מאמר שיטה

ניתוח כמותי ואפיון של נגעים טרשת עורקים בסינוס אבי העורקים של העכברים

DOI:

10.3791/50933

⸱

7 בדצמבר 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University, 2Thrombosis and Atherosclerosis Research Institute, McMaster University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים הליכים לכימות ואפיון נגעים טרשת עורקים במודלים של עכברים באמצעות חתך מדויק של סינוס אבי העורקים ואבי העורקים העולה בשילוב עם ניתוח היסטוכימי ואימונוהיסטוכימי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טרשת עורקים היא מחלה של העורקים הגדולים וגורם בסיסי עיקרי לאוטם שריר הלב ושבץ מוחי. מספר מודלים שונים של עכברים פותחו כדי להקל על חקר הפתופיזיולוגיה המולקולרית והתאית של מחלה זו. בכתב יד זה אנו מתארים טכניקות ספציפיות לכימות ואפיון של נגעים טרשת עורקים בסינוס אבי העורקים של העכברים ובאבי העורקים העולה. היתרון של הליך זה הוא בכך שהוא מספק מדידה מדויקת של שטח החתך והנפח הכולל של הנגע, שניתן להשתמש בו כדי להשוות התקדמות טרשת עורקים בין קבוצות טיפול שונות. זה אפשרי באמצעות שימוש בעלוני השסתום כציון דרך אנטומי, יחד עם התאמה קפדנית של זווית החיתוך. אנו מתארים גם שיטות צביעה בסיסיות שניתן להשתמש בהן כדי להתחיל לאפיין התקדמות טרשת עורקים. ניתן לשנות אותם עוד יותר כדי לחקור אנטיגנים בעלי עניין ספציפי לחוקר. הטכניקות המתוארות ישימות בדרך כלל למגוון רחב של מודלים תזונתיים וגנטיים קיימים וחדשים של עורקים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשני העשורים האחרונים הפיתוח והשימוש במודלים של עכברים המועדים לטרשת עורקים באמצעות מניפולציה תזונתית ו/או גנטית הגדילו משמעותית את הבנתנו את המנגנונים המולקולריים והתאים המעורבים בהתפתחות נגעים טרשת עורקים1-3. חלק גדול מהידע וההבנה שלנו על אטרוגנזה מגיע ממחקרים שבוצעו באפוליפופרוטאין (Apo)-E חסר 4 עכברים, שבהם נגעים טרשת עורקים מתפתחים באופן ספונטני וחסר קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDLR)5 עכברים, בהם טרשת עורקים נגרמת על ידי תזונה. יתרון חשוב של מודלים אלה הוא שהם מאפשרים לחקור מספר גדול יחסית של בעלי חיים מוגדרים גנטית בתנאים תזונתיים וסביבתיים מבוקרים. בנוסף, נראה כי הנגעים הטרשת המתקדמים המתפתחים בחלק מזני העכברים הללו דומים מאוד לאלה שנצפו בבני אדם, המכילים ליבות נמקיות מלאות בשומנים וכובעים סיביים. טרשת עורקים מתפתחת במהירות במודלים אלה של עכברים, מה שהופך את זה לאפשרי מאוד לחקור את התפתחות הנגעים, מפס שומני ועד רובד מתקדם, תוך מספר שבועות. יתר על כן, גורמי סיכון ידועים למחלות לב וכלי דם בבני אדם, כולל סוכרת6, דיסליפידמיה7, השמנת יתר8, יתר לחץ דם9, עשן סיגריות10 וסביבה יושבנית11 הוכחו כמאיצים עוד יותר את התפתחות הנגעים.

ברוב דגמי העכברים המועדים לטרשת עורקים, אם לא בכולם, ניתן לזהות תחילה התפתחות נגעים בסינוס אבי העורקים. זמן ההופעה תלוי בזן העכבר ובתזונה. ככל שהנגעים גדלים הם נוטים לגדול במעלה אבי העורקים העולה. בעכברי ApoE-/- ו-LDLR-/-, ניתן לזהות התפתחות נגע לאחר מכן בהתפצלות אבי העורקים בקשת אבי העורקים, באבי העורקים היורד ובעורקים גדולים אחרים12-14. ד"ר בוורלי פייגן ועמיתיה, בנוסף לפיתוח כמה מהמודלים המוקדמים ביותר של טרשת עורקים הנגרמת על ידי תזונה, הקימו גם מבחן לכימות נגעים טרשת עורקים בסינוס אבי העורקים שהפך לסטנדרט למדידת נגעים במודלים של עכברים15. במהלך השנים טכניקה זו שוכללה ותוארה בפירוט16. כאן אנו מציגים גרסה שונה של "שיטת פייגן" לכימות ואפיון של נגעים טרשת עורקים בעכבר. ניתוח חתכי אבי העורקים הסדרתי מאזור כלי דם ספציפי ובכיוון מוגדר וקבוע, מאפשר איסוף נתונים מדויק ומאפשר זיהוי מדויק של שינויים בהתפתחות הנגע בקבוצות טיפול שונות. השיטות המוצגות כאן מתבססות על הטכניקות הקודמות. באופן ספציפי, אנו מתארים כיצד אפיון הנגע במונחים של שטח, נפח, תוכן נמק ותאי אפשרי באמצעות בחינת חתכים סדרתיים באמצעות שילוב של היסטוכימיה ואימונוהיסטוכימיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ועדת האתיקה למחקר בבעלי חיים באוניברסיטת מקמאסטר אישרה מראש את כל ההליכים המתוארים כאן.

1. קצירת לב ואבי העורקים

  1. הרדמו את העכבר ופתחו בזהירות את חלל החזה כדי לחשוף את הלב ואת אבי העורקים הפרוקסימלי.
    1. חלץ את הדם מהעכבר על ידי פיסוק ישיר של החדר הימני של הלב.
      הערה: ניתן לאחסן את הדם ולהשתמש בו לניתוח שומנים בפלזמה וגורמים אחרים הנישאים בדם.
  2. המתת חסד של העכבר על ידי פריקת צוואר הרחם.
  3. שוטפים את כלי הדם עם 5 מ"ל מי מלח.
    הערה: זה מושג על ידי זלוף כוח הכבידה דרך ניקוב מחט לתוך החדר השמאלי. כדי לאפשר ניקוז, מבצעים חתך קטן באטריום הימני. לאחר שטיפת כלי הדם, ניתן לאסוף דגימות רקמה של רקמת כבד, שריר ושומן, להקפיא בחנקן נוזלי ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לניתוח עתידי.
  4. כלי הדם מקובעים על ידי זלוף כוח הכבידה לחדר השמאלי עם 10% פורמלין ניטרלי.
    הערה: לאחר תחילת הזילוף, הזרימה של פורמלין ניטרלי 10% מותאמת לטפטוף איטי כך שהתהליך לוקח 1-2 דקות. איברים ורקמות שעברו קיבוע פרפוזיה יכולים לשמש לחקר ביטוי חלבונים באמצעות אימונופלואורסצנציה או היסטוכימיה, אך בדרך כלל הם אינם יכולים לשמש כדגימות לכתמים מערביים או לחקר ביטוי גנים.
  5. חלץ בזהירות את הלב וכ -2 מ"מ של אבי העורקים הפרוקסימלי מהפגר. ניתן לאסוף רקמות אחרות כולל אבי העורקים היורד ולאחסן אותן לניתוח עוקב.
    הערה: אבי העורקים היורד (להתפצלות הכסל) יכול לשמש גם לבדיקת טרשת עורקים.
  6. בצע חתך רוחבי עם אזמל על הלב שהוסר באופן מאונך לאבי העורקים העולה.
    הערה: זה מקל על ידי שימוש במיקרוסקופ מנתח וניתן לעשות זאת ביעילות על ידי חיתוך לאורך קו ישר המחבר את הקצוות התחתונים של הפרוזדורים הימניים והשמאליים (איור 1).
  7. אחסן את החלק האפיקלי (העליון) של הלב בקלטת הטבעה וטבל אותו בפורמלין ניטרלי מאגר לעיבוד.

2. הכנת אבי העורקים

  1. הנח את הקסטה עם הרקמה המנותחת לתוך מעבד הרקמות.
  2. עיבוד דגימות רקמה.
    הערה: בדרך כלל, מעבדי רקמות מתוכנתים לעבוד בן לילה בגלל אורך הפעולה והפתרונות הכרוכים בתהליך זה. הדגימות מעובדות בהתאם לפרוטוקול שנקבע:
    1. 10% פורמלין ניטרלי חומצי למשך שעה אחת ב-42 מעלות צלזיוס.
    2. 10% פורמלין ניטרלי חומצי למשך שעה אחת ב-42 מעלות צלזיוס.
    3. 70% אתנול למשך 30 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.
    4. 85% אתנול למשך 30 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.
    5. 100% אתנול למשך 45 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.
    6. 100% אתנול למשך 45 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.
    7. 100% אתנול למשך 45 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.
    8. קסילן למשך שעה בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.
    9. קסילן למשך שעה בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.
    10. קסילן למשך שעה בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.
    11. שעוות פרפין למשך 45 דקות בטמפרטורה של 63 מעלות צלזיוס.
    12. שעוות פרפין למשך 45 דקות בטמפרטורה של 63 מעלות צלזיוס.
    13. שעוות פרפין למשך 45 דקות בטמפרטורה של 63 מעלות צלזיוס.
    14. שעוות פרפין למשך 45 דקות בטמפרטורה של 63 מעלות צלזיוס.
  3. ממיסים את שעוות הפרפין למשך הלילה בחום של 62 מעלות צלזיוס (איורים 1D-E). העריכו את הכמות הכוללת של שעוות פרפין לשימוש על סמך גרמים של שעוות פרפין הדרושים למילוי תבנית היסטולוגית ומספר הבלוקים שיש להכין.
    הערה: תבנית היסטולוגיה עמוקה עדיפה על פני תבנית רדודה מכיוון שהיא מספקת זווית סיבוב פוטנציאלית רחבה יותר בעת החיתוך. תבנית היסטולוגיה עמוקה אחת דורשת 11 גרם שעוות פרפין.
  4. הניחו כל רקמה מעובדת לתוך תבנית היסטולוגית עמוקה, ואז שפכו שעוות פרפין מומסת כדי למלא את התבנית לחלוטין (איור 1F). מכסים את התבנית בקלטת פלסטיק מסומנת (איור 1G).
  5. מצננים את התבנית הממולאת על קרח, או על משטח קר (איור 1H), על מנת ליצור את הגוש המוצק ולהפריד את הבלוק מהתבנית (איורים 1I-J).
    הערה: כאשר מניחים את הלב המנותח בתבנית, ודא שהפנים הפנימיות של הלב נוגעות בבסיס התבנית, ולאחר מכן המשך למלא את הבלוק בפרפין מומס. קלטת פלסטיק מסומנת מכסה את התבנית לפני שהיא מתמצקת על מנת לספק בסיס לטיפול בבלוק. לאחר הקירור, מסירים את התבנית וניתן לאחסן את גושי הפרפין ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר.

3. חתך של אבי העורקים

  1. מקמו את הבלוק עם הלב במחזיק הדגימה של המיקרוטום כך שניתן יהיה לחתוך אותו מבפנים לכיוון החלק העליון של הלב (איור 2)
  2. התאם את המיקרוטום כדי לחתוך בעובי חתך של 10 מיקרומטר והמשך לחתוך את הלב.
  3. אסוף חלקים על שקופית זכוכית ובדוק תחת מיקרוסקופ אור כדי לקבוע מיקום וכיוון.
  4. כאשר מתגלים 1 או 2 שסתומים של סינוס אבי העורקים, כוונן את זווית הבלוק לפי הצורך (איור 3A).
    הערה: הסינוס צריך להופיע כשלושה בסיסי שסתומים דו-חלקיים עם עלונים מחוברים. אם נצפים רק עלון שסתום אחד או שניים, יש לכוונן את זווית החיתוך בהתאם.
  5. כוונן את המיקרוטום לחיתוך ב-4-5 מיקרומטר ואסוף את החלקים על שקופיות זכוכית מצופות.
    הערה: למרות שההליך יכול להיות מגוון, מומלצת גישה שיטתית, לפיה 10 החלקים הראשונים, מהסינוס של אבי העורקים המתקדם במעלה אבי העורקים העולה, נאספים על החלק העליון של שקופיות זכוכית מסומנות (שקופיות המסומנות 1-10). החלקים הבאים נאספים לפי אותו דפוס: #11-20, #21-30, #31-40 עד שהנגעים הטרשת כבר לא נצפים (איור 3B). בדרך זו ניתן לבחון ולאפיין את הנגעים הטרשת במיקומים מדויקים לאורך אבי העורקים העולה. לדוגמה, שקופית 1 מכילה קטעים 1, 11, 21, 31, 41 ו-51, המייצגים נגעים טרשת עורקים מהסינוס של אבי העורקים במעלה אבי העורקים העולה. ניתן לכלול שקופיות נוספות, המסומנות 11-20, אם הנגע גדול, כדי לאסוף חלקים דיסטליים יותר לפי אותו דפוס.
  6. המשך לאסוף חלקים עד שלא נצפה נגע טרשת עורקים.
    הערה: ניתן לאחסן שקפים בטמפרטורת החדר למשך חודשים, לפני ניתוח נוסף.

4. צביעה וכימות של נגעים טרשת עורקים

ניתן לנתח נגעים טרשת עורקים בדרכים רבות ושונות באמצעות מגוון טכניקות. הניתוח הבסיסי ביותר כולל קביעת שטח חתך הנגע. על מנת להשוות במדויק את שטח הנגע, חשוב שנקודת ההתחלה למדידת הנגע תהיה עקבית ממדגם לדגימה. זה מקל על ידי שימוש בעלוני השסתום להתמצאות. כדי להקל על זיהוי וכימות מדויקים של אזור הנגע, חתכים נבחרים מוכתמים בהמטוקסילין ואאוזין. זה כרוך בטבילת השקופיות בסדרה של תמיסות לזמנים מוגדרים, שיפרשו / יכתמו את הרקמה.

פרוטוקול לצביעת המטוקסילין ואאוזין:

  1. הכניסו את השקופיות למייבש האוויר למשך 8 דקות ולאחר מכן הפזרו את החלקים על ידי שטיפה של 4× בקסילן, למשך 3 דקות לכל כביסה.
  2. שטפו שקופיות ב-100% אתנול 3× למשך 3 דקות כל אחת.
  3. שוטפים 3× באתנול 70% למשך 3 דקות כל אחד ולאחר מכן 2× באתנול 50% למשך 3 דקות כל אחד.
  4. שוטפים במים מזוקקים ולאחר מכן טובלים בהמטוקסילין של מאייר למשך 15 דקות.
  5. שטפו במי ברז זורמים למשך 5 דקות ולאחר מכן שטפו במים מזוקקים למשך 5 דקות.
  6. טבלו ב- Eosin Y למשך 1-5 דקות.
  7. שוטפים במים מזוקקים 3× למשך 5 דקות כל אחד, שוטפים פנימה 50% אתנול 2× למשך 2 דקות כל אחד, ואז 70% אתנול 3× למשך 2 דקות כל אחד.
  8. שוטפים פנימה 100% אתנול 3× למשך 2 דקות כל אחד ואז שוטפים בקסילן 4× למשך 2 דקות כל אחד.
  9. הרכיבו קטעים באמצעות מדיום הרכבה מבוסס קסילן וצלמו תמונות באמצעות מצלמה דיגיטלית המותקנת על מיקרוסקופ אור.
  10. זיהוי וכימות אזור הנגע באמצעות תוכנת הדמיה.
    הערה: ניתן לקבוע את שטח הנגע במרחקים ספציפיים מהסינוס האאורטלי במרווחים של 40-50 מיקרומטר (תלוי בעובי של כל קטע). תרשים של מדידות שטח אלה לעומת מרחק נותן פרופיל של הנגע הטרשת (איור 4). השטח שמתחת לעקומה מייצג אומדן של הנפח הכולל של הנגע הטרשתי. אפיון נוסף של הנגע יכול לכלול קביעת השטח הנמק. הליבה הנמקית (nc) של נגע מתקדם נוצרת על ידי תאי קצף אפופטוטיים. עם תרגול, ניתן לקבוע זאת על ידי בחינת האזורים הא-תאיים של החלקים המוכתמים בהמטוקסילין ואאוזין (איור 4A). לנגעים מוקדמים יש מעט מאוד נמק בעוד שלנגעים מתקדמים יותר יש אזורים נמקיים מוגברים שעלולים לתרום לחוסר יציבות של הפלאק. יש לבחון חתכים סדרתיים של אותו אבי העורקים כדי לאשר נוכחות של אזור נמק.

5. אפיון נוסף של הנגע הטרשת

פרטים ספציפיים לגבי שלב ההתפתחות של טרשת עורקים יכולים להיקבע על ידי צביעה בנוגדנים המכוונים נגד סוגי תאים או סמנים ספציפיים. אימונוהיסטוכימיה על קטעי פרפין היא טכניקה סטנדרטית המשמשת לזיהוי סוגי תאים או סמנים ספציפיים בהקשר של הרקמה הלא מוכתמת שמסביב. זיהוי אנטיגן מושג בדרך כלל באמצעות מצע פרוקסידאז חזרת.

צביעה אימונופלואורסצנטית כרוכה בשימוש בנוגדנים מצומדים פלואורופור ודורשת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומסננים מתאימים לזיהוי. טכניקה זו מאפשרת צביעה בו זמנית של שני אנטיגנים (או יותר).

פרוטוקול כללי לצביעה אימונוהיסטוכימית:

  1. הנח את המגלשות במייבש האוויר למשך 8 דקות.
  2. Deparaffinize חלקים ב-4 שינויים של קסילן, 3 דקות כל אחד.
  3. שטפו פנימה 100% אתנול 3× למשך 3 דקות כל אחד כדי להסיר קסילן.
  4. שוטפים 3× ב-70% אתנול למשך 3 דקות כל אחד, ואז 2× ב-50% אתנול למשך 3 דקות כל אחד.
  5. שוטפים במים מזוקקים 5 דקות כל אחד ואז שוטפים 3× ב-PBS למשך 5 דקות כל אחד.
  6. בצע אחזור אנטיגן. ניתן להשיג זאת בשיטת אחזור אפיטופים המושרה בחום (HIER) בסיר לחץ מיקרוגל ובתמיסת אחזור אנטיגן (מאגר ציטראט 10 מ"מ, pH 6.0).
    הערה: תהליך קיבוע הפורמלין עשוי להסוות את האנטיגנים המעניינים. מניסיוננו, ה-HIER משפר משמעותית את הביצועים של נוגדנים מסוימים, אך אינו נדרש עבור אחרים. בנוסף, ישנן חלופות זמינות אחרות לשיטת HIER לאחזור אנטיגן.
  7. כאשר סיר הלחץ התקרר, הנח שקופיות ב-PBS למשך 15 דקות.
  8. דגרו חלקים בסרום רגיל (מאותו המין שממנו נגזר הנוגדן המשני) למשך 30 דקות. אין לשטוף שקופיות - לנקז את הסרום.
  9. יש לדגור עם נוגדן ראשוני מדולל בסרום חוסם רגיל למשך שעתיים בטמפרטורת החדר או למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
  10. יש לשטוף עם PBS 3× למשך 5 דקות כל אחד.
  11. דגרו חלקים עם הנוגדן המשני הביוטיניל שדולל ב-PBS למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  12. דגרו מגלשות עם חזרת פרוקסידאז סטרפטווידין למשך 30 דקות ואז שטפו עם PBS 3× למשך 5 דקות כל אחת.
  13. תגובה כרומוגנית- מגלשות דגירה ב-DAB טרי (3,3'-דיאמינובנזידין) למשך 5-30 דקות. יש לעקוב אחר תגובה זו באמצעות מיקרוסקופ. עצור את התגובה על ידי שטיפת שקופיות במי ברז.
  14. יש לטשטף עם המטוקסילין למשך דקה אחת. יש לשטוף במי ברז למשך 5 דקות ולאחר מכן לשטוף במים מזוקקים 3× למשך 5 דקות כל אחד.
  15. חזור על שלבים 4.7-4.9 להרכבת שקופיות.

6. פרוטוקול כללי לצביעה אימונופלואורסצנטית

ניתן לעקוב אחר פרוטוקול דומה, עם שינויים קלים, לצביעה אימונופלואורסצנטית.

  1. הנח שקופיות במייבש האוויר למשך 8 דקות ולאחר מכן הסר חלקים ב-4 החלפות של קסילן, 3 דקות כל אחד.
  2. שטפו פנימה 100% אתנול 3× למשך 3 דקות כל אחד כדי להסיר קסילן.
  3. שוטפים 3× ב-70% אתנול למשך 3 דקות כל אחד, ואז 2× ב-50% אתנול למשך 3 דקות כל אחד.
  4. שוטפים במים מזוקקים במשך 5 דקות כל אחד ואז שוטפים ב-PBS 3× למשך 5 דקות כל אחד.
  5. בצע אחזור אנטיגן. ניתן להשיג זאת בשיטת אחזור אפיטופים המושרה בחום (HIER) בסיר לחץ מיקרוגל ובתמיסת אחזור אנטיגן (מאגר ציטראט 10 מ"מ, pH 6.0).
    הערה: תהליך קיבוע הפורמלין עשוי להסוות את האנטיגנים המעניינים. מניסיוננו, ה-HIER משפר משמעותית את הביצועים של נוגדנים מסוימים, אך אינו נדרש עבור אחרים. בנוסף, ישנן חלופות זמינות אחרות לשיטת HIER לאחזור אנטיגן.
  6. כאשר סיר הלחץ התקרר, הנח שקופיות ב-PBS למשך 15 דקות.
  7. דגרו חלקים בסרום רגיל (מאותו המין שממנו נגזר הנוגדן המשני) למשך 30 דקות. אין לשטוף שקופיות - לנקז את הסרום.
  8. יש לדגור עם נוגדן ראשוני מדולל בסרום חוסם רגיל למשך שעתיים בטמפרטורת החדר או למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
  9. יש לשטוף עם PBS 3× למשך 5 דקות כל אחד.
  10. הוסף נוגדן מצומד פלואורופור משני המדולל בסרום חוסם רגיל (או PBS). יש לדגור למשך שעה וחצי בטמפרטורת החדר.
  11. יש לשטוף עם PBS 3× למשך 5 דקות כל אחד.
  12. כתם נגד עם DAPI.
  13. שוטפים ב-PBS 3× למשך 5 דקות כל אחד.
  14. החל כיסוי באמצעות אמצעי הרכבה נגד דהייה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

 עכברים LDLR-/- בני חמישה שבועות הוזנו בתזונה סטנדרטית או בתזונה עשירה בשומן במשך עשרה שבועות. העכברים נשחטו ועברו פרפוזיה בפורמלין כפי שתיארנו לעיל. נחתכו חתכים רוחביים של הסינוס האורטי ונצבעו בהמטוקסילין ואוזין כדי לקבוע את שטח ונפח הנגעים (איור 4). כאשר עכברים מוזנים בתזונה סטנדרטית, התפתחות העתירקים היא מוגבלת מאוד ועשויה שלא להיות ניתנת לגילוי בגיל 15 שבועות. תזונה עשירה בשומן מאיצה באופן משמעותי את האתרוגנזה במודל זה ומשרה היווצרות של נגעים מתקדמים וגדולים המכילים ליבות נמק אל-תאיות וכיסויי סי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טרשת עורקים היא מחלה כרונית מורכבת של עורקי השרירים הגדולים המהווה גורם בסיסי עיקרי לאוטם שריר הלב ושבץ מוחי. התקדמות המחלה כרוכה באינטראקציה של סוגי תאים רבים ושונים בתוך דופן העורק, עם תאי דם במחזור הדם, חלקיקי ליפופרוטאין וגורמים אחרים הנישאים בדם שאנו רק מתחילים להבין. חלק גדול מהידע הנוכחי שלנו לגבי התפתחות והתקדמות של טרשת עורקים הגיע ממחקרים שבוצעו במערכות מודלים של עכברים המועדים לטרשת עורקים שתוכננו במיוחד.

חשוב לזכור שלמודלים של עכברים של טרשת עורקים יש כמה מגבלות משמעותיות. ברור שבה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי מענק תפעולי מהמכונים הקנדיים למדעי הבריאות והאגודה הקנדית לסוכרת. DEV נתמך על ידי מלגה מ-Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT, צ'ילה).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
עכברים חסרי LDLR ( D2.129S7(B6)-Ldlrtm1Her/J)מעבדת ג'קסון#002207
פורמליןסיגמא-אולדריץ'HT5011
תבניות היסטולוגיהטד פלה בע"מ27195
פרפיןפרמט19286-10
שקופיות מצופותפישר12-550-15
מיכלי ממסרקמות טק II4457
MicrotomeLeicaRM22S5
אמבט מיםVWR80086-982
מיקרוסקופאולימפוסBX41TF
מצלמהאולימפוסDP72
ImageJNIHwww.rsbweb.nih.gov/ij/
מעבדסאקורה פינטקVIP6-A1
קלטות עיבודVWR18000-134
Preassure סירנורדי כלים
Coverslipפישר12-545-M
PBSSigma-AldrichP3813
להב מיקרוטוםThermo Scientific30-518-35
Antifade הרכבה בינוניתסיגמא-אולדריץ'F-4680
קסילן בינוני Sigma-Aldrich44581
מדיום הרכבה אקוואליSigma-AldrichI1161
Mac-3 anbodyBD Pharmingen553322
DAPISigma-AldrichD9542
F4/80 נוגדןAbcamAb6640
נוגדן אלפא אקטיןSanta Cruz BiotechnologySC-32251
Mayer’ s המטוקסיליןסיגמא-אולדריץ'E4382
eosin yסיגמא-אולדריץ'MHS16
DAB (3,3'-דיאמינובנזידין)דקוK3468
מלאי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zadelaar, S., Kleemann, R., et al. Mouse models for atherosclerosis and pharmaceutical modifiers. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27 (8), 1706-1721 (2007).
  2. Daugherty, A., Rateri, D. L. Development of experimental designs for atherosclerosis studies in mice. Methods. 36, 129-138 (2005).
  3. Getz, G. S., Reardon, C. A. Diet and murine atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 26 (2), 242-249 (2006).
  4. Zhang, S. H., Reddick, R. L., et al. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258 (5081), 468-471 (1992).
  5. Ishibashi, S., Goldstein, J. L., et al. Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice. J. Clin. Invest. 93 (5), 1885-1893 (1994).
  6. Kunjathoor, V. V., Wilson, D. L., LeBoeuf, R. C. Increased atherosclerosis in streptozotocin-induced diabetic mice. J. Clin. Invest. 97 (7), 1767-1773 (1996).
  7. Hartvigsen, K., Binder, C. J., et al. A diet-induced hypercholesterolemic murine model to study atherogenesis without obesity and metabolic syndrome. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27 (4), 878-885 (2007).
  8. King, V. L., Hatch, N. W., et al. A murine model of obesity with accelerated atherosclerosis. Obesity. 18 (1), 35-41 (2004).
  9. Taylor Weiss, D. &, R, W. Deoxycorticosterone acetate salt hypertension in apolipoprotein E-/- mice results in accelerated atherosclerosis: the role of angiotensin II. Hypertension. 51 (2), 218-224 (2008).
  10. Gairola, C. G., Drawdy, M. L., et al. Sidestream cigarette smoke accelerates atherogenesis in apolipoprotein E-/- mice. Atherosclerosis. 156 (1), 49-55 (2001).
  11. Pynn, M., Schäfer, K., et al. Exercise training reduces neointimal growth and stabilizes vascular lesions developing after injury in apolipoprotein e-deficient mice. Circulation. 109 (3), 386-392 (2004).
  12. Nakashima, Y., Plump, A. S., et al. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler. Thromb. 14 (1), 133-140 (1994).
  13. Reddick, R. L., Zhang, S. H., Maeda, N. Atherosclerosis in mice lacking apo E. Evaluation of lesional development and progression. Arterioscler. Thromb. 14 (1), 141-147 (1994).
  14. Tangirala, R. K., Rubin, E. M., Palinski, W. Quantitation of atherosclerosis in murine models: correlation between lesions in the aortic origin and in the entire aorta, and differences in the extent of lesions between sexes in LDL receptor-deficient and apolipoprotein E-deficient mice. J. Lipid Res. 36 (11), 2320-2328 (1995).
  15. Paigen, B., Morrow, A., et al. Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice. Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).
  16. Baglione, J., Smith, J. D. Quantitative Assay for Mouse Atherosclerosis in the Aortic Root. Methods in Molecular Medicine. 129, (2006).
  17. Lee, T. Y., Muschal, S., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
  18. Ballon, G., Chen, K., et al. Kaposi sarcoma herpesvirus (KSHV) vFLIP oncoprotein induces B cell transdifferentiation and tumorigenesis in mice. J. Clin. Invest. 121 (3), 1141-1153 (2011).
  19. Khallou-Laschet, J., Varthaman, A., et al. Macrophage plasticity in experimental atherosclerosis. PLoS One. 5 (1), e8852(2010).
  20. Rotzius, P., Thams, S., et al. Distinct infiltration of neutrophils in lesion shoulders in ApoE-/- mice. Am. J. Pathol. 177 (1), 493-500 (2010).
  21. Kanellakis, P., Agrotis, A., et al. High-mobility group box protein 1 neutralization reduces development of diet-induced atherosclerosis in apolipoprotein e-deficient mice. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (2), 313-319 (2011).
  22. Schwartz, C. J., Mitchell, J. R. Observations on localization of arterial plaques. Circ. Res. 11, 63-73 (1962).
  23. Won, D., Zhu, S. N., Chen, M., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. Am. J. Pathol. 171 (5), 1691-1704 (2007).
  24. Rosenfeld, M. E., Polinsky, P., et al. Advanced atherosclerotic lesions in the innominate artery of the ApoE knockout mouse. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20 (12), 2587-2592 (2000).
  25. McAteer, M. A., Schneider, J. E., et al. Quantification and 3Dreconstruction of atherosclerotic plaque components in apolipoprotein E knockout mice using ex vivo high-resolution MRI. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (12), 2384-2390 (2004).
  26. Martinez, H. G., Prajapati, S. I., et al. Images in cardiovascular medicine: Microscopiccomputedtomography-based virtual histology for visualization and morphometry of atherosclerosis in diabetic apolipoprotein e mutant mice. Circulation. 120 (9), 821-822 (2009).
  27. Kirkby, N. S., Low, L., et al. Quantitative 3-dimensional imaging of murine neointimal and atherosclerotic lesions by optical projection tomography. PLoS One. 6 (2), e16906(2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

LDLR

מאמרים קשורים