Method Article

פלטפורמה מבוססת FRET תואמת תפוקה גבוהה לזיהוי ואפיון של מודולטורים של שרשרת אור בוטולינום נוירוטוקסין

DOI:

10.3791/50908

⸱

December 27th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, The Scripps Research Institute, 2Worm Institute of Research and Medicine (WIRM), The Scripps Research Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שרשרת הקלה של הבוטולינום נוירוטוקסין מסוג A (BoNT/A LC) היא מטאלופרוטיאז שנכנס לנוירונים מוטוריים, מבקע את המצע שלו SNAP-25 ומשבש את ההולכה העצבית, ובכך גורם לשיתוק רפוי. באמצעות בדיקה מבוססת FRET תואמת תפוקה גבוהה, ניתן לסנן ספריות גדולות של מולקולות קטנות להשפעתן על הפעילות האנזימטית של BoNT/A LC.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Botulinum neurotoxin (BoNT) הוא רעלן חיידקי חזק ועלול להיות קטלני שנקשר לנוירונים מוטוריים מארחים, מופנם לתוך התא ומבקע חלבונים תוך-תאיים החיוניים לשחרור נוירוטרנסמיטרים. BoNT מורכב משרשרת כבדה (HC), המתווכת קשירה והפנמה של תאי מארח, ושרשרת קלה (LC), המבקעת חלבוני מארח תוך תאיים החיוניים לשחרור אצטילכולין. בעוד שלטיפולים המעכבים קשירה/הפנמה של רעלנים יש חלון זמן קצר של מתן רעלן, לתרכובות המכוונות לפעילות LC תוך תאית יש חלון זמן גדול בהרבה של מתן רעלן, רלוונטי במיוחד בהתחשב במחצית החיים הארוכה במיוחד של הרעלן. בשנים האחרונות, מולקולות קטנות נותחו בכבדות כמעכבי LC פוטנציאליים על סמך החדירות התאית המוגברת שלהן ביחס לטיפולים גדולים יותר (פפטידים, אפטמרים וכו'). זיהוי עופרת כרוך לעתים קרובות בסינון תפוקה גבוהה (HTS), שבו ספריות גדולות של מולקולות קטנות מוקרנות על סמך יכולתן לווסת את תפקוד המטרה הטיפולי. כאן אנו מתארים בדיקה מבוססת FRET עם מצע BoNT/A LC מסחרי ו-LC רקומביננטי שניתן להפוך לאוטומטי עבור HTS של מעכבי BoNT פוטנציאליים. יתר על כן, אנו מתארים טכניקה ידנית שיכולה לשמש להקרנה משנית מעקב, או להשוואת העוצמה של מספר תרכובות מועמדות

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Botulinum neurotoxin A (BoNT/A), הרעלן החזק ביותר הידוע כיום (LD50 ~ 1 ng/kg)1, הוא נוירוטוקסין רב עוצמה המיוצר על ידי החיידק Clostridium botulinum. בתוך מארח מושפע, BoNT/A משבש את ההולכה העצבית בצומת העצבי-שרירי על ידי קשירת נוירונים מוטוריים, הפנמה לתוך הציטוזול, ובסופו של דבר פיצול חלבונים עצביים החיוניים לאקסוציטוזיס אצטילכולין. ברגע שנכנס לתא עצב, BoNT/A יכול להימשך עד מספר חודשים2. עיכוב ארוך טווח של שחרור אצטילכולין מעכב את התכווצות השרירים הרגילה וגורם לשיתוק רפוי, שבמקרים חמורים עלול לגרום לאי ספיקת לב ו/או נשימה. בגלל עוצמתו הקיצונית, קלות הייצור וההשפעות ארוכות הטווח שלו בתוך המארח, ה-CDC תייג את כל הסרוטיפים של BoNT כסוכני טרור ביולוגי בסיכון גבוה.

מנגנון הפעולה של הרעלן כולל שלבים רבים, כולל קשירה לקולטני פני השטח העצביים, קליטה תאית באמצעות אנדוציטוזיס בתיווך קולטנים, וטרנסלוקציה לתוך ציטוזול הנוירונים. BoNT/A מורכב משתי שרשראות, שרשרת כבדה וקלה, ושתי השרשראות נדרשות לרעילות. השרשרת הכבדה (HC) מכילה תחומי קשירה וטרנסלוקציה, בעוד שהשרשרת הקלה (LC) היא מטאלופרוטיאז תלוי אבץ העובר מהאנדוזום לציטופלזמה. ברגע שנכנס לציטוזול, ה-LC/A metalloprotease מתמקם בקרום הציטופלזמי הפנימי ומבקע את החלבון המארח הקשור לממברנה SNAP-25. SNAP-25 הוא חבר במשפחת החלבונים SNARE (קולטן חלבון מסיס N-Ethylmaleimide-Sensitive Factor Attachment Receptor), הממלא תפקיד מכריע באקסוציטוזיס אצטילכולין (נסקר בהפניה3). מחשוף LC/A של SNAP-25 פוגע בתפקוד המורכב של SNARE, המעכב שחרור נוירוטרנסמיטר אצטיכולין ופוגע בהתכווצות השרירים.

נכון לעכשיו, הטיפול בבוטוליזם מוגבל וכולל לעתים קרובות מתן נוגדן מנטרל סוסים4; עם זאת, מכיוון שהרעלן מופנם במהירות לתאי עצב, לנוגדנים יש חלון זמן צר למתן הנוגדן. לפיכך, חוקרים רבים מאמינים כי BoNT/A LC עשוי להיות מטרה טיפולית טובה יותר. מכיוון שה-LC הוא מטאלופרוטיאז תלוי אבץ, גישה אחת לעיכוב פעילות LC/A הייתה לפתח תרכובות שמכילות את יון האבץ באתר הפעיל. לדוגמה, תרכובות הידרוקסאמט מכללות את האבץ באתר הפעיל ויש להן עוצמה מצוינת במבחנה (Ki של מעכב המולקולות הקטנות הטוב ביותר של BoNT/A LC עד כה הוא 77 ננומטר)5. עם זאת, מולקולות קטנות רבות אינן מצליחות להתקדם כטיפולים עקב בעיות שונות ex vivo או in vivo, כולל מסיסות מימית ירודה, חילוף חומרים מהיר ו/או ציטוטוקסיות גבוהה. לכן יש צורך בתרכובות חדשות בעלות תכונות פרמקולוגיות ופרמקוקינטיות משופרות. זיהוי תרכובות מולקולות קטנות כרוך לעתים קרובות בהקרנה בתפוקה גבוהה (HTS) לזיהוי פיגומים חדשים. השיטות הראשוניות לסינון פעילות BoNT/A LC התבססו על זיהוי HPLC של מחשוף מצע פפטיד קצר, שגוזל זמן ואינו מתאים ליישומי HTS6-8. לאחר מכן, שמידט ועמיתיו9 פיתחו בדיקת פעילות BoNT/A LC בעלת תפוקה גבוהה המשתמשת במצע פפטיד עם תווית פלואורסצאין המחובר קוולנטית לצלחת מיקרוטיטר. ה-BoNT/A LC חותך את המצע ומשחרר פלואורסצאין, אותו ניתן לכמת באמצעות פלואורומטר. פורמט הצלחת של בדיקה זו מאפשר לסנן תרכובות רבות בו זמנית; עם זאת, הבדיקה דורשת תיוג פפטידים סינתטיים עם פלואורסצאין וציפוי לוחות הבדיקה במולקולות מצע נגזרות, שהן טכניקות מסורבלות. שיטה פשוטה בהרבה לזיהוי פעילות BoNT/A LC בריכוזים נמוכים תוארה מאוחר יותר על ידי שמידט ועמיתיו, שם נעשה שימוש בסדרה של מצעים פלואורוגניים כדי לנטר את פעילות BoNT LC בזמן אמת10. טכניקות נוספות המתוארות בספרות כוללות בדיקה מבוססת דפולריזציה לאחר העברת אנרגיה תהודה לאיתור וכימות פעילות BoNT בתמציות גולמיות; ניתן להשתמש בשיטה זו עבור יישומים בעלי תפוקה גבוהה10,11, אם כי היא דורשת ציוד מתוחכם למדידת העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית (FRET) ואותות קיטוב. לבסוף, דווחו מספר מודלים מבוססי תאים לשיכרון BoNT (נסקרו בהפניה11) שיאפשרו לחוקרים לחקור את התכונות המגבילות לעתים קרובות של תרכובות שהוזכרו קודם לכן, כולל ציטוטוקסיות, חדירות תאים ויציבות. עם זאת, רוב הבדיקות מבוססות התאים הקיימות אינן ניתנות להתאמה ל-HTS, והן עתירות עבודה וזמן.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לשיטת HTS המשתמשת במצע BoNT/A LC מבוסס FRET הזמין מסחרית. המצע מבוסס על רצף המחשוף SNAP-25 והוא פפטיד סינתטי של 13-mer המכיל פלואורופור ומרווה. מחשוף BoNT/A מפריד בין הפלואורופור למרווה, מבטל FRET ומגדיל את הקרינה הנמדדת, אותה ניתן למדוד באופן רציף בקורא לוחות פלואורומטר. הבדיקה משמשת באופן שגרתי במעבדות שלנו, כמו גם במעבדות אחרות, כדי לזהות סוגים חדשים של מעכבי BoNT/A LC או כדי לקבוע את העוצמה היחסית של תרכובות שזוהו בעבר5,12-15. בדיקה זו מתאימה ל-HTS בגלל הפשטות, פוטנציאל האוטומציה, העלות הנמוכה של החומרים והיכולת לסנן תרכובות רבות בו זמנית (ראה התייחסות16; Caglič et al., הוגש; Bompiani et al., בהכנה). בנוסף ל-HTS, ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי להשוות את העוצמה היחסית של תרכובות על ידי קביעת ערך ה-IC50 (הריכוז הנדרש לעיכוב 50% מפעילות BoNT/A LC) של תרכובת. הבדיקה יכולה להתבצע באופן ידני בפורמט של 96 בארות (קטע סינון ידני של טקסט הפרוטוקול) או יכולה להיות אוטומטית בפורמט של 384 בארות עבור HTS (קטע הפעלה אוטומטית של טקסט הפרוטוקול).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סינון ידני או קביעת IC50

ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לקבוע את העוצמה היחסית של תרכובת (ערך IC50) על ידי הכנת סדרת דילול של התרכובת, או כדי לסנן ידנית מעכבי מולקולות קטנות בריכוז יחיד.

1. הכנת חוצצים, ריאגנטים ומכשור נדרש

  1. הכן 50 מ"ל של מאגר בדיקה (40 מ"מ HEPES, pH 7.4 ו-0.01% Tween-20) ועקר מסנן. ניתן לאחסן את המאגר בטמפרטורת החדר (RT) למשך מספר חודשים.
  2. הכן דילול עבודה של 70 ננומטר של נוירוטוקסין בוטולינום רקומביננטי/שרשרת קלה (LC/A (1-425))17 במאגר בדיקה, מערבולת עדינה ואחסן על קרח. בדיקה של כל תרכובת דורשת לפחות 120 מיקרוליטר של דילול עבודה LC/A.
  3. הכן דילול עבודה של מצע BoNT/A LC מבוסס 7 מיקרומטר FMET במאגר בדיקה המכיל 10% DMSO. בתחילה יש לדלל תמיסת מלאי של 5 מ"מ של המצע בנפח מתאים של 100% DMSO, ולאחר מכן להוסיף לאט (מבחינת טיפה) את מאגר הבדיקה תוך כדי ערבוב עדין. עוטפים בנייר כסף ושומרים על קרח. בדיקה של כל תרכובת דורשת לפחות 130 מיקרוליטר של דילול העבודה של המצע.
  4. הגדר קורא לוחות מיקרוטיטר פלואורסצנטי כדי לנער את הצלחת במהירות בינונית למשך 10 שניות, ולאחר מכן נטר את הקרינה באורכי גל עירור ופליטה של 490 ננומטר ו-523 ננומטר, בהתאמה, כל 5 דקות (מצב קינטי) למשך 90 דקות ב-RT. שימו לב שהיווצרות המוצר (כלומר העלייה בקרינה) היא ליניארית לאורך פרק זמן זה (איור 1A).

2. הכנת סדרת דילול מורכב

  1. קבע את טווח ריכוז התרכובת (כלומר מספר הדילולים בסדרת הדילול וגורם הדילול); טווח הריכוזים נבחר על סמך ערך ה-IC50 הצפוי כדי להבטיח התאמת עקומה אופטימלית. עבור תרכובות עם IC50 לא ידוע, השתמש במלאי תרכובות לא מדולל כריכוז התרכובות הגבוה ביותר.
  2. סמן שפופרות עם שם התרכובת והריכוז המתאימים.
  3. יש להקצות 100% DMSO לכל הצינורות כדי להכין אותם לדילול סדרתי מורכב. מומלץ נפח דילול סופי של מינימום 2 מיקרוליטר, כאשר נעשה שימוש ב-1 מיקרוליטר מכל ריכוז לכל באר בלוחית הבדיקה. לדוגמה, סדרת דילול סטנדרטית של 1:3 דורשת ערבוב של 2 מיקרוליטר של תרכובת עם 4 מיקרוליטר DMSO לכל צינור.
  4. הכן דילולים סדרתיים של תרכובות ומערבולת או ערבב ידנית היטב בין כל דילול; החלף את קצות הפיפטה בין כל דילול. עבור סדרת הדילול הסטנדרטית של 1:3, הוסף 2 מיקרוליטר של התרכובת הלא מדוללת ל-4 מיקרוליטר של DMSO בשפופרת הראשונה של סדרת הדילול וערבב היטב. בעזרת קצה פיפטה חדש, הסר 2 מיקרוליטר מהדילול הראשון והוסף ל -4 מיקרוליטר של DMSO בצינור השני; מערבבים היטב. חזור על הדילולים הנותרים. הקפידו לערבב היטב את דילולי התרכובות כדי להבטיח שריכוזי התרכובות מדויקים.
  5. מכסים את צינורות המתחם ומניחים בצד ב-RT.

3. הכנת צלחת ואיתור (טבלה 1)

  1. השג צלחת שטוחה, אטומה, שחורה עם 96 בארות. ראה את הגדרת הלוחות המומלצת בטבלה 1, כאשר כל סדרת דילול מורכב מעוצבת בשורות של צלחת של 96 בארות. הוצא ידנית 1 מיקרוליטר של דילול התרכובת המתאים ישירות לתחתית כל באר מתאימה (בארות 1-9). יש להוציא 1 מיקרוליטר מהריכוז הגבוה ביותר של התרכובת שיש לבדוק לבאר 11 (בקרת פלואורסצנטיות פנימית של תרכובת).
  2. הוצאה ידנית של 1 מיקרוליטר של מעכב חזק ידוע לבאר 12 (בקרה חיובית), ו-1 מיקרוליטר 100% DMSO לבאר 10 (בקרה שלילית).
  3. בעזרת פיפטור אוטומטי, הוצא 79 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לצד בארות 1-10 ו-12 (דילולים מורכבים ובקרה חיובית), ו-89 מיקרוליטר לצד באר 11 (בקרת פלואורסצנטיות פנימית מורכבת). הקפד לא לגעת בקצה לתחתית הבאר שבה קיים תרכובת כדי לא לזהם את הבארות.
  4. מערבולת את דילול העבודה LC/A והשתמש בפיפטור אוטומטי כדי להוסיף 10 מיקרוליטר לצד של כל באר, למעט באר 11 (בקרת פלואורסצנטיות פנימית מורכבת). יש לטפוח בעדינות על הצלחת כדי לוודא שכל האנזים הנוסף מגיע לתחתית הבאר.
  5. מערבבים בעדינות, מכסים ומדגרים את הצלחת למשך 5 דקות ב-RT. דגירה זו מספקת שלב טרום-שיווי משקל לתרכובות להיקשר ל-LC/A לפני הוספת הסובסטרט.

4. תוספת מצע ומדידת פלואורסצנטיות

  1. מערבל בעדינות את מצע ה-BoNT/A LC, ובעזרת פיפטור אוטומטי הוסף 10 מיקרוליטר של מצע לצד השני של כל באר. הקפד להוסיף את המצע לצד הבאר הנגדית למקום שבו נוסף האנזים קודם לכן.
  2. הקש בעדינות על הצלחת כדי לערבב את הריאגנטים, הנח מיד בקורא הצלחות והתחל במדידת הקרינה עם ההגדרות שצוינו קודם לכן בשלב 1.4.
  3. מהירויות האנזים מחושבות משיפוע הקו שנוצר על ידי גרף יחידת הקרינה היחסית (RFU) לעומת הזמן במהלך התקופה הליניארית של התגובה.

טבלה 1.פריסת לוחית בדיקה מוצעת.

<גבול טבלה="1"> ובכן # תיאור טוב תרכובת מאגר בדיקה המצע ל.ק. DMSO 1 מינון תרכובת 1 1 מיקרוליטר 79 מיקרוליטר 10 מיקרוליטר 10 מיקרוליטר --- 2 מינון מורכב 2 1 מיקרוליטר 79 מיקרוליטר 10 מיקרוליטר 10 מיקרוליטר --- 3 מינון מורכב 3 1 מיקרוליטר 79 מיקרוליטר 10 מיקרוליטר 10 מיקרוליטר --- 4 מינון מורכב 4 1 מיקרוליטר 79 מיקרוליטר 10 מיקרוליטר 10 מיקרוליטר --- 5 מינון מורכב 5 1 מיקרוליטר 79 מיקרוליטר 10 מיקרוליטר 10 מיקרוליטר --- 6 מינון מורכב 6 1 מיקרוליטר 79 מיקרוליטר 10 מיקרוליטר 10 מיקרוליטר --- 7 מינון תרכובת 7 1 מיקרוליטר 79 מיקרוליטר 10 מיקרוליטר 10 מיקרוליטר --- 8 מינון מורכב 8 1 מיקרוליטר 79 מיקרוליטר 10 מיקרוליטר 10 מיקרוליטר --- 9 מינון מורכב 9 1 מיקרוליטר 79 מיקרוליטר 10 מיקרוליטר 10 מיקרוליטר --- 10 שליטה שלילית
(100% פעילות LC) --- 79 מיקרוליטר 10 מיקרוליטר 10 מיקרוליטר 1 מיקרוליטר 11 בקרת פלואורסצנטיות פנימית מורכבת 1 מיקרוליטר 89 מיקרוליטר 10 מיקרוליטר --- --- 12 שליטה חיובית
(0% פעילות LC) 1 מיקרוליטר 79 מיקרוליטר 10 מיקרוליטר 10 מיקרוליטר ---

פעולה אוטומטית עבור סינון תפוקה גבוהה

5. הכנת חוצצים, ריאגנטים, לוחות מורכבים, ברקודים ומכשור נדרש

  1. הפשירו את צלחות תרכובת הציר האטומות בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות.
  2. הכן 500 מ"ל (או יותר, תלוי במספר התרכובות למסך) של מאגר הבדיקה (40 מ"מ HEPES, pH 7.4 ו-0.01% Tween-20) ועיקור מסנן. ניתן לאחסן את מאגר הבדיקה המסונן ב-RT למשך מספר חודשים.
  3. הכן דילול עבודה של 8.75 ננומטר של BoNT/A LC רקומביננטי (1-425) במאגר בדיקה, מערבולת, ואחסן על קרח. כל באר בצלחת 384 בארות בנפח נמוך דורשת 8 מיקרוליטר. הכינו עודף של 10-15%, או כ -3.7 מ"ל או כל צלחת בנפח נמוך של 384 בארות.
  4. הכן דילול עבודה של מצע BoNT/A LC מבוסס 3.5 מיקרומטר במאגר בדיקה המכיל 10% DMSO. בתחילה יש לדלל את תמיסת המלאי של 5 מ"מ של המצע ישירות בנפח המתאים של 100% DMSO, ולאחר מכן להוסיף לאט (מבחינת טיפה) את מאגר הבדיקה תוך כדי ערבוב עדין. עוטפים בנייר כסף ושומרים על קרח. כל באר בצלחת 384 בארות בנפח נמוך דורשת 2 מיקרוליטר. הכינו עודף של 10-15%, או כ -1 מ"ל לכל צלחת 384 בארות בנפח נמוך.
  5. הכן ברקודים לכל לוחית מיקרוטיטר שחורה, 384 בארות, בנפח נמוך [לוחית בדיקה] והדבק את התווית ישירות לצד הצלחת היכן שסורק הברקוד יכול לקרוא אותה; ודא שהתווית אינה משתרעת על צד הצלחת, אחרת היא עלולה להפריע לטיפול בצלחת ולערימתה. עורמים את הלוחות בסדר מספרי ומניחים בצד. מכסים את הצלחת העליונה. שימו לב ששלב זה הוא אופציונלי, אך מקל על מעקב אחר התוצאות לתרכובות המתאימות כאשר משתמשים במספר לוחות.
  6. צנטריפוגה את צלחות תרכובת המלאי המופשרות והאטומות ב-200 x g למשך 30 שניות ב-RT. הסר בזהירות את אטם הצלחת, הקפד להסיר את כל הדבק שנותר וכסה את הצלחת במכסה פלסטיק נקי למניעת אידוי. שימו לב שאם קיים דבק כלשהו על משטח הצלחת, הוא עלול להפריע להעברת מכסה אוטומטית ולערימת צלחות. הנח את הצלחת המכוסה במלון המחובר למטפל בנוזלים. אל תשמור את הצלחות חשופות או שיתרחש אידוי.
  7. הגדר קורא לוחות מיקרוטיטר פלואורסצנטי מוערם כדי לקרוא את הקרינה של כל לוחית בדיקה באורכי גל עירור ופליטה של 490 ננומטר ו-523 ננומטר, בהתאמה, כל 30 דקות (מצב קינטי) למשך 3-6 מחזורים ב-RT.

6. הכנת כלי סיכה

  1. בדוק ויזואלית את כלי הפינים בעל 384 הראשים לאיתור חריגות, כולל עיוות, התפצלות או פסולת גדולה.
  2. מלאו שלושה מגשים נפרדים בכ-1 אינץ' של 100% מתנול (דרגת HPLC), 100% איזופרופנול (דרגת HPLC) ותמיסת ניקוי כלי סיכה מדוללת במים טהורים במיוחד.
  3. מלאו את עמדת הניקוי על מטפל בנוזלים עם 100% DMSO.
  4. ערמו 2-3 חתיכות של נייר סופג נקי וחדש במגש. חשוב לכייל את הרובוט בציר ה-z כך שהפינים יבואו במגע עם נייר הספיגה אך לא ינקבו.
  5. אבטח חיבור מאוורר לאזור העבודה לייבוש הסיכות לאחר הכביסה.
  6. חבר את כלי הסיכה לזרוע הרובוטית של המטפל בנוזלים ונקה מראש את הסיכות על ידי טבילה ב-DMSO, ייבוש על נייר סופג, השרייה למשך 2 דקות בתמיסת ניקוי, ייבוש על נייר סופג, טבילה באיזופרופנול, ייבוש על נייר סופג, טבילה במתנול, ייבוש על נייר סופג, ולבסוף ייבוש מעל המאוורר.

7. הכנת מתקן נוזלים בנפח נמוך

  1. חבר קלטת בנפח נמוך (1-10 מיקרוליטר) למתקן הנוזלים, וחבר קו פסולת לכלי מתאים.
  2. בדוק ויזואלית את חרירי החלוקה של הקסטה ובדוק שהם אינם מעוותים, קרועים או חסומים. חשוב לשמור על ניקיון התעלות והחרירים מכיוון שמשקעים או פסולת ישפיעו על חלוקת הנוזלים.
  3. הפעילו את התעלות על ידי הזרמת 30 מ"ל מים טהורים במיוחד, 30 מ"ל של 70% אתנול, ואז 30 מ"ל מים טהורים במיוחד ישירות לתוך כלי הפסולת.
  4. מקם צלחת בדיקה בנפח נמוך של 384 בארות לתוך מתקן הנוזלים והוסף נפח ידוע של מים לכל באר. בדוק ויזואלית כדי לוודא שכל באר מקבלת את הנפח הנכון ואין שפיכה או תמיסה בין הבארות.
  5. יש להניח את הצינורות באוויר למשך כ-5 שניות כדי להסיר את המים ולייבש את התעלות.

8. חלוקת BoNT/A שרשרת קלה לתוך לוחית הבדיקה

  1. טבלו את קו צריכת מתקן הנוזלים לתוך תמיסת העבודה BoNT/A LC, הקימו כדי להסיר כל אוויר, והוציאו 8 מיקרוליטר לכל באר של צלחת בדיקה בנפח נמוך של 384 בארות. שימו לב שניתן למקם את הלוחות באופן ידני על אזור העבודה של המטפל בנוזלים, או למקם ולערום מחדש באופן אוטומטי באמצעות מלון צלחות מחובר.
  2. מכסים כל צלחת במכסה פלסטיק נקי ועורמים בעמודה אחרת של מלון הצלחות המחובר למטפל בנוזלים. אין לשמור את הצלחות לא אטומות אחרת יתרחש אידוי.
  3. נקו את מתקן הנוזלים על ידי הזרמת 30 מ"ל מים טהורים במיוחד, 30 מ"ל אתנול 70%, 30 מ"ל מים טהורים במיוחד ישירות לתוך כלי הפסולת.
  4. יש להניח את הצינורות באוויר למשך כ-5 שניות לייבוש התעלות.

9. הטבעה של תרכובות בצלחת בדיקה

  1. הקצה אזורים על פלטפורמת המטפל בנוזלים עבור לוחות התרכובת, לוחות הבדיקה והמיכלים עם פתרונות ניקוי.
  2. תכנת את המטפל בנוזלים למקם את לוחות התרכובת ואת לוחות הבדיקה במיקומים המיועדים ולהסיר את מכסי הצלחות לפני ההחתמה.
  3. החתמה של 50 nl של התרכובת ישירות לתוך לוחית הבדיקה המכילה 8 מיקרוליטר של BoNT/A LC. בעת כיול תוכנית ההטבעה, ודא שהפינים שקועים, אך אל תגרדו את החלק התחתון של לוחית הבדיקה. שימו לב שתוספת של תרכובות ב-100% DMSO עשויה ליצור אזור מקומי של דנטורציה של אנזימים בזמן שהוא מתפזר. לכן יש להקפיד להעריך את רמת דנטורציה של האנזים על ידי השוואת בקרת ה-DMSO בלבד לבקרה הלא מטופלת (כלומר אנזים ללא תוספת DMSO).
  4. נקו את הסיכות לאחר כל צלחת על ידי טבילה ב-DMSO, ייבוש על נייר סופג, טבילה באיזופרופנול, ייבוש על נייר סופג, טבילה במתנול, ייבוש על נייר סופג ולבסוף ייבוש מעל המאוורר.
  5. לאחר הטבעת התרכובות בצלחת הבדיקה באנזים, ערמו בנפרד את לוחות תרכובות המלאי ואת לוחות הבדיקה. מכסים את לוחית הבדיקה העליונה בערימה כדי למנוע אידוי ומניחים בצד. הקפד לדגור LC עם תרכובות למשך 5 דקות לפחות ב-RT; ניתן להשתמש בזמני דגירה ארוכים יותר בעת החתמת מספר רב של צלחות.

10. חלוקת מצע לתוך לוחית הבדיקה

  1. טבלו את קו היניקה של המטפל בנוזלים לתוך תמיסת העבודה של מצע BoNT/A LC והגנו מפני אור. בדוק את חרירי החלוקה כדי לוודא שהם יבשים ואינם חסומים. יש להפעיל את הערוצים כדי להסיר את כל בועות האוויר.
  2. פרקו את לוחות הבדיקה והוציאו 2 מיקרוליטר של דילול עבודה של המצע לכל באר. בדוק שהמצע מוזרם ישירות לכל באר. ערמו את הצלחות והניחו לוחית בדיקה ריקה אחת על גבי הצלחת הראשונה וצלחת ריקה אחת מתחת לצלחת התחתונה בערימה כדי למנוע אידוי במהלך הקריאה והערימה מחדש בקורא הצלחות.

11. מדידות פלואורסצנטיות

  1. טען מיד את ערימת לוחות הבדיקה לקורא לוחות פלואורסצנטי.
  2. התחל את מדידת הקרינה עם ההגדרות שצוינו קודם לכן בשלב 5.7. קצב הבדיקה עבור כל תרכובת מחושב מגרף של יחידת הקרינה היחסית (RFU) לאורך זמן. שימו לב שחשוב לכלול בקרה שלילית (DMSO) כדי להשיג שיעור ללא עכבות; ניתן להוסיף גם בקרה חיובית עם מעכב ידוע לכל צלחת. פלט מייצג מנקודת זמן אחת מוצג באיור 2.

12. ניקוי

  1. אוטמים כל צלחת ציר מורכבת עם אטם נייר כסף בעזרת רולר, ושומרים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  2. לאחר קריאת כל לוחית בדיקה, השליכו את הלוחות, כל דילול LC/A או מצע שנותרו בפסולת הביולוגית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקת BoNT/A LC מבוססת FRET יכולה להתבצע באופן ידני באופן תפוקה נמוכה כדי לאפיין מעכבים ידועים או לסנן ספריות קטנות; לחלופין, ניתן להקטין את הפרוטוקול ולהפוך אותו לאוטומטי עבור סינון תפוקה גבוהה (HTS) עם ספריות גדולות במטרה לזהות מעכבי BoNT/A LC חדשים. ללא קשר לגישה שננקטה, יש להבחין בעלייה בקרינה לאורך זמן כאשר BoNT/A LC מודגר עם המצע (איור 1A מציג תרשים מייצג של הקרינה לאורך זמן). אם נבדקים דילולים סדרתיים של תרכובת, אז לעתים קרובות מתקבלת סדרה של קווים עם שיפועים משתנים (איור 1B). באר...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקת BoNT/A LC מבוססת FRET המתוארת כאן מייצגת שיטה אטרקטיבית לזיהוי ואפיון מולקולות קטנות המווסתות את פעילות BoNT/A LC. האופי מבוסס הפתרון של הבדיקה הופך פרוטוקול זה למתאים לסריקת תפוקה גבוהה המתוארת בסעיף הפעולה האוטומטית של טקסט הפרוטוקול. גורם ה-Z משמש לעתים קרובות לקביעת ההתאמה של מבחן לקמפיינים של HTS18. נקבע כ-Z = 1 - 3 (σp + σn)/(μp - μn), גורם Z של 1 הוא אידיאלי, בין 0.5-1 הוא מצוין ופחות מ-0.5 הוא שולי. גורם ה-Z של פרוטוקול HTS כמתואר כאן הוא 0.89 (סטיית הת...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכונים הלאומיים לבריאות (AI082190 ל-T.J.D) והמכון לרפואה רגנרטיבית בקליפורניה (TB1-01186 ו-CL1-00502).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HEPESTeknovaH1021
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
מתנול (בדרגת HPLC)Sigma-Aldrich34860
איזופרופנול (בדרגת HPLC)Sigma-Aldrich650447
96 בארות צלחת בדיקה שחורהCostar3915
384 בארות צלחת בדיקה שחורה בנפח נמוךגריינר788076
רשימת מצעי SNAPtide FITC/Dabcylמעבדות ביולוגיות521מצע BoNT/A LC מבוססת FRET
V& P ScientificVP 110
נייר ספיגה נטול מוךV& P ScientificVP 540DB
חותם Biomek ומכסי רדיד אלומיניום לדוגמאבקמן קולטר538619
תמיסת ניקוי סיכות

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schantz, E. J., Johnson, E. A. Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine. Microbiol. Rev. 56, 80-99 (1992).
  2. Sloop, R. R., Cole, B. A., Escutin, R. O. Human response to botulinum toxin injection: type B compared with type A. Neurology. 49, 189-194 (1997).
  3. Willis, B., Eubanks, L. M., Dickerson, T. J., Janda, K. D. The strange case of the botulinum neurotoxin: using chemistry and biology to modulate the most deadly poison. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47, 8360-8379 (2008).
  4. Tacket, C. O., Shandera, W. X., Mann, J. M., Hargrett, N. T., Blake, P. A. Equine antitoxin use and other factors that predict outcome in type A foodborne botulism. Am. J. Med. 76, 794-798 (1984).
  5. Capek, P., et al. Enhancing the Pharmacokinetic Properties of Botulinum Neurotoxin Serotype A Protease Inhibitors Through Rational Design. ACS Chem. Neurosci. 2, 288-293 (2011).
  6. Schmidt, J. J., Bostian, K. A. Proteolysis of synthetic peptides by type A botulinum neurotoxin. J. Protein Chem. 14, 703-708 (1995).
  7. Schmidt, J. J., Bostian, K. A. Endoproteinase activity of type A botulinum neurotoxin: substrate requirements and activation by serum albumin. J. Protein Chem. 16, 19-26 (1997).
  8. Schmidt, J. J., Stafford, R. G., Bostian, K. A. Type A botulinum neurotoxin proteolytic activity: development of competitive inhibitors and implications for substrate specificity at the S1' binding subsite. FEBS Lett. 435, 61-64 (1998).
  9. Schmidt, J. J., Stafford, R. G., Millard, C. B. High-throughput assays for botulinum neurotoxin proteolytic activity: serotypes A, B, D, and F. Anal. Biochem.. 296, 130-137 (2001).
  10. Schmidt, J. J., Stafford, R. G. Fluorigenic substrates for the protease activities of botulinum neurotoxins serotypes A, B, and F. Appl. Environ. Microbiol. 69, 297-303 (2003).
  11. Pellett, S. Progress in cell based assays for botulinum neurotoxin detection. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 364, 257-285 (2013).
  12. Boldt, G. E., et al. Synthesis, characterization and development of a high-throughput methodology for the discovery of botulinum neurotoxin a inhibitors. J. Comb. Chem. 8, 513-521 (2006).
  13. Henkel, J. S., et al. Catalytic properties of botulinum neurotoxin subtypes A3 and A4. Biochemistry. 48, 2522-2528 (2009).
  14. Joshi, S. G. Detection of biologically active botulinum neurotoxin--A in serum using high-throughput FRET-assay. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 65, 8-12 (2012).
  15. Smith, G. R., et al. Reexamining hydroxamate inhibitors of botulinum neurotoxin serotype A: extending towards the beta-exosite. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 3754-3757 (2012).
  16. Eubanks, L. M., et al. An in vitro and in vivo disconnect uncovered through high-throughput identification of botulinum neurotoxin A antagonists. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 2602-2607 (2007).
  17. Baldwin, M. R., Bradshaw, M., Johnson, E. A., Barbieri, J. T. The C-terminus of botulinum neurotoxin type A light chain contributes to solubility, catalysis, and stability. Protein Expr. Purif. 37, 187-195 (2004).
  18. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  19. Capkova, K., Hixon, M. S., McAllister, L. A., Janda, K. D. Toward the discovery of potent inhibitors of botulinum neurotoxin A: development of a robust LC MS based assay operational from low to subnanomolar enzyme concentrations. Chem. Commun. , 3525-3527 (2008).
  20. Pires-Alves, M., Ho, M., Aberle, K. K., Janda, K. D., Wilson, B. A. Tandem fluorescent proteins as enhanced FRET-based substrates for botulinum neurotoxin activity. Toxicon. 53, 392-399 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Botulinum Neurotoxin Light ChainFRET based AssayHigh throughput ScreeningCompound Dilution SeriesFluorescence Plate ReaderEnzyme Inhibition KineticsIC50 DeterminationAutomated Liquid HandlingSubstrate Hydrolysis MeasurementInhibitor Potency Comparison

Related Articles