הגירת neuroblast היא אירוע מהותי בנוירוגנזה לאחר לידה. אנו מתארים פרוטוקול תיוג יעיל של neuroblasts ידי in vivo electroporation לאחר לידה ולאחר מכן להדמיה של ההגירה שלהם באמצעות זמן לשגות הדמיה של פרוסות מוח חריפות. אנו כוללים תיאור לניתוח כמותי של דינמיקת neuroblast ידי מעקב וידאו.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
In vivo electroporation ואחרי הלידה וזמן לשגות הדמיה של neuroblast הגירה בעכבר חריפה פרוסות המוח
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
אזור subventricular (SVZ) הוא אחת מהנישות העצביות העיקריות במוח לאחר הלידה. כאן, אבות עצביים להתרבות ולהצמיח neuroblasts מסוגל לנוע לאורך הנחל מקורי נודד (RMS) לכיוון הנורה חוש הריח (OB). נדידה למרחקים ארוכים זו נדרשת להבשלה המאוחרת של נוירונים יילוד בOB, אבל המנגנונים המולקולריים המסדירים את התהליך הזה עדיין אינם ברורים. חוקר את מסלולי איתות שליטה תנועתיות neuroblast יכול לא רק לעזור להבין צעד מהותי בנוירוגנזה, אבל יש גם פוטנציאל התחדשות טיפולי, בהתחשב ביכולת של neuroblasts אלה כדי למקד לאתרים במוח מושפעים מפציעה, שבץ מוחי או ניוון.
בכתב היד הזה אנו מתארים פרוטוקול מפורט לin vivo electroporation לאחר הלידה והזמן לשגות ההדמיה הבאה של הגירת neuroblast בRMS העכבר. electroporation אחרי הלידה יכול ביעילות transfect אב SVZתאים, אשר בתורו ליצור neuroblasts נודד לאורך RMS. באמצעות confocal ספינינג מיקרוסקופיה זמן לשגות דיסק בתרבויות פרוסה מוח חריפים, הגירת neuroblast ניתן לנטר בסביבה הדומה למצב in vivo בשיתוף פעולה הדוק. יתר על כן, תנועתיות neuroblast יכולות להיות במעקב וכמותית מנותחת. כדוגמא, אנו מתארים כיצד להשתמש בvivo electroporation לאחר הלידה של פלסמיד-GFP-לבטא לתייג ולדמיין neuroblasts נודד לאורך RMS. גם electroporation של פלסמידים-להביע recombinase shRNA או CRE בעכברים בנוקאאוט מותנים העסקת מערכת LoxP יכול לשמש יעד הגנים של עניין. מניפולציה תרופתית של תרבויות פרוסה מוח חריפות ניתן לבצע כדי לחקור את התפקיד של מולקולות איתות שונות בהגירה neuroblast. על ידי צימוד ב electroporation vivo עם הזמן לשגות הדמיה, אנו מקווים להבין את המנגנונים המולקולריים שליטה תנועתיות neuroblast ולתרום לפיתוחment של גישות חדשות כדי לקדם את תיקון מוח.
מבוא
במוח של היונקים, הדור של נוירונים חדשים (נוירוגנזה) מתרחש לאחר לידה בעיקר בשני אזורים, אזור subventricular (SVZ) של החדרים לרוחב ואזור subgranular ברכס משוננת של ההיפוקמפוס 1. ראיות רבות שנאספו בשנים האחרונות תומכת בתפקיד קריטי לנוירוגנזה לאחר לידה בתפקודי זיכרון הנורה בהיפוקמפוס וחוש ריח 1-3. חשוב לציין, נוירוגנזה לאחר הלידה גם בעל פוטנציאל טיפולי בגלל מערכת היחסים שלה עם הפרעות נוירולוגיות ניווניות, ואת היכולת של neuroblasts להגר לאתרים פגועים במוח 4-6.
אזור subventricular (SVZ) התפתחה לאחרונה כנישת נוירוגנית מכרעת. neuroblas....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הליך זה הנו בהתאם לתקנות בבריטניה המשרד הביתית (חוק נהלי בעלי החיים מדעיים, 1986). מדענים צריכים לעקוב אחר ההנחיות שנקבעו ואושרו על ידי ארגוני בעלי החיים שלהם מוסדיים ולאומיים רגולציה.
1. אחרי הלידה Electroporation
1.1. הכנת זכוכית נימים, ה-DNA הפתרון וelectroporator
- הכן את הנימים משכו זכוכית (OD: 1.5 מ"מ, מק"ט: 0.86 מ"מ) להזרקת ה-DNA. (הגדרות אינדיקטיביים לחולץ נימי סאטר P-97 הן: חום 283; משכו 50; Velocit....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תיוג של neuroblasts נודד נגזר SVZ ניתן לצפות יחד RMS, בדרך כלל 4-8 ימים לאחר electroporation מוצלח (איור 1). יכולות להיות גם שנבחרו נקודות זמן ארוכות יותר, אך פחות תאים יימצאו בRMS מאחר שרובם יהיה נכנסו OB. Neuroblasts להתחיל לרכוש מורפולוגיה ותכונות אופייניות של תאי גרגיר בוגרים בOB סביב 2-3 שבועות לאחר electroporation (לא מוצגת). לאחר culturing ל~ 1 שעות, פרוסות מוח מגורי עכבר electroporated ניתן הדמיה באופן אמין לתקופה של עד 3-4 שעות. כפי שדווח בעבר 23,26,.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הגירה יעילה של אבות עצביים לאורך RMS מבטיחה ההתבגרות הבאה שלהם לתוך הנוירונים פונקציונליים 10. בולטים זרמים של אבות עצביים מכוונים OB גלויים בינקות אדם ועשויים לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות המוח האנושי לאחר לידה המוקדמת 27. יתר על כן, תאים אלה מסוגלים למקד לאתרים של המוח המושפע מפציעה ו4,28 ניוון מוחיים. היכולת לפקח בזמן אמת האפקט של מניפולציה גנטית על דינמיקת neuroblast הופכת להיות חיונית כדי להבין איך תנועת neuroblast מונחה ומוסדרת.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש המחברים אין לחשוף.
תודות
טרשת נפוצה וYZ נתמכים על ידי studentships PhD KCL וKCL-סין. MO מומן על ידי מלגת לימודי דוקטורט ביוטכנולוגיה ומחקר מדעי הביולוגיה מועצה. אנו מודים מאסארו Okabe ויוני ichi מיאזאקי לפלסמיד PCX-EGFP ואלן Chedotal ויתנה Ypsilanti לייעוץ רב ערך על electroporation.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Millicell | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 מ"מ צלחת תרבית תחתונה מזכוכית | MatTek | P35G-0-14-C | |
| מדיה מאוזנת של Gey's | Sigma | G9779-500ML | |
| גלוקוז, 45% | Sigma | G8769-100 מ"ל | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| עט/ Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| תוסף B27 | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-גלוטמין | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM (נטול פנול אדום) | GIBCO | 31053-028 | |
| סיגמא ירוק מהיר | F7252-5G | ||
| נימי זכוכית להזרקה | מכשיר הרווארד | 30-0057 | |
| צינור שואב | סיגמא | A5177 | |
| סאטר P-97 חולץ נימי | מכשיר סאטר | P-97 | |
| ECM830 גל מרובע אלקטרופורטור | הרווארד | מכשיר 45-0052 | |
| פינצטה פלטינה 7 מ"מ | מכשיר הרווארד | 45-0488 | |
| מתג רגליים דגם 1250F | מכשיר הרווארד | 45-0211 | |
| ג'ל לאלקטרודות | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurane | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| דבק | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX מערכת דיסק מסתובב | פרקין אלמר | התקנה מותאמת אישית (ניתן להשתמש במספר מקורות לייזר) מצוידת במצלמת Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD | |
| תוכנה Volocity | פרקין אלמר | רכישה, כמות, הדמיה מודולים | |
| תא סביבתי למיקרוסקופיה | Solent Scientific | ||
| מיקרוסקופ הפוך Ti-E | ניקון | CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA המטרה מומלצת ליישום המתואר במאמר זה |
מקורות
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
