דגם תרבות רקמות תלת ממדי למחקר עיקרי עצם אדם מח וממאיר שלו

Summary

בשיטות סטנדרטיות תרבות תאים נלקחים מתוך הסביבה הפיזיולוגית שלהם וגדלו על משטח הפלסטיק של מנה. כדי לחקור את התנהגותם של תאים במח עצם אנושיים ראשוניים שיצרנו מערכת תרבות 3-D בו תאים גדלים בתנאים משחזרים microenvironment יליד הרקמות.

Abstract

תרבית רקמה הייתה כלי רב ערך כדי ללמוד על היבטים רבים של תפקוד תא, מהתפתחות נורמלית למחלה. שיטות תרבות תאים רגילות להסתמך על היכולת של תאים או לצרף לתשתית מוצקה של צלחת תרבית רקמה או לגדול בתרחיף במדיום נוזלי. נוצרו שורות תאים אלמותיים מרובות וגדלו תוך שימוש בגישות אלה, עם זאת, שיטות אלה לעתים קרובות להיכשל כאשר תאים ראשוניים צריכים להיות מבוגרים vivo לשעבר. כישלון כזה יוחס להעדרם של רכיבי מטריצה ​​תאיים המתאימים של microenvironment הרקמה מהמערכות סטנדרטיות שבו פלסטיק תרבית רקמה משמש כמשטח לצמיחת תאים. מטריצה ​​תאית היא מרכיב בלתי נפרד של microenvironment הרקמות ונוכחותה היא חיונית לשמירה על תפקודים פיסיולוגיים כגון קיטוב תא, הישרדות, ושגשוגם. כאן אנו מציגים שיטת תרבית רקמה 3 ממדים שבו cel מוח עצם העיקריls גדלים במטריצה ​​תאית גובשה כדי לשחזר את microenvironment של עצמות אדם (מערכת RBM). משובץ במטריצה ​​תאית, תאים מסופקים עם חומרים מזינים דרך המדיום בתוספת פלזמה אנושית, ובכך לספק מערכת מקיפה שבו הישרדות תא ושגשוגם יכולים להתקיים לעד 30 ימים תוך שמירה על ההרכב התאי של הרקמות ראשוניות. שימוש במערכת RBM יש לנו גדלו בהצלחה תאי מח העצם עיקריים מתורמים רגילים וחולים עם עמילואידוזיס, ומחלות דם ממאירות שונות. מערכת RBM מאפשרת הדמיה ישירה, במטריצה ​​בזמן אמת של התנהגות התא וההערכה של יעילות קליני של תרופות חדשות. יתר על כן, ניתן לבודד תאים מRBM ולאחר מכן נעשה שימוש להשתלת in vivo, מיון תא, cytometry זרימה, וחומצות גרעין וניתוח חלבון. יחדיו, שיטת RBM מספקת מערכת אמינה לצמיחה של Marro עצם העיקריתאי w בתנאים פיסיולוגיים.

Introduction

תרבית רקמה פותחה כדי ללמוד על התנהגות תא בסביבה מבוקרת כדי למזער את ההשתנות המערכתית כאשר משווה תהליכים שונים באורגניזמים שלמים. שיטה זו הוקמה לראשונה ב 1900 ^1,2 המוקדם ומתייחסת לטכניקה שבה explants היה בתרבית הרקמה vivo לשעבר בצלחת זכוכית. באמצע שנתי ה 1900s-המערכת הותאמה לגדל תאים מפוזרים ולא שברי רקמות שלמות, ו'תרבית הרקמה 'התנאים ו'תרבית תאים' הפכו לשם נרדף ^3. במערכות תרבית תאים קונבנציונליות כגון תאים גדלים על פני השטח של הפלסטיק בתרבית רקמה ועליהן מדיום גידול בתוספת גורמי גדילה שונים. שני סוגים של תרבויות צמחו מבוססים על יכולת ההדבקה של תאים שונים: תרבית תאים חסיד, שבו תאים ל....

Protocol

1. הכנה מראש

1. שמור טפטפות סרולוגיות סטרילי וטיפים פיפטה ב 4 ° C.
   פתרון בעיות: ג'לי Matrigel בטמפרטורת חדר (RT); באמצעות טפטפות וטיפים קרים ימנע Matrigel מgelling במהלך הגדרת התרבות.
2. להפשיר בקבוק Matrigel על 4 מעלות צלזיוס למשך לילה.

2. הכנת ריאגנטים

1. הכנת פתרון מניות פיברונקטין: הפוך 1 מ"ג / מיליליטר ....

Results

מכיוון שתאי מח עצם העיקרי אינם מצליחים להתרבות בתנאי תרבית רקמה רגילים, מערכת RBM נוצרה כדי לחקות באופן הדוק microenvironment העצם, מתן מערכת לתרבות ולהרחיב את תאי BM vivo לשעבר. המרכיבים העיקריים של מטריצת BM תאית, פיברונקטין, קולגן I, קולגן IV, וlaminin ^21, שולבו מטריצת RBM לספק הפיגום המבני לתרבות 3-D. Endosteum, הממשק בין העצם וBM, עשיר בקולגן ופיברונקטין אני, שוחזר על ידי ציפוי פני השטח של צלחת תרבית רקמה עם חלבונים אלה. דיבור בין תאים סלולריים המרובים בתו.......

Discussion

דגם RBM מספק מערכת מקיפה שבו הרכב תאי של BM נשמר vivo לשעבר לתקופה של עד 30 ימים. תאי BM גדלו בRBM עצמי רבד פי הפונקציה שלהם מחקה את ארכיטקטורת BM מצאה in vivo בשיתוף פעולה הדוק. יתר על כן, זוהי המערכת הראשונה המאפשרת להרחבת שיבוט מיאלומה הנפוצה ^8. השלבים הקריטיים ביותר להבטחת הצמיחה החזקה של תאים בע"מ וההצלחה הכוללת של התרבות הם: 1) כדי לקבל אוכלוסייה בריאה של תאי BM עם כדאיות> 70% ובעיקר חופשי של תאי דם אדומים, 2) כדי להבטיח כי רכיבי המטריצה .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ערכת התפשטות CFSE של CellTrace - לזרימה ציטומטרית	Invitrogen/Life Technologies	C34554
פיברונקטין מפלזמה אנושית	Millipore	NG1884448
Ficoll-Paque PLUS	GE Lifesciences	17-1440-02
מטריצת ממברנת בסיס מטריג'ל	BD Biosciences	354234
קולגן זנב חולדה מסוג I	BD Biosciences	354249	קולגן I מבית Millipore אינו פולימריזציה כראוי באמצעות פרוטוקול זה
VECTASHIELD הרכבה מדיום לפלואורסצנטי (סט רגיל)	Vector Laboratories	H-1000
SigmaFast Red TR / Napthol AS-MX טבליות	Sigma-Aldrich	F4648	עבור TRAP צביעת
SigmaFast BCIP / NBT טבליות	Sigma-Aldrich	B5655	עבור צביעת פוספטאז אלקליין
מיקרוסקופ LSM 510 קונפוקלי Zeiss	תוכנת Carl Zeiss
Zeiss 510	Carl Zeiss		תוכנת ניתוח תמונה לניתוח קונפוקלי
Zeiss Axiovert 200M מיקרוסקופ הפוך	תוכנת Carl Zeiss
MetaMorph	מולקולריים		תוכנת ניתוח תמונה עבור Axiovert 200M
FACSort flow cytometer	תוכנת BD Biosciences
CellQuest Pro	תוכנת BD Biosciences	לניתוח נתוני זרימה ציטומטרית