומת זאת, יכולות להיותמועסק במסכי תפוקה גבוהה של ספריות מולקולה קטנות, המספק כלי רב עוצמה כדי לחקור את מנגנוני העברת אותות המווסתים את הגדילה והתמיינות SC ופותח את ההזדמנות לגלות תרכובות רומן שמתמקדים אוכלוסיית תא זה.

כתוצאה מכך, את היכולת ליצור reproducibly תרבויות של NSCs המבוגר מאזורים השונים של עניין במוח יכולה לשמש במגוון רחב של יישומי מחקר, החל ממחקרים התפתחותיים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) לחקר גישות רפואת רגנרטיבית רומן . הפרוטוקול המובא כאן ממחיש כיצד לנתח ולהעריך את פוטנציאל ההתמיינות של SCS CNS מבודד מהמוח המכרסם המבוגר.

פרוטוקול

העבודה שומרת על מגילת Helsinski והצהרת בעלי החיים ארוו. בעלי חיים המשמשים לאיסוף רקמות וכל השיטות הרלוונטיות היו במעקב על פי ההנחיות של מתקן בעלי החיים באוניברסיטת דרזדן. בעלי חיים טופלו ושוכנו על פי ההנחיות פדרלי הגרמנית לשימוש וטיפול בבעלי חיים במעבדה, והמחקר אושר על ידי דרזדן Landesdirektion. נא להתייעץ עם המדיניות של המוסד שלך וטרינרים (IACUC או לוח אחר) אודות המתודולוגיה המתת חסד מתאימה.

ניתן למצוא מניות ספציפיות וריכוזים של חומרים כימיים עבודה בלוחות מגיב מלווים בפרוטוקול זה.

1. הכנת צלחת תרבות

1. מנות מעילים עם נפח מספיק של 75 מיקרוגרם / מיליליטר פולי-L-ornithine (כלומר 2 / טוב מיליליטר של צלחת 6 היטב) לילה בחממת תרבות תא 2 ימים לפני המועד המתוכנן לנתיחה.
2. לשאוב פולי-L-ornithine למחרת ולשטוף היטב כל אחד 2x עם 3 מיליליטר של PBS במשך 5 דקות.
3. הסר את לשטוף הסופי, ולאחר מכן להוסיף פיברונקטין (בדילול 1:250, 4 מיקרוגרם / מיליליטר PBS) לצלחת ומניח את הכלים באינקובטור במשך לילה.
4. לשאוב פיברונקטין ביום לנתיחה ולשטוף את הכלים 2X עם PBS. החזר את הצלחות עדיין מכילות PBS הסופי לשטוף לחממה עד הרקמה ניתק מוכנה לculturing. באותו זמן, להסיר את PBS לפני ציפוי הרקמה.
5. צלחות חנות מצופות פולי-L-ornithinein החממה לתקופה של עד 3 שבועות. צלחות מצופים פיברונקטין יכולות להיות מאוחסנות במשך שבוע עד 1. ציפוי פיברונקטין יכול להיעשות קטן כמו 2 שעות אם דחוף. פיברונקטין הוא רגיש denaturation; לא להתסיס את הפתרון, או שמנות להתייבש.

2. נתיחה / ציפוי

1. פרוטוקול זה חל על השימוש של 3 חולדות מבוגרים (3-6 חודשים של גיל).
2. צ'ילl מוח חתך בלוק על קרח לפני והרדמת חסד החולדה.
3. הנח צינור פלקון 15 מיליליטר המכיל 5 מיליליטר של מדיום N2 עם bFGF הוסיף על קרח.
4. להרדים את החולדות על פי מדיניות וטרינרי המוסד שלך.
5. הסר את המוח מהגולגולת על ידי ביצוע חתך את קו האמצע של הראש. שימוש במלקחיים כדי לקלף את העצם ומאפשר למוח להיות מופק בזהירות.
6. מניחים את המוח לתוך צלחת פטרי המכילה 10 סנטימטר קר כקרח PBS. זו תסיר את כל שיער ודם שיורית. (איור 1 א)
7. מניחים את המוח לבלוק חתך הצונן. (איור 1)
8. הכנס סכין גילוח הנקי חדש אחד לבלוק כמו בתמונה באיור 1 ג.
9. הכנס הזנב מ"מ שני גילוח נקי להב 3 לראשון כפי שמודגם באיור 1D.
10. רם בזהירות את הלהבים מהבלוק, לוקח איתם את החלק של ריבית.
11. תהלוכה שניותtion את הלהב על ידי טבילתו בPBS. (איור 1E)
12. רקמת קציר מהאזור של עניין (בדוגמא זו השתמשנו בהשליך קדמי, (ACA הקדמי), איור 1F) באמצעות # 5 מלקחיים ולאסוף לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר מכיל בינוני N2 1 מיליליטר המכיל bFGF.
13. העבר את הצינור לתוך מכסה המנוע הזרימה למינרית תרבות תא, בהמשך לשאר הפרוטוקול בתנאים סטריליים.
14. מכאני לנתק את הרקמות באמצעות פיפטה קצה מיליליטר 1 המצורף לpipettor P1000. כמה פעמים פיפטה מעלה ומטה (כ 20x בשיעור של מחזור pipetting 1 לשנייה) תוך כדי לחיצה על הפתיחה של קצה פיפטה נגד החלק התחתון של צינור חרוטי (איורים 1G 1-3). תפסיק טחינה דקה כאשר הפתרון הופך להיות הומוגנית.
15. אפשר הפתרון לשבת במשך 2 דקות, כדי לאפשר את כל רקמת nondissociated גדולה יותר כדי ליישב לתחתית. (איור 1G 4)
16. לאסוף homogensupernatant eous ומקום לתוך צינור חרוטי המכיל 8.5 מיליליטר של תקשורת N2 תוספת 20 bFGF ng / ml, 500 Dll4 מיליליטר / ng, 500 ng / ml Ang2, ו200 nMJAK מונעי.
17. צלחת אותם ל 3 בארות של צלחת 6 היטב באמצעות 3 מיליליטר של תמיסה מדוללת תא / כן.
18. מניחים את הצלחת לתוך תא חממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, 5% O _2.

3. טיפול יומי

1. החלף את המדיום על מנות התרבות עם N2 בינוני מכילות bFGF, Ang2, Dll4, וJAK מעכב 24 שעות לאחר ציפוי.
2. להוסיף בולוס של bFGF, Dll4, Ang2, ומעכב JAK ביום שלמחרת.
3. המשך בתהליך מתחלף זה של שינויים בתקשורת ותוספות גורם עבור סכום כולל של 10-14 ימים.

4. אינדוקציה של בידול

1. לסגת bFGF, Dll4, Ang2, ומעכב JAK מכיל בינוני ולהחליף אותו עם מדיום N2 שאינו מכיל גורמים נוספים בכל.
2. לשנות את המדיום כל יום שני.
3. תקן את התאים לאחר 10 ימים ולבצע immunocytochemistry.

5. איתור Immunocytochemical

1. לשאוב את המדיום ולתקן צלחות תרבית תאים עם 2 מיליליטר של paraformaldehyde 4% עבור 20 דקות.
2. לשטוף 2x עם 3 מיליליטר של PBS במשך 5 דקות כל אחד.
3. לשאוב PBS, אז permeabilize ולחסום את התאים על ידי הוספת 2 מיליליטר של PBS המכיל 5% בסרום נורמלי חמור (NDS) ו0.1% טריטון X-100 עבור 20 דקות.
4. מכין את תערובת הנוגדן העיקרית PBS המכילה 5% של NDS. נוגדן אנטי nestin יכול לשמש לזיהוי SCS, תוך Tuj1 (כיתה השלישית β-טובולין), ניתן להשתמש בם נוגדני GFAP, וCNPase יחד לצביעה משולשת של סמני בידול.
5. לשאוב את פתרון החסימה ולהוסיף 1.5 מיליליטר של תערובת הנוגדן הראשונית היטב כל אחד. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 90 דקות.
6. הסר את הנוגדנים הראשוניים ולשטוף 2x עם 3 מיליליטר של PBS, ו1X עם 3 מיליליטר של PBS המכיל 5% NDS במשך 5 דקות כל אחד.
7. Preparדואר הנוגדנים משני בPBS המכילים 5% של NDS.
8. לשאוב את לשטוף הסופי ולהוסיף 1.5 מיליליטר של פתרון נוגדנים משני היטב כל אחד. דגירה בחושך במשך 40 דקות בטמפרטורת חדר.
9. הסר את פתרון נוגדנים משני ולהוסיף 2 מיליליטר של כתם DAPI מוכן טרי (500 / מיליליטר ng PBS). דגירה במשך 3 דקות.
10. לשאוב את פתרון DAPI לאחר מכן לשטוף 3x עם 3 מיליליטר של PBS במשך 5 דקות כל אחד. כעת ניתן דמיינו התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תוצאות

זיהוי האזור של עניין שממנו לקצור תאי גזע עצביים הוא הצעד הראשון הקריטי ויגדיר את משך זמן שנדרש כדי לקבל צלחת ומחוברות של תאים. לדוגמא, SVZ הוא אזור נוירוגנית קלאסי ולכן יש חלקם יחסי גבוה יותר של תאי גזע עצביים. עם זאת, הטכניקה שהוצגה כאן ניתן להשתמש באזורים אחרים לא לעתים קרובות מוכרים כבעל פוטנציאל עצבי חזק במהלך הבגרות. למטרות פרוטוקול זה, אנו משמשים השלכנו הקדמי (חלק קדמי). בעוד שחלק מהתאים והפסולת יישבו על ציפוי, הבינוני יהיה בדרך כלל להישאר עכור כתוצאה מכמות החומר תאי שהיא טח...

דיון

רבים מהשלבים קריטיים לבידוד מוצלח, הרחבה, והתמיינות של תאי גזע עצביים מהמוח הבוגר משותפים במשותף עם טכניקות תרבות תקן רקמות. המטרה לזכור היא שNSCs מבודד מהמוח המבוגר צריך לשמור על כמה שיותר מin vivo המאפיינים שלהם ככל האפשר (איור 2J). לעתים קרובות איזון בין זהירות ראויה ומהירות מתאימה צריך להיות פגע. אכפת לי עם הבידוד של המוח מהגולגולת יעשה זיהוי של האזור של עניין קל יותר באופן משמעותי. הסרת הרקמה במהירות אפשרית הבאים euthanization בעלי החיים, ושמירה על ק...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחות תרבית רקמה 6 בארות	BD Biosciences	353934
פולי-L-אורניתין	סיגמא-אולדריץ'	P-3655	5 מ"ג/מ"ל תמיסת מלאי שהוכנה במים מזוקקים כפולים (יציבה במשך מספר חודשים ב-20 מעלות; C). ריכוז עבודה 0.5 מ"ג/מ"ל במים (יציב למשך חודש ב-4 מעלות; C).
פיברונקטין	R& D Systems	1030-Fn	אל תעורר תמיסת מלאי
מכשיר סינון	קורנינג מדעי החיים	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	ראה הערה למטה להכנת מדיה N2 מלאה
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
אינסולין	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	פתרון מלאי 1 M ב-ddH2O (יציב ב-20 מעלות; C למשך 6 חודשים)
נתרן סלניט	סיגמא-אולדריץ'	S-5261	500 ומיקרו; תמיסת מלאי M ב-ddH2O (יציב ב-20 ° C למשך 6 חודשים)
פרוגסטרון	סיגמא-אולדריץ'	P-8783	100 ומיקרו; תמיסת מלאי M באתנול (יציב ב-20° C למשך 6 חודשים)
פניצילין/סטרפטומיצין	Invitrogen	15140-122
פוספט חוצץ מי מלח	Mediatech	21-040-CV
גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF)	R& D Systems	233-FB	ריכוז עבודה 20 ng/ml
דלתא4 (Dll4)	מו"פ D Systems	1389-D4	ריכוז עבודה  500 ננוגרם/מ"ל
אנגיופואטין 2 (Ang2)	R& D Systems	623-AN	ריכוז עבודה  500 ננוגרם/מ"ל
מעכב JAK	Calbiochem	420099	ריכוז עבודה 200 ננומטר
סרום בקר אלבומין	סיגמא-אולדריץ'	A-2058
צינורות חרוטיים של 15 ו-50 מ"ל	קורנינג מדעי החיים	430053, 430829
פריטים נחוצים אחרים כוללים: מכשירי דיסקציה כלליים, כולל סכין גילוח ומלקחיים, חולדה בוגרת (בת 3-6 חודשים; Sprague-Dawley או Long Evans), תא שיכרון CO2, מכסה זרימה למינרי לתרבית תאים ואינקובטור אינקובטור (לחות, 37 & deg; C, 5% CO<תת>2, 5% O2). הערה: להכנת מדיה N2 מלאה, לבקבוק אחד של DMEM/F-12 (500 מ"ל) יש להוסיף 0.05 גרם אפוטרנספרין, 0.0125 גרם אינסולין (מומס טרי ב-1 מ"ל של 10 מ"מ NaOH), 50 μ l של putrescine, 30 μ L של נתרן סלניט, 100 μ l של מלאי פרוגסטרון, ו-5 מ"ל של תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין.  התאם את ה-pH ל-7.2, במידת הצורך. יש לסנן ולעקר ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C עד 3 שבועות ולהגן מפני אור.
טבלת ריאגנטים אימונופלואורסצנטיים
Paraformaldehyde	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	15719
סרום חמור רגיל (NDS)	סיגמא-אולדריץ'	D-9663
טריטון X-100	סיגמא-אולדריץ'	T-8787
4,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI)	סיגמא-אולדריץ'	D-8417	מלאי 5 מ"ג/מ"ל תמיסה במתנול
טבלת נוגדנים ראשונית
Nestin	Chemicon	MAB353	גורם דילול: 1:400 מין: עכבר IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	גורם דילול: 1:100 מין: ארנב IgG
Sox2	R& D Systems	MAB2018	גורם דילול: 1:100 מין: עכבר IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	גורם דילול: 1:200 מין: עכבר IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R& D Systems	MAB1195	גורם דילול: 1:500 מין: עכבר IgG2a
חלבון חומצי סיבי גליה (GFAP)	Dako North America	Z0334	גורם דילול 1:500 מינים: ארנב
טבלת נוגדנים משנית
Alexa    568	Invitrogen	A-21124	גורם דילול: 1:200 מין: עז נגד עכבר IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	גורם דילול: 1:200 מין: עז נגד עכבר IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	גורם דילול: 1:200 מין: עז נגד ארנב