הערכה כמותית של אדם נויטרופילים הגירה מעבר מתורבת שלפוחית ​​השתן האפיתל

סיכום

פיתחנו מודל במבחנה המחקה מרכיב חשוב בתגובה הדלקתית החריף במהלך הזיהום של שלפוחית ​​השתן עם חיידקי Escherichia uropathogenic. Assay הגירת נויטרופילים transuroepithelial מאפשר הערכה כמותית של הגירת נויטרופילים אנושיים על פני epithelia שלפוחית ​​השתן, בתרבית על תומך חדיר, בתגובה לזיהום חיידקים או חומרי chemoattractant.

תקציר

הגיוס של תאי מערכת החיסון מהפריפריה לאתר של דלקת הוא צעד חיוני בתגובה החיסונית המולדת בכל משטח הרירי. במהלך הזיהום של שלפוחית ​​השתן, כדוריות דם לבנות polymorphonuclear (PMN; נויטרופילים) נודדים ממחזור הדם ולעבור את אפיתל שלפוחית ​​השתן. כישלון לפתור את הזיהום בהעדר תגובת neutrophilic מדגים את החשיבות של PMN בהגנה על שלפוחית ​​השתן. כדי להקל על קולוניזציה של אפיתל שלפוחית ​​השתן, Escherichia coli uropathogenic (UPEC), הסוכן סיבתי של רוב הדלקות בדרכי שתן (זיהומים בדרכי השתן), לדכא את התגובה הדלקתית חריפה באמצעות מגוון של מנגנונים שהוגדרו באופן חלקי. כדי לחקור את יחסי הגומלין בין המארח ופתוגן חיידקים נוסף, פיתחנו מודל במבחנה של היבט זה של התגובה החיסונית המולדת לUPEC. ב assay הגירת נויטרופילים transuroepithelial, וריאציה על חדר בוידן, epith שלפוחית ​​השתן בתרביתתאי elial גדלים למפגש בחלק התחתון של תמיכה חדירה. PMN מבודדים מהדם ורידי אדם ומוחל על צד basolateral של שכבות תאי אפיתל שלפוחית ​​השתן. הגירת PMN המייצגת את כיוון basolateral לפסגה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית בתגובה לזיהום חיידקים או מולקולות chemoattractant נפקדת באמצעות hemocytometer. מודל זה יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות בין UPEC ותאי אוקריוטים כמו גם לחקור את הדרישות מולקולריות לחציית האפיתלים שלפוחית ​​השתן על ידי PMN. מודל נדידת נויטרופילים transuroepithelial יהיה לקדם את ההבנה של התגובה הדלקתית הראשונית לUPEC בשלפוחית ​​השתן שלנו.

מבוא

התנועה של תאים בכל הגוף, לעתים קרובות על פני מרחקים ארוכים, נדרשת לצמיחה והתפתחות, ריפוי פצעים, ותגובה חיסונית. נדידת תאים היא מורכבת ודורשת התיאום של תהליכים רבים ושונים, כוללים מפלי איתות והסידור מחדש של רכיבי cytoskeletal. תאים יכולים לנוע באופן אקראי (chemokinesis), כמו גם לכיוון הדרגתיים מוגדר כימי (chemotaxis). טכניקות רבות פותחו ללמוד נדידת תאים במבחנה. הטכניקה העתיקה ביותר והנפוצה ביותר, קאמרי בוידן, מורכב ממערכת שתי קאמרית אנכית שבו חומר chemoattractant ממוקם בתא והתאים של עניין התחתון ממוקמות בתא העליון ^1. התנועה של תאים על פני המסנן החדיר, עם נקבוביות בגודל מוגדר, בין שני התאים היא תחת פיקוח. טכניקות נוספות פותחו כדי לחקור את נדידת תאים, כוללים תא זיגמונד ² וקאמרי דאן^3. גישות קולקטיביות אלו הניבו תובנה משמעותית לתנועה של תאים מסוגים רבים ושונים.

בנוסף לחקירה את העקרונות הבסיסיים של chemokinesis וchemotaxis, מבחני שני קאמריים הקלו החקירה של נדידת תאים באמצעות רכיבי מטריצה ​​תאיים ושני שכבות תאי אנדותל ואפיתל. יתרון של מערכות שתי קאמריות על פני שיטות אחרות הוא שהקרום הנקבובי יכול להיות מצופה עם חלבונים כגון קולגן או פיברינוגן, ונדידת תאים על פני מחסום כמו מטריקס-תאי ניתן להעריך. בנוסף, ניתן לגדל שורות תאים בתרבית ומובחנות על תומך החדיר. כדי לחקור את התנועה של תאים על פני מכשול אנדותל, תאי אנדותל בתרבית הם זורעים וגדלו במאגר העליון של תומך החדיר. תאי ניעתי, כגון תאים חיסוניים, מתווספים למאגר וההגירה העליונים למאגר התחתון ברחבי enמחסום dothelial בכיוון הקודקוד לbasolateral הפיזיולוגי הוא ציין. מודל זה כבר לא יסולא בפז בהבנת extravasation של תאים חיסוניים מחוץ לזרם הדם. בניגוד לtransendothelial הגירה, התנועה של תאים על פני מחסום האפיתל מתרחשת בדרך כלל בכיוון basolateral לפסגה. על מנת לבנות מודל אירועים אלה במבחנה, חוקרי הזרעים ולגדל תאי אפיתל בתרבית בחלק התחתון של תומך החדיר. תאי ניעתי מתווספים למאגר העליון וההגירה על פני מחסום אפיתל, המייצג את כיוון basolateral לפסגה, הוא תחת פיקוח. מודלים כאלה של הגירת transepithelial תרמו באופן משמעותי להבנה של תגובות דלקתיות במשטחים הריריים, במיוחד אלו של הריאות ובטן ^4,5 שלנו.

בניגוד לכך, סחר בתא חיסון דרך האפיתל של דרכי השתן זכה להרבה פחות תשומת לב. כדי לקדם את understanding של תגובות חיסוניים מולדים בדרכי השתן במהלך זיהום בחיידקי Escherichia uropathogenic (UPEC), פיתחנו assay במבחנה, assay הגירת נויטרופילים transuroepithelial, המאפשר חקירה של ויקוציטים polymorphonuclear (PMN; נויטרופילים) תנועה על פני מחסום האפיתל בשלפוחית ​​השתן ^{6 -8.} כמו בדגמים שני קאמריים אחרים של הגירת transepithelial, תאי שלפוחית ​​השתן אנושיים בתרבית האפיתל גדלים על החלק התחתון של תמיכה חדירה ויוצרים שכבות אפיתל ומחוברות. נויטרופילים אנושיים, מבודדים מהדם ורידים, מוחלים על צד basolateral של שכבת האפיתל, והגירה על פני האפיתל בכיוון basolateral לפסגה הרלוונטי מבחינה פיזיולוגית היא לכמת בתגובה לזיהום עם זנים שונים של א coli או הנוכחות של מולקולות chemoattractant. מחקרים רבים שהתמקדו בתנועת נויטרופילים, שניהם chemokinesis וchemotaxis, בהעדר סוגים נוספים של תאים. Assay הגירת נויטרופילים transuroepithelial הוא יתרון כפי שהוא לוקח בחשבון את יחסי גומלין מורכבים בין תאי אפיתל שלפוחית ​​השתן ותאי מערכת החיסון בזיהום. יש מודל צייתן זה במבחנה את הפוטנציאל כדי לאפשר את החקירה מפורטת של תגובות חיסוניים במשטחי uroepithelial.

פרוטוקול

1. Culturing 5637 תאי אפיתל שלפוחית ​​השתן

בצע את השלבים הבאים במכסת מנוע רקמות תרבות זרימה למינרית מוכנה עם קרינת UV וניגב את עם 70% אתנול.

1. הכן את המדיום RPMI-1640 מכיל 10% בסרום שור העובר (FBS) [+ RPMI כינה], מסנן לעקר באמצעות מסנן 0.22 גודל נקבובית מיקרומטר, וחם ל37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
2. להפשיר cryovial של 5637 תאים (אמריקאי סוג תרבות אוסף HTB-9; נגזר מקרצינומה של שלפוחית ​​השתן) באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. במהירות להעביר את התאים מופשרים בבקבוק תרבית רקמה 75 ² סנטימטר המכיל 20 מיליליטר RPMI +.
3. דגירה את הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified עם 5% CO ₂ עד לתאים ומחוברות כ 95% (~ 6 x 10 ⁶ תאים לכל בקבוק), כ -4 ימים.
4. לתת 5637 תאים:
   1. הוצא את המדיה מהבקבוק. לשטוף את התאים עם פוספט שנאגר סאלין של 10 מיליליטר Dulbeccoדואר (DPBS) בטמפרטורת חדר.
   2. הוסף 6 מיליליטר טריפסין החם (37 מעלות צלזיוס) 0.05%, 0.02% פתרון EDTA לבקבוק, ולדגור על 37 ° C עם 5% CO ₂ למשך 15 דקות.
   3. להעביר את תאי צינור 15 מיליליטר חרוטי, וגלולה ידי צנטריפוגה ב XG 300 למשך 5 דקות. הסר את פתרון טריפסין / EDTA.
   4. Resuspend תאי 6 מיליליטר + (10 ⁶ תאים / מיליליטר), ומיליליטר RPMI העברה 1 (10 ⁶ תאים) ל75 סנטימטר ² בקבוק חדש המכיל 20 מיליליטר RPMI +.
5. חזור על שלב 1.4 לתת תאים כל 4 ימים או כאשר התאים מגיעים למפגש 95%.

2. זריעה וגידול 5637 על תאים בתומכים חדיר

בצע את השלבים הבאים במכסת מנוע בתרבית רקמה באמצעות טכניקת aseptic. לקבלת תוצאות אופטימליות, השתמש 5637 תאים שעברו פחות מ 10 תת תרבות.

1. בעזרת מלקחיים סטריליות, להפוך את תומך החדיר בצלחת תרבות רקמות עמוקה 25 מ"מ סטרילי.
2. Trypsinize בקבוק 75 ² סנטימטר של 5637 תאים במפגש 95% על פי צעדים 1.4.1-1.4.3.
3. בעזרת פיפטה 1,000 μl, בעדינות resuspend התאים ~ 2 מיליליטר RPMI + לריכוז של 3 x 10 ⁶ מיליליטר תאים /, נקבע על ידי תא לספור באמצעות hemocytometer.
4. החל 50 μl של ההשעיה התא (1.5 x 10 ⁵ תאים) לכל תמיכה חדירה בלי לגעת בקרום. מניחים את המכסה על הצלחת, ומניח בזהירות את הצלחת על 37 ° C עם 5% CO _{2 למשך} לא יותר מ 16 שעות.
5. בעזרת מלקחיים סטריליות, נכון תומך החדיר לתוך צלחת 24 גם מכילה 0.6 מיליליטר + RPMI לכל טוב. הוסף 0.1 מיליליטר RPMI + למאגר העליון של כל תמיכה חדירה. לדגור על 37 ° C עם 5% CO _2.
6. החלף את המדיום כל 2 ימים. ראשית, בינוני לשאוב מהמאגר העליון ואחריו המאגר התחתון, ולאחר מכן להחיל טרי RPMI + בבסדר ההפוך, למאגר התחתון (0.6 מיליליטר) ולאחר מכן העליון reservoir (0.1 מיליליטר).
7. שבעה ימים לאחר זריעה תומכת החדיר עם 5637 תאים, להעריך את המפגש של התאים. למלא את המאגר העליון עם RPMI + (~ 0.35 מיליליטר). התאים במידה מספקת הם מחוברות כאשר המדיום אינו לאזן בין המאגרים העליונים ותחתונים.

3. הכנת הבידוד בקטריאלי

1. באמצעות טכניקת aseptic, להוסיף 20 מיליליטר של מרק התרבות המתאים לבקבוק 250 מיליליטר עם מכסה. השתמש במרק לוריא-Bertani (LB) לE. תרבויות coli, ולהוסיף אנטיביוטיקה למרק שבו מתאים.
2. שימוש בחיסון לולאת סטרילי, לחסן את המרק עם חיידקים ממניות גליצרול או צלחת פס. לזני UPEC, דגירה תרבות החיידקים ב37 מעלות צלזיוס למשך כ 16 שעות, בלי ללחוץ (כדי לקדם את הייצור של פילים מסוג 1).
3. העבר את תרבות החיידקים לצינור צנטריפוגות. גלולה החיידקים על ידי צנטריפוגה ב8,000 XG 10 דקות.
4. למזוג supernatant, ו resuspend החיידקים בPBS לOD ₆₀₀ = 1.000, שווה ערך ל ~ 10 ⁹ CFU / מיליליטר.
   1. כדי ליצור גירוי חיידקים-נהרג חום, דגירה aliquot (למשל ~ 1.5 x 10 ⁸ CFU ב150 μl) של חיידקי resuspended ב55 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. פלייט aliquot של ההשעיה נהרג חום כדי לאשר מות חיידקים.
5. מייד לפני השימוש, לדלל את חיידקי resuspended (לחיות או נהרג חום) של פי 10 ל10 ⁸ CFU / מיליליטר בRPMI סרום ללא חם [RPMI-כינה] בצינור microfuge.

4. בידוד של נויטרופילים אנושיים מהדם היקפי

האוסף של דם ממתנדבים מבוגרים דורש ביקורת מראש ואישור מועדת בדיקה מוסדית. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים ולהשליך כיאות חומרים מסוכנים, כדי למנוע חשיפה לדם אנושי.

1. כ 25 מיליליטר של דם ורידים מv הבוגר ובריאolunteer צריך להיגרר ל3 צינורות איסוף דם סטרילית נתרן המכיל הפרין על ידי צוות המיומן בphlebotomy.
   1. חוזקה עוטף את צינורית גומי סביב הזרוע העליונה, מעל המרפק.
   2. לחטא את אתר הכניסה, פוסה antecubital, תוך שימוש באלכוהול 70% סטרילי לנגב.
   3. צרף בעל צינור פלסטיק למערכת מחט פרפר מכונפת.
   4. הכנס את המחט לתוך וריד antecubital בזווית 30 מעלות או פחות, שיפוע כלפי מעלה. המחט ניקבה את וריד כשפרץ של דם מופיע בצינורות הפלסטיק.
   5. הכנס צינור איסוף דם לתוך מחזיק צינור פלסטיק. כאשר צינור האיסוף הראשון הוא מלא, להחליף עם צינור האיסוף השני. חזור עם הצינור השלישי.
   6. כאשר צינור האיסוף השלישי הוא כמחצית מלא, להסיר את חוסם עורקים.
   7. כסה את האתר לנקב עם כדור צמר גפן סטרילי ולסגת באיטיות את המחט מהווריד. הסט את מגן עליי המחט והמקוםBiohazard na חד מיכל.
   8. תפעיל לחץ על האתר לנקב. כסה את כדור האתר לנקב וכותנה עם תחבושת דביקה.
   9. בעדינות להפוך את צינורות איסוף דם כדי לפזר את הפרין.

בצע את השלבים הבאים במכסת מנוע בתרבית רקמה באמצעות טכניקת aseptic.

2. בעזרת פיפטה 10 מיליליטר, בעדינות להעביר את הדם לצינור חרוטי טרי, מיליליטר 50 סטרילי. הוסף נפח שווה ערך של 3% (w / v) dextran ב0.9% NaCl ומערבבים על ידי היפוך. דגירה הצינור זקוף בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות.
3. מבלי לשבש את השכבה התחתונה, לשאוב בזהירות את השכבה העליונה ולהעביר אותו לצינור חרוטי 50 מיליליטר חדש. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה XG 300 10 דקות. בטל supernatant.
4. Resuspend התא גלולה בנפח של .0.9% NaCl שווה להתחלת נפח דם.
5. שכבת 10 מיליליטר של תמיסת צנטריפוגה צפיפות תחת ההשעיה תא, עמ 'שומר את הממשק בין שני השלבים. צנטריפוגה ב XG 400 ל30 דקות עם בלם לא. בטל supernatant.
6. לlyse תאי דם אדומים שנותרו, resuspend התא גלולה ב 10 מיליליטר 0.2% קרים NaCl. דגירה במשך 30 שניות, ולאחר מכן מייד להוסיף 10 מיליליטר 1.6% קרים NaCl לשחזר isotonicity.
7. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה XG 300 6 דקות. בטל supernatant.
8. חזור על שלבים 4.6-4.7 עד התא גלולה מופיע להיות חופשי של תאי דם אדומים, בדרך כלל 3 סיבובים של תמוגה.
9. בעזרת פיפטה 1,000 μl, resuspend התא גלולה, בעיקר PMN, בחם (37 מעלות צלזיוס) RPMI לריכוז של 10 ⁷ תאים / מיליליטר, שנקבע על ידי תא לספור באמצעות hemocytometer. שמור את התאים על 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש. בדרך כלל, כדאיות PMN וטהרה הן> 99% כפי שהוערך על ידי הרחקת trypan הכחולה ויזואליזציה של מורפולוגיה גרעינית לאחר הצביעה, בהתאמה.

5. Transuroepithelial נויטרופילים הגירה כפילומר

בצע את השלבים הבאים במכסת מנוע בתרבית רקמה באמצעות טכניקת aseptic. השתמש אך ורק תומך חדיר נושאות שכבות תאים ומחוברות 5637, כפי שנקבע בשלב 2.7. יכולות-RPMI להיות מוכנה 24 גם צלחות המכילות מראש ושמרו על 37 ° C עם 5% CO ₂ עד לשימוש.

1. Aliquot 1 מ"ל לחמם RPMI לכל גם בצלחת 24 גם; להכין 3 בארות לתמיכה חדירה.
2. לשאוב את המדיום מהמאגרים העליונים ותחתונים של תומך החדיר.
3. בעזרת מלקחיים סטריליות, להעביר את תומך החדיר לצלחת 24 גם מוכנה בשלב 5.1. שטוף את תומך החדיר שלוש פעמים על ידי העברת התמיכות מהיטב היטב.
4. אם הבידוד חיידקים הוא לשמש, להפוך תומכת החדיר בצלחת תרבות רקמות עמוקה 25 מ"מ סטרילי. אם chemoattractant (למשל, N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) או IL-8) הוא לשמש, המשך לשלב 5.6.
5. לניסויים עם bact חי או נהרגגירויי erial, לחסן צד הפסגה של כל תמיכה חדירה עם 60 μl RPMI-(דלקת מדומה) או עם הבידוד החיידקים (6 x 10 ⁶ CFU) מוכן בשלב 3.5. מניחים את המכסה על הצלחת ולדגור על 37 ° C עם 5% CO ₂ למשך שעה 1.
6. הוספת 0.6 מיליליטר RPMI לכל גם ל24 גם צלחת נמוכה מצורף; להכין 1 גם לתמיכה חדירה. הכן 3 בארות המכילות 0.5 מיליליטר RPMI-למנות קלט PMN.
   1. אם chemoattractant נמצאת בשימוש במקום של חיידקים, להוסיף chemoattractant ל0.6 מיליליטר RPMI-בצלחת 24 גם מוכנה בשלב 5.6.
7. העכבר תומך החדיר לתוך הצלחת נמוכה המצורף 24 גם.
8. הוסף 0.1 מיליליטר PMN (10 ⁶ PMN), מוכן בשלב 4.9, למאגר העליון (צד basolateral) של כל תמיכה חדירה. הוספת 100 PMN μl ישירות לבארות המכילות 500 μl RPMI. לדגור על 37 ° C עם 5% CO ₂ למשך שעה 1.
9. בעזרת מלקחיים סטריליות, בעדינות לגרדהממברנה של התמיכה חדירה כנגד קצה היטב כדי להסיר PMN נוסף מהצד הפסגה ולאחר מכן להשליך את התמיכה.
10. לאסוף PMN ידי בעדינות מגרד את תחתית היטב כל אחד עם קצה פיפטה 1,000 μl, ולהעביר את מתלי PMN לmicrofuge צינורות.
11. ספירת PMN באמצעות hemocytometer.
12. כדי לחשב את המספר הכולל של PMN במאגר התחתון, הכפל את מספר PMN ב1 מ"מ ² (100 NL) על ידי 6,000. ניתן לדווח על הנתונים כאחוז מPMN הקלט, או כמספרי PMN מנורמלים 10 ⁶ PMN קלט.

תוצאות

Assay הגירת נויטרופילים transuroepithelial מאפשר הערכה כמותית של הגירת PMN האנושי על פני שכבות תאי אפיתל שלפוחית ​​השתן בתרבית בתגובה לגירויים שונים (איור 1). בעוד הפרוטוקול הוא פשוט, יש מספר משתנה שיכול להשפיע על הגירת PMN וכתוצאה מכך משפיעה על שחזור של assay זה. יש לנקוט אמצעים בעת ההכנה תומכת החדיר וPMN להפחית שונות בין משכפל הטכני וביולוגי. לדוגמא, יש להשתמש רק תומך חדיר המכילים שכבות תאים מספיק מחוברות 5637 בניסוי. מפגש של 5637 התאים נבחנים באמצעות assay פונק...

דיון

באמצעות קו תרבותי אפיתל שלפוחית ​​תא וPMN אדם המבודד טרי, הקמנו מודל במבחנה של הגירת נויטרופילים transuroepithelial. מודל זה כבר סייע במתחיל לנתח את המורכבות של התגובה החיסונית המולדת בדלקת בדרכי שתן (UTI), זיהום חיידקים נפוץ מאוד שנגרם בדרך כלל על ידי ⁹ UPEC. במהלך הזיהום של שלפוחית ​​השתן, או דלקת בשלפוחית ​​השתן, גיוס של PMN ללומן שלפוחית ​​השתן הוא חיוני לסילוק חיידקים ^10. כדי לבסס דריסת רגל בפרצוף של תגובה דלקתית, UPEC לעכב את הגעתו של PMN לשלפו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תוספות Transwell (כלומר  תומכים חדירים )	קורנינג	3472	6.5 מ"מ, 3 μ m נקבוביות, פוליאסטר ממברנה להכניס
BD Vacutainer צינורות איסוף דם	Becton, Dickinson and Company (BD)	366480	16 מ"מ x 100 מ"מ x 10 מ"ל צינורות כובע ירוק המכילים נתרן הפרין
BD Safety-Lok איסוף ועירוי דם	סט Becton, Dickinson and Company (BD)	367281	21 גרם x 0.75 במחט x 12 בצינורות
BD Vacutainer לשימוש חד פעמי, מחזיק שאינו ניתן לערום	Becton, Dickinson and Company (BD)	364815
Dextran	Sigma-Aldrich	D4876	מ-Leuconostoc mesenteroides
Ficoll-Paque PLUS פתרון צנטריפוגה בצפיפות	GE Healthcare	17-1440-02
לוחות חיבור נמוכים במיוחד	Corning	3473	24-well, תחתית שטוחה
שקופהN-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)	Sigma-Aldrich	F3506	שוחזר ב-DMSO ל-10 מ"מ
רקומביננטי אנושי CXCL8/IL-8	R& D Systems	208-IL	שוחזר ב-PBS ל-100 μ גרם/מ"ל