שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

סיכום

הקמת מודלים האנושיים של מחסום דם המוח (BBB) ​​יכולה להועיל למחקר לתנאי מוח הקשורים לכישלון BBB. אנו מתארים כאן טכניקה משופרת להכנת מודל BBB מגע, המאפשר coculturing של האסטרוציטים אנושיים ותאי האנדותל במוח בצדדים המנוגדים של קרום נקבובי.

תקציר

מחסום דם המוח (BBB) ​​כולל נימים במוח בלתי חדירים, אבל להתאמה אשר בחוזקה לשלוט בסביבת המוח. כישלון של BBB כבר רמז באטיולוגיה של מחלות רבות במוח, יוצר צורך בפיתוח של אדם במודלי BBB חוץ גופית על מנת לסייע במחקר קליני רלוונטי. בין דגמי BBB הרבים עד כה תיארו, סטטי (ללא זרימה), פנה למודל BBB, שם האסטרוציטים ותאי האנדותל במוח (BECs) הם cocultured בצדדים המנוגדים של קרום נקבובי, התפתחה מערכת עדיין אותנטית פשוטה כדי לדמות את BBB עם קיבולת הקרנת תפוקה גבוהה. אף על פי כן הדור של מודל כזה מציב אתגרים טכניים כמה. כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת מודל BBB אדם קשר ניצול שילוב רומן של BECs האנושית הראשונית והאסטרוציטים אנושיים הונצחו. באופן ספציפי, אנחנו פירוט שיטה חדשנית לתא זריעה על מוסיף הפוך, כמו גם לציין inserטכניקות צביעת t ומדגימים כיצד אנו משתמשים במודל שלנו למחקר הקשורים ל-BBB.

מבוא

BBB הוא ממשק מיוחד בין מערכת העצבים המרכזית, מכריע אחראית לתחזוקה של עצירת דימום במוח זרימת הדם ההיקפית ו. היא כוללת תאים שונים במוח כלי הדם אנדותל (BECs) שמושפעים מבחינה תפקודית על ידי כמה מרכיבים תאיים וacellular (להלן) כדי ליצור שער חזק ודינמי אל המוח. בתנאים פיסיולוגיים BBB מגביל את המעבר של תאי דם, מרכיבי פלזמה וחומרים מזיקים, כל הפוטנציאל רעיל למערכת עצבים, למוח. במקביל, BBB סלקטיבי מחליף יוני מפתח וחומרים מזינים (גלוקוז וחומצות אמינו) ומוצרי פסולת המטבולית בין המוח ואת זרימת הדם כדי לשמור על סביבת מוח ^1,2 בדיוק. בשנים האחרונות זה הופך להיות ברור כי כישלון של BBB מתרחש במגוון רחב של פתולוגיות מוח כרוניות, כגון מחלות ניווניות או הקשורים לדלקת (למשל מחלת אלצהיימר וmultiplדואר הטרשת נפוץ, בהתאמה) ^3, כמו גם במצבים חריפים כמו שבץ איסכמי ^4.

מאפייני BBB הייחודיים של תאי האנדותל במוח (BECs) מושרים בעיקר על ידי סביבת מוחותיהם ^5, ובפרט על ידי האסטרוציטים ^6,7. יש הבנה גוברת כי תאים מסוגים אחרים, כגון pericytes ^8, תאי עצב ומיקרוגליה ^1,3, כמו גם את הקרום במרתף ^9, לתמוך BECs ויוצרים יחד יחידה תפקודית מכונה "יחידת העצבים וכלי הדם" (NVU) אשר בו זמנית זוגות עצביים דרישות חילוף חומרים לנימי אספקתם ^10.

מעורבותם של BBB במצבים פתולוגיים בבסיס ניסיונות רבים לפתח מודלים BBB חוץ גופית על מנת לסייע במחקר הקשורים ל-BBB ^11,12. מודלים אלה שואפים לחקות קרובים ככל האפשר במאפייני BBB vivo על פי עיקרון NVU. במבחנה דגמי BBB בדרך כלל מסתמכים על monolayer של BECs קפוצת יוצרי צומת (בעיקר משור ^13, אדם ^14, עכברוש ^15, עכבר ^{16, ו17,18} מקורות חזיריים), יחד תרבית על קרום נקבובי עם האסטרוציטים תמיכה (בהרחבה נסקר על ידי מעדניית et al. ¹¹ 2005).

ניתן לגדל האסטרוציטים בתנאים ללא מגע ובחלק התחתון של תרבית רקמה, מופרד מBECs (טיפחה על פני השטח העליונים של הקרום) על ידי התרבות בינונית עדיין מתקשר עם BECs באמצעות גורמים מסיסים ^16. בדגמים מתקדמים יותר שטוב יותר דומה למבנה האנטומי של BBB in vivo, האסטרוציטים נשמרים בתנאי התקשרות ותרבותיים ישירות בצד השני של הקרום בסמיכות לBECs ^13,15,17 (איור 1). תצורה זו מאפשרת מגע פיזי בין BECs והאסטרוציטים, שהוקם כאשר פרויקט האסטרוציטיםהתהליכים שלהם דרך הקרום הנקבובי. חשוב מכך, למגע אמיתי להתרחש צריך להיות ≥ הנקבוביות 1μm בקוטר, שכן קצה רגליים astrocytic לא יכולות לעבור בגדלים קטנים יותר נקבוביות (כלומר 0.4 מיקרומטר) ^14,15. יש לציין, מערכות BBB קשר הם הפגינו בחלק מהמחקרים להיות עדיף על עמיתיהם שאינם אנשי הקשר שלהם בנוגע להתנגדות שלהם טרנס אנדותל החשמלי (Teer) וערכי חדירות האנדותל של קליעים נותבים שונים ^13,17,18. ממד נוסף של זרימת מדיה נוספה לאחרונה במספר במבחנה המודלים BBB ליישם כוחות גזירה לאנדותל לסימולציה קרובה יותר של כלי הדם במוח ^12,19.

מכשול טכני אחת להתגבר בעת יצירת מודל BBB קשר הוא הזריעה של האסטרוציטים כנגד כוח הכבידה על פני השטח abluminal של הקרום הנקבובי. פרוטוקולים קודמים ^13,20, שם האסטרוציטים היו פשוט זורעים בירידה של תקשורת על גבי בהוספת verted, אפשר פעמים זריעה קצרה בלבד (כלומר 10 דקות ¹³ או 2 שעות ²⁰⁾ שנמצאו בידיים שלנו לא הספיק לקובץ מצורף תא תקין. שימוש בשיטה בסיסית זו, תקופת התקשרות astrocyte כבר לא דורשת ניטור מתמיד של מוסיף על ידי פתיחה תכופה של החממה (גורמת לתנודות בטמפרטורה, חומציות ולחות), והוא גם נוטה לזריעת תא אחידה עקב דליפה של תקשורת הדרך הנקבוביות, במיוחד אם הנקבוביות גדולות יותר מאשר 1 מיקרומטר הם מועסקים.

כאן אנו מתארים פרוטוקול כללי להכנת מודל BBB ליצירת קשר. ההליך שלנו כולל את שיטה חלופית לתא זריעה על מוסיף הפוך, העוסק במגבלות שהוזכרו לעיל. השיטה מאפשרת לדבקות באין מפריע של האסטרוציטים על פני השטח קרום abluminal, בחממת equilibrated, במשך תקופה ארוכה של זמן. כתוצאה מכך, זריעה אחידה של האסטרוציטים מושגת אשר מגדילה את איכות מחסוםוממזער וריאציות חדירות בסיסי בין מוסיף.

ככל שהשימוש בתאים אנושיים הוא חשוב למחקר אנושי רלוונטי ^21, אנחנו בנוסף להפגין במאמר זה ניצול המסוים של שילוב רומן של BECs האנושית הראשונית והנציחו את האסטרוציטים אדם להקמת מודל BBB אדם מגע עם יכולת הקרנת תפוקה גבוהה . מאז שצפו בתאים בממברנות נקבוביות יכול להיות לנו גם טכניקות קשות, פרט מכתים אשר יכול לסייע בקביעת המפגש והמורפולוגיה של תאים על הקרומים נקבוביים. לבסוף, אנו מדגימים כיצד מודל BBB האנושי שלנו יכול להיות מנוצל כדי לבחון את ההשפעה של activator plasminogen רקמות מהסוג (t-PA) - אנזים קריש קורע המשמש כאפשרות טיפול יחידה לשבץ איסכמי חריף - על BBB.

פרוטוקול

1. תרבית תאים (3-7 ימים לפני אסיפת BBB)

1.1. תאי המוח אנושי כלי הדם האנדותל ראשיים (BECs)

BECs התקבלו באופן מסחרי. התאים יוצרו על ידי ניתוק dispase של רקמת קליפת המוח האנושי נורמלית ובתנאי קפוא במעבר 3 (<12 הכפלות אוכלוסייה).

1. התשתית: כלי פרווה רקמות תרבות עם "פקטור קובץ מצורף" לפי הוראות היצרן.
2. תחזוקה נייד: שמור על BECs בינונית מלא המכיל סרום. לניסויים, תרבות BECs במדיום סרום ללא מוחלט. לשמור על התאים ב5% CO ₂ humidified, 21% O ₂ באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס
   הערה: כחלופה לחומרים כימיים מיוחדים, 0.1% (w / v) פתרון לטין יכול לשמש כמגיב ציפוי תוך DMEM/F-12 תוספת 15 HEPES מ"מ, 10% (v / v) עוברי עגל בסרום (FCS), L-גלוטמין 2 מ"מ, 50 מיקרוגרם/ מיליליטר gentamycin, 20 מיקרוגרם / מיליליטר הפרין ו20 מיקרוגרם / תוסף צמיחת תאי האנדותל מיליליטר ניתן להשתמש בם לצורך תחזוקת BEC.
3. תת culturing לניסויים: BECs מחוברות פיצול ביחס של 1:03-1:06, תלוי בזמן המיועד לשימוש הבא (3-7 ימים). לשנות את מדיום התחזוקה כל 3 ימים. השתמש BECs עד 15 מעברים.

1.2. תא אונליין SVG האדם העוברי astroglial

תאים עובריים האנושיים SVG astroglial ²² נגזרו במקור מתרבויות עיקריות של מוח העוברי של אדם הפך עם נגיף סימיאן הכפול מחסרת 40.

1. תחזוקה: תרבות תאי SVG במדיום חיוני מינימאלי עם תמיסת מלח מאוזנת של ארל בתוספת 20% (v / v) FCS (אותו אחוז בסרום משמש כדי לשמור על התאים הראשוניים של הוריהם ^22), 2 L-גלוטמין מ"מ, 50 / ml פניצילין U ו 50 סטרפטומיצין מיקרוגרם / מיליליטר. לשמור על התאים בhumidified 5% CO _2, 21% O ₂ חממה ב 37 ° C.
2. תת culturing לניסויים: SVGs מחוברות פיצול ביחס של 1:05-1:10, תלוי בזמן המיועד לשימוש הבא (3-7 ימים). ההסרה של טריפסין לא נדרשה בשל התכולה הגבוהה של סרום במדיום. לשנות את המדיום כל 3 ימים. השתמש SVGs עד 20 מעברים.

2. הרכבה וCoculturing של האדם במבחנה BBB הדגם (יום 0)

הערה: האדם במודל BBB קשר מבחנה מוכן על פי פרוטוקולים שפורסמו ^13,23, עם שינויים.

2.1. ציפוי של תוספות

1. הנח מוסיף רקמות תרבות (6.5 מ"מ קוטר עם קרום נקבובי פוליאסטר, 3 מיקרומטר נקבובית בגודל) בבארות של צלחת 24 גם סיפקה. מעייל את פני השטח luminal של מוסיף לילה חממה 37 מעלות צלזיוס humidified עם קולגן עכברושי (20 מיקרוגרם / ² סנטימטר; 50 μl של 132 מיקרוגרם/ מיליליטר קולגן אני ב0.02% חומצה אצטית במים מילי-Q (MQH ₂ O)). שטוף מוסיף פעם אחת (שניהם מהצד abluminal וluminal) עם MQH ₂ O להסיר את החומצה יורית.
   הערה: קרום במרתף של נימי דם במוח לא מכיל קולגן אני אבל בעיקר laminins, isoforms סוג IV קולגן, nidogens, וproteoglycans סולפט heparan ^9. מסיבה זו, חלק מהחוקרים לנצל סוכני ציפוי כגון IV קולגן, פיברונקטין ^13, או Matrigel (מדעי החיים BD) ¹⁶ לדוגמנות BBB יותר אותנטית.

2.2. SVGs זריעה על המשטח התחתון ממברנה (Abluminal)

1. הפוך את הכנס ובעדינות שיתאים סביב השפה של הקרום הנקבובי חתיכת צינורות סיליקון אלסטי קצרה ("צינורות חיצוניים"; קוטר ~ ארוך 10 מ"מ, 8 מ"מ פנימי, 1.6 קיר מ"מ), ויוצר במהותו חדשה גם מעל פני השטח abluminal (איור 2 א).
2. התחתון של בית הכנסds להיות אטום כדי למנוע דליפת תקשורת. ראשית, להכין את תקע (איור 2 א ו -2 ב) עשוי מצינורות סיליקון (שמכונים "צינור פנימי"; ~ עוד 8 מ"מ, 3.2 מ"מ קוטר פנימי, קיר 1.6 מ"מ; איור 2), אטום בקצה אחד עם קונוס איטום פלסטיק (~ 3 מ"מ ארוך; שהוכן על ידי חיתוך החלק התחתון של תגובת 0.2 מיליליטר פולימראז שרשרת (צינור PCR); איור 2). חרוט זה חותם לא רק לום צינורות הפנימי, אלא גם מרחיב את הקצה שלה להתאמה הדוקה יותר להוספה. בשלב בא, באמצעות מלקחיים סטריליות, להכניס את תקע סיליקון לתוך חלל luminal ולקדם אותה עד שהוא מגיע 1-2 מ"מ של עד ~ מן הקרום (איור 2 א).
3. בשלב הבא, זרע 4 x 10 ⁴ תאי SVG ב200 בינוני תחזוקת SVG μl (se1.2.2 ction לעיל) ישירות לתוך סיליקון היטב מעל פני השטח קרום abluminal (איור 2 א). לאפשר SVGs לדבוק לפחות 4 שעות בחממה.
   הערה: כדי לשמור על סטריליות להעביר מוסיף התאסף בין שתי 6 גם צלחות (צלחת אחת הפוכה מעל אחרים; איור 2C) כדי לצמצם את החשיפה לאוויר לא מסונן במהלך ההליך. צינורות סיליקון ותקעים נשטפים באתנול וautoclaved לשימוש מאוחר יותר.
   הערה: תקעי שימוש (סעיף 2.2.2) רק מוסיף עם נקבובית קרום גדלים גדול יותר מאשר 1 מיקרומטר. ממברנות בקוטר נקבובית ≤ 1 מיקרומטר לעתים רחוקות דליפה ודורשות רק ההתאמה של הצינור החיצוני סיליקון (סעיף 2.2.1). בנוסף, חלק מסוכני הציפוי אחרים מאשר קולגן אני (ראה הערה בסעיף 2.1) עלולים למנוע דליפות אפילו עד 3 מיקרומטר נקבוביות. לקבוע באופן אמפירי זה.
4. על מנת לפקח על מצב הדבקות של האסטרוציטים שלך, זרע במקביל ל96, גם נפח זהה סטנדרטי של תא ההשעיה astrocyte. יש גם את זה את אותו שטח פנים כמו להכניס 6.5 מ"מ (0.33 ² סנטימטר) ומאפשר הדמיה קלה יותר של תאים על ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד מאשר הקרום להוסיף. כשאתה מתבונן דבקות מספקת של astrocyte בשליטה 96 היטב, האסטרוציטים לי כראוי דבקו גם על הקרום להוסיף.
5. כאשר האסטרוציטים יש דבק מספיק בשליטה 96 היטב, להעביר אסיפות להכניס למכסת המנוע בתרבית הרקמה (ראה הערה לעיל) ובעדינות להסיר את צינורות סיליקון החיצוניים ותקעים. לחזור מוסיף לכיוון הרגיל (כלומר זקוף) לתוך הבארות סיפקו מכילות 800 μl / טוב של מדיום BEC תחזוקה (סעיף 1.1.2 לעיל).

2.3. זריעה של BECs ללשכת לומינל מעל האסטרוציטים

זרעי 2x10 ⁴ BECs ב200 μl על פני השטח luminal מצופה קולגן ולהחזיר את inseRTS לתוך החממה.

2.4. Coculturing

Coculture מוסיף SVG / BEC נזרע במשך 3 ימים במדיום BEC ללא שינוי תקשורת לפני הניסויים.

3. ניסויים עם דגם BBB האנוש (יום 3)

1. כדי לעורר את התאים במבחנה הכביסה הראשונים BBB על ידי החלפת כלי תקשורת abluminal וluminal עם 600 μl ובינוני BECs סרום ללא 100 μl, בהתאמה.
2. לשאוב את מדיום luminal שוב ולהחליף עם של מדיום סרום ללא 100 μl עם סוכני מגרה.
   הערה: אם גירוי של חדר abluminal נדרש (כדי להפעיל את במבחנה BBB מתא astrocytic), לשאוב את מדיום abluminal ולהחליף עם 600 ul של מדיום סרום ללא גירוי עם סוכנים.
3. לבדוק כל קבוצת ניסוי בשלושה עותקים (ומכאן, אם גירוי luminal מבוצע, אשר דורש 3 x 100 μl, אנו ממליצים על דילול מחדש סוכנים לריכוזים הסופיים שלהם ב350 μl של מדיום סרום ללא לכל קבוצה כדי למזער שגיאות pipetting בין בארות).
4. בצע paracellular סטנדרטי ו / או מבחני חדירות transcellular של קליעים נותבים שכותרת ^16,24 (עבור האחרונים אנו משתמשים isothiocyanate והעמסת (FITC) מצומדות אלבומין) ו / או מדידה של Teer ^13,16,25 כפי שתואר לעיל.

כדי להסביר את תנודות בחדירות תחילת המחקר בין ניסויים, לנתח שינויים בביחס חדירות להוספה מצופה ללא תאים (המשמש כנקודת התייחסות לחדירות מקסימליים) ולקבוצה שטופלה ברכב תוך שימוש בנוסחה: חדירות (% ממקסימום) = ( ערך חדירות של הכנס ניסיוני - ערך חדירות ממוצע של קבוצת הרכב) / (ערך חדירות של להכניס הריק - ערך חדירות ממוצע של קבוצת הרכב) X 100.

4. ויזואליזציה של תאים בממברנות נקבוביות

NT "> הערה: תאים בלא כתם על קרומים להוסיף קשים להתבונן בניגוד שלב או התערבות ההפרש לעומת זאת מיקרוסקופיה (DIC) מאז הקרום הוא די אטום ומפריע להעברת אור כדי להתמודד עם בעיה זו פיתחנו נהלי צביעה שונים של תאים ב. מוסיף, אשר מאוד לשפר את המראה של תא על הממברנה. באופן כללי, להכתים את הקרומים להכניס ועדיין מחובר להוספה, בבארות. הקרומים יש להסירם רק בסוף ההליך מכתים למטרות הרכבה.

4.1. Hematoxylin מכתים

1. תקן מוסיף 4% קרים כקרח (w / v) paraformaldehyde (PFA) ב פוספט בופר סליין (PBS; 130 mM NaCl, 10 מ"מ Na ₂ HPO _4, 10 מ"מ אא ₂ PO _4, pH 7.2) עבור 20 דקות. לשטוף פעם ב-PBS.
2. להטביע את הכנס בפתרון hematoxylin של 0.1% מאייר למשך 2 דקות.
3. לשטוף בעדינות את התוסף במים ברז (על ידי השריית את כל הפרטיםERT במים ברז וכוס המכילה pipetting בעדינות את המים העודפים). להעביר את הכנס לפתרון של סקוט במים ברז (2 גר '/ ל' NaHCO _3, 20 g / L MgSO ₄₎ ל~ 20 שניות עד שהצבע הכחול הרצוי מתפתח. שטוף את הכנס שוב במים ברז (סעיף 4.1.3). כתם eosin אופציונלי יכול להיות הציג כאן על ידי טבילה את הכנס ב1% פתרון eosin ל10 שניות ואחריו שטיפה במים ברז.
4. אוויר יבש הקרום להוסיף. באמצעות אזמל (חיתוך מסביב לקצה הקרום) להסיר את הקרום ולעגן אותה בשקופית זכוכית הדמיה בהירה שדה
   הערה: אם הרכבה בינוני di-N-butylphthalateinxylene (DPX) מנוצל לשטוף להכניס את עם 100% אתנול ואחריו קסילן לפני הסרת והתקנת הממברנה.

4.2. מיקרוסקופ האלקטרוני סורק (SEM)

1. תקן מוסיף 4% קרים כקרח (w / v) PFA ב PBS עבור 20min. לשטוף שלוש פעמים PBS.
2. פוסט לתקן את הקרומים ל30 דקות ב1% (w / vtetroxide אוסמיום) בMQH ₂ O.
3. שטוף מוסיף במים (סעיף 4.1.3) ולייבש בשיפוע הסלמת אתנול (50%, 70%, 90% במשך 5 דקות כל אחד, ולאחר מכן 3x עם אתנול 100% עבור 10 דקות להפסקה).
4. פנק מוסיף מיובש בתערובת של hexamethyldisilazane (HMDS): אתנול (1:2 אז 2:01 במשך 5 דקות).
5. פנק מוסיף עם HMDS 100% למשך 5 דקות, אוויר יבש ולאחסן בתנאים יבשים.
6. להסיר את הקרום באמצעות אזמל (חיתוך מסביב לקצה הקרום). לבחון קרומים ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים.

4.3. Immunofluorescence

1. תקן מוסיף 4% קרים כקרח (w / v) PFA ב PBS עבור 20 דקות, לשטוף פעם שבנאגר מלוח טריס (TBS; 50 מ"מ טריס-HCl pH 7.6, 154 mM NaCl, 0.22 מיקרומטר מסוננים).
2. בצע immunostaining של התאים על הקרום להוסיף כמתואר ²⁶ בעבר.
3. להסיר את הקרום באמצעות אזמל (חיתוך מסביב לקצה הקרום) ולעלות אותו על AGשקופית ילדה עם הרכבה בינונית הקרינה. בחן את הקרום על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תוצאות

כדי להקים אנושי, מודל BBB קשר שהיו לנו לטפח SVGs וBECs על ממברנות נקבוביות עם נקבובית בגודל 3 מיקרומטר, המוצג על מנת לאפשר מעבר של קצה רגליים astrocyte למגע עם תאי האנדותל ^14,15,27,28. ייצוג סכמטי של המודל ליצירת קשר המלא מתואר באיור 1 (משמאל איור). האתגר הטכני העיקרי שהוצג על ידי מערכת מגע הוא הצורך זרע האסטרוציטים כנגד כוח הכבידה על פני השטח abluminal של הממברנה. אנו מצליחים במשימה זו על ידי בעיקר יצירת סיליקון נשלף גם על גבי המשטח הממברנה abluminal ת...

דיון

מחקר רפואי לפתולוגיות מוח סובל קושי רב translational. באזור של שבץ איסכמי חריף, למשל, תרופות רבות אשר הראו הבטחה גדולה במודלים של בעלי חיים נכשלו במרפאת ^38,39. הסיבות לתוצאות מאכזבות אלה הן מגוונות וכוללות בגידה של מערכות בדיקה קליני לתרחיש שבץ אדם וההגזמה של תוצאות שהתקבלו ממחקרים בבעלי החיים ^21. אסטרטגיה אחת כדי לשפר את הערך המנבא של ממצאים קליניים אל השלב הקליני היא פיתוח נוסף של אדם במבחנת מודלים מבוסס תאים, אלה עשויים לספק כלים ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Attachment Factor	Cell-Systems Corporation	4Z0-210
תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח (BECs), ראשוניים, תאגיד מערכות תאים אנושי		ACBRI 376
Complete	medium Cell-Systems Corporation	4Z0-500	בתוספת CSC JetFuel
בינוני ללא סרום	תאגיד מערכות תאים	SF-4Z0-500	בתוספת CSC RocketFue
DMEM/F-12 עם 15 מ"מ HEPES	Life Technologies	11330-032
תוסף צמיחת תאי אנדותל (ממקור בקר)	Sigma-Aldrich	E2759-15MG
צינורות סיליקון חיצוניים	ווטסון-מרלו	913.A080.016	מותג Pumpsil, קוטר פנימי 8 מ"מ, סרום עגל עובר בקיר 1.6 מ"מ
	Lonza	14-501F
Gentamycin sulfate	Life Technologies	15750-060
הפרין נתרן	פייזר		1,000 U/ml
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma-Aldrich	H4875
תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח האנושי	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
צינורות סיליקון פנימיים	ווטסון-מרלו	913.A032.016	מותג Pumpsil, קוטר פנימי 3.2 מ"מ, דופן 1.6 מ"מ
L-Glutamine	Life Technologies	25030
Mayer' s תמיסת המטוקסילין	Amber Scientific	MH
מדיום חיוני מינימלי עם ארל' תמיסת מלח מאוזנת	HyClone Laboratories	SH30244.01
פניצילין/סטרפטומיצין	Life Technologies	15140
קולגן עכברוש I	Trevigen	3440-100-01	המותג Cultrex
מוסיף תרבית רקמות	Corning Life Sciences	3472	מותג Transwell, בקוטר 6.5 מ"מ, עם קרום נקבובי פוליאסטר, 3 ומיקרו; גודל נקבוביות m