מאמר שיטה

דגם תרבות רקמות תלת ממדי למחקר עיקרי עצם אדם מח וממאיר שלו

DOI:

10.3791/50947

⸱

8 במרץ 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Department of Oncology, University of Alberta, 3Cross Cancer Institute

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשיטות סטנדרטיות תרבות תאים נלקחים מתוך הסביבה הפיזיולוגית שלהם וגדלו על משטח הפלסטיק של מנה. כדי לחקור את התנהגותם של תאים במח עצם אנושיים ראשוניים שיצרנו מערכת תרבות 3-D בו תאים גדלים בתנאים משחזרים microenvironment יליד הרקמות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרבית רקמה הייתה כלי רב ערך כדי ללמוד על היבטים רבים של תפקוד תא, מהתפתחות נורמלית למחלה. שיטות תרבות תאים רגילות להסתמך על היכולת של תאים או לצרף לתשתית מוצקה של צלחת תרבית רקמה או לגדול בתרחיף במדיום נוזלי. נוצרו שורות תאים אלמותיים מרובות וגדלו תוך שימוש בגישות אלה, עם זאת, שיטות אלה לעתים קרובות להיכשל כאשר תאים ראשוניים צריכים להיות מבוגרים vivo לשעבר. כישלון כזה יוחס להעדרם של רכיבי מטריצה ​​תאיים המתאימים של microenvironment הרקמה מהמערכות סטנדרטיות שבו פלסטיק תרבית רקמה משמש כמשטח לצמיחת תאים. מטריצה ​​תאית היא מרכיב בלתי נפרד של microenvironment הרקמות ונוכחותה היא חיונית לשמירה על תפקודים פיסיולוגיים כגון קיטוב תא, הישרדות, ושגשוגם. כאן אנו מציגים שיטת תרבית רקמה 3 ממדים שבו cel מוח עצם העיקריls גדלים במטריצה ​​תאית גובשה כדי לשחזר את microenvironment של עצמות אדם (מערכת RBM). משובץ במטריצה ​​תאית, תאים מסופקים עם חומרים מזינים דרך המדיום בתוספת פלזמה אנושית, ובכך לספק מערכת מקיפה שבו הישרדות תא ושגשוגם יכולים להתקיים לעד 30 ימים תוך שמירה על ההרכב התאי של הרקמות ראשוניות. שימוש במערכת RBM יש לנו גדלו בהצלחה תאי מח העצם עיקריים מתורמים רגילים וחולים עם עמילואידוזיס, ומחלות דם ממאירות שונות. מערכת RBM מאפשרת הדמיה ישירה, במטריצה ​​בזמן אמת של התנהגות התא וההערכה של יעילות קליני של תרופות חדשות. יתר על כן, ניתן לבודד תאים מRBM ולאחר מכן נעשה שימוש להשתלת in vivo, מיון תא, cytometry זרימה, וחומצות גרעין וניתוח חלבון. יחדיו, שיטת RBM מספקת מערכת אמינה לצמיחה של Marro עצם העיקריתאי w בתנאים פיסיולוגיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרבית רקמה פותחה כדי ללמוד על התנהגות תא בסביבה מבוקרת כדי למזער את ההשתנות המערכתית כאשר משווה תהליכים שונים באורגניזמים שלמים. שיטה זו הוקמה לראשונה ב 1900 1,2 המוקדם ומתייחסת לטכניקה שבה explants היה בתרבית הרקמה vivo לשעבר בצלחת זכוכית. באמצע שנתי ה 1900s-המערכת הותאמה לגדל תאים מפוזרים ולא שברי רקמות שלמות, ו'תרבית הרקמה 'התנאים ו'תרבית תאים' הפכו לשם נרדף 3. במערכות תרבית תאים קונבנציונליות כגון תאים גדלים על פני השטח של הפלסטיק בתרבית רקמה ועליהן מדיום גידול בתוספת גורמי גדילה שונים. שני סוגים של תרבויות צמחו מבוססים על יכולת ההדבקה של תאים שונים: תרבית תאים חסיד, שבו תאים לצרף ולהפיץ על הפלסטיק בתרבית רקמה ותרבויות nonadherent, שבו תאים מופצים בהשעיה. מאז הימים הראשונים של תאנוצרו תרבות, שורות תאים אלמותיים מרובות, כגון 4 הלה, שורת תאי סרטן האנושיים הראשונה. יש שורות תאים אלה את היכולת להתרבות ללא הגבלת זמן בתרבית תאים, ורוב אינו דורשים כל טיפול מיוחד כדי לשמור על יכולת קיום.

הגישה הרדוקציוניסטית של שיטות תרבית תאים המקורית שנועדה לפשט את המערכת ככל האפשר על ידי כולל רק את רכיבי המינימום הנדרשים כדי לקיים את כדאיות תא ושגשוגם. עם זאת, גישות פשוטות תרבית תאים לא מצליחות לתמוך vivo לשעבר סוגים העיקריים ביותר תא אנושיים עם תוחלת חיים מוגבלת. לכן, מערכות התרבות חדשות שתוכננו משוערת microenvironment הרקמות, ככל שניתן, ובכך מאפשרות explants התא לגדול בתנאים פיסיולוגיים. בניגוד ל/ גישות קונבנציונליות הרדוקציוניסטית תרבית תאים, 3 ממדים (3-D) מערכות תרבות נמצאות כעת הופכות שיטה מועדפת ליעילות תרבות שונותשורות תאים אנושיות ותאים ראשוניים ללמוד לאחר מכן מנגנונים מעורבים במחלה ובריאות, בהקשר של microenvironment תומך. מערכות 3-D כאלה הן בדרך כלל הגדרה באמצעות מטריצות משוחזרות ו / או בינוני בתוספת גורמי גדילה, על מנת לשחזר את microenvironment הרקמות ללמוד סוגי תא של עניין. הראשון של דגמי תרבות 3 ממדים (3-D) אלה פותח כדי ללמוד התפתחות בלוטת החלב. כדי לספק את התאים עם תנאים מקומיים תאי אפיתל החלב היו משובצים בMatrigel, קולגן IV ומקור laminin עשיר של מטריצה ​​תאית (ECM), ועליהן מדיום גידול. בתנאים אלה, תאי אפיתל החלב נוצרו אשכולות דומים acini החלב, ועל גירוי עם הורמוני lactogenic, acini אלה מופרשים קזאין, וחלבונים חלב אחרים, לlumena החלול של המבנים דמוי acini. הפרשת קזאין לא נצפתה בתרבויות סטנדרטיות גם לאחר תוספת של פרולקטין 5, תוך שימת דגש על תפקידו של המיקרו בשמירה על המאפיינים מורפולוגיים ופנוטיפי של תאים נוספים. הפגנה נוספת של אובדן התפקוד תאי נורמלי כאשר תאי לקוחים מתוך ההקשר של microenvironment הפיזיולוגי שלהם היא הפגנה שללא microenvironment תומך, קרטינוציטים להיכשל כדי ליצור האפידרמיס מרובדת 6. מספר 3-D מודלים אחרים נוצר כדי לאפשר ריבוי vivo לשעבר של תאים ראשוניים 7,8.

התפקיד המכריע של microenvironment בהתנהגות תא הודגם אלגנטיות במחקר שבו תאי אפיתל החלב נוצרו acini "מבפנים החוצה" כאשר בתרבית בקולגן אני מטריקס, בהשוואה לacini המקוטב בצורה הנכונה שנוצרו בMatrigel. הפסד זה של מורפולוגיה התקינה היה חזר כאשר תאי myoepithelial ייצור laminin נוספו לקולגן I תרבויות 9. יתר על כן, microenvironment הנכון דרוש למדויקביטוי גנוטיפ. גדל בצלחת, תאי סרטן שד MCF7 transfected עם CEACAM1 מולקולת הידבקות תאי תאים מתנהגים בדיוק כמו התאים השליליים CEACAM untransfected. עם זאת, כאשר בתרבית בMatrigel, במגע עם ECM, מבנים כמו גידול בצורת MCF7 wildtype תוך MCF7 תאי transfected עם CEACAM1 לחזור לacini פנוטיפ והצורה נורמלי עם lumena החלול, כפי שכבר נקבעו באפיתל החלב nonmalignant 10. בדומה לכך, חסימה בתאי סרטן שד integrin-β1 אינו משנה את התנהגותם בתנאי תרבות סטנדרטיות, אבל על אותו הניסוי שבוצע בתרבויות 3-D מוכיח כי חסימת β1-integrin חוזרת תאים ממאירים לפנוטיפ נורמלי 11. לכן, microenvironment רקמות אינו נדרש רק כדי לשמור על כדאיות תא, אלא גם כדי לשמור על תפקוד תא תקין.

בנוסף לאספקת מערכת שבה התנהגות תא ניתן ללמוד בתנאים פיסיולוגייםים, תרבויות 3-D לתפקד מדיום חזק ואמין כמו לבדיקה קליני של הרפוי רומן 8,12,13. Culturing תאים ב 3-D מאפשר הקרנה של תרכובות investigational בתנאים של בתיווך סביבת סמים התנגדות 14, שבו התרומה של תאי תאים והידבקות התא-ECM יכולה להיות מוערכת. יתר על כן, רעילות מחוץ היעד של תרכובות חדשות ניתן לקביעה על ידי שילוב של תאים סלולריים שונים של רקמות שונות. ניתן לבצע מסכים כאלה במהירות רבה יותר ויותר יעיל וחסכוני יותר מהמחקרים דומים בvivo 8.

כאן אנו מציגים התקנה של 3-D מודל של מח עצם משוחזר (RBM) שבו תאי מח עצם נורמלי וממאירים (BM) להתרבות vivo לשעבר במערכת מחקה את microenvironment של BM האדם באופן הדוק. ניסיונות קודמים בגידול תאי BM אנושי ראשוניים בתרבויות 2-D, נוזל או cocultures חסיד עם רכיבים שונים של stroma BM, או 3-D, תרבויות אגר חצי מוצק נפגשו עם הצלחה מוגבלת בשל חוסר היכולת שלהם לספק את התאים עם הרכיבים של microenvironment הרקמה 15-18. במערכות אלה היו תאי BM עיקריים כדאיות עניות ולא הצליחו להתרבות vivo לשעבר. מערכת נוספת שבו תאי BM אדם גדלים בcocultures אליפטית עם תאי סטרומה BM היא מערכת 3-D בו כדאיות תא גזע hematopoietic ושגשוגם נשמרו במשך לפחות 96 שעה 19. עם זאת, למרות שמאוד מועיל להבנת הביולוגיה אבות היווצרות הדם, מערכת זו אינה נאמנות לשחזר את microenvironment של BM בשל היעדר רכיבי ECM, ולכן, מה שמגביל את השימושיות שלה. דגם RBM המתואר כאן מציג מערכת מקיפה שבו שני התאים סלולריים ותאיים של BM האדם משוחזרים במבחנה. אנו מראים כי תרבויות RBM יכולות לתמוך בצמיחת vivo לשעבר של תאים אנושיים BM רגילים, כפי שאנוll כמו תאים מבודדים מחולים עם הפרעות המטולוגיות שונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה מראש

  1. שמור טפטפות סרולוגיות סטרילי וטיפים פיפטה ב 4 ° C.
    פתרון בעיות: ג'לי Matrigel בטמפרטורת חדר (RT); באמצעות טפטפות וטיפים קרים ימנע Matrigel מgelling במהלך הגדרת התרבות.
  2. להפשיר בקבוק Matrigel על 4 מעלות צלזיוס למשך לילה.

2. הכנת ריאגנטים

  1. הכנת פתרון מניות פיברונקטין: הפוך 1 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות של פיברונקטין על ידי המסת פיברונקטין אדם 100 מ"ג במים מזוקקים 100 מיליליטר. ברגע שפיברונקטין נמס, פילטר סטרילי, aliquot, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
    פתרון בעיות: אם פיברונקטין אינו מתמוסס במהירות דגירה הפתרון לכמה דקות בסט אמבט מים ב 37 ° C.
  2. הכנה של 10x PBS: ממיסים 80 כלורי NaCl נתרן גרם, 14.4 גרם Na 2 HPO 4, KCl 2 גרם ו2.4 KH גרם 2 PO 4 ב1 ליטר של מים מזוקקים. הגדר את ה-pH 7.4, סינון סטרילי, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
  3. הכנה של חיץ נטרול 20: להפוך את תמיסה המכילה 100 HEPES מ"מ מלוחים 2x פוספט (PBS) באמצעות 1 M HEPES ו10x פתרונות מניות PBS. התאם את ה-pH של הפתרון ל7.0. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 חודשים.
  4. הכנת 2 פתרון מ"ג / מיליליטר של קולגן סוג זנב החולדה אני: הפוך 2 מ"ג / מיליליטר פתרון אני קולגן במאגר הנטרול (שלב 2.3). מערבולת הפתרון במהירות נמוכה ומערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה. קולגן זה צמיג מאוד, להימנע מדור של בועות אוויר תוך pipetting. מומלץ להכין לי פתרון קולגן טרי בכל פעם. שמור את הפתרון על קרח עד לשימוש.
  5. הכנת ציפוי endosteal (לקרוע): מערבבים 1 מ"ג / מיליליטר פיברונקטין המניה עם 2 מ"ג / מיליליטר קולגן אני המניה (שלבים 2.1 ו2.4) לריכוז סופי של 77 מיקרוגרם / מיליליטר ו29 מיקרוגרם / מ"ל ​​בהתאמה, ב1x &# 160; PBS סטרילית. לערבב ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד חודש 1.
  6. הכנת העצם מטריקס המשוחזר (RBM):
    1. 1.5 Precool מיליליטר microcentrifuge צינורות על קרח. שמור את כל פתרונות המטריצה ​​על קרח בכל העת.
    2. מערבבים 4 חלקים Matrigel (ריכוז Matrigel משתנה מהרבה להרבה, אבל הווריאציות נמצאו להיות זניח), 2.5 חלקים של 1 מ"ג / מיליליטר פיברונקטין וחלק 1 של 2 מ"ג / מיליליטר קולגן אני על קרח על ידי pipetting הראשון Matrigel לתוך הצינור באמצעות טיפים פיפטה קרים ולאחר מכן להוסיף פיברונקטין ואני קולגן Matrigel יתחיל חיזוק בטמפרטורות מעל 4 מעלות צלזיוס, כך שעובד במהירות תוך pipetting Matrigel. מערבבים את המטריצה ​​מאוד בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה, למנוע החדרת בועות. שמור צינורות על קרח תוך כדי ערבוב RBM.
  7. הכנה של מדיום מח עצם צמיחה (BMGM): הפוך 500 מיליליטר של BMGM מכיל 6.2 x 10 -4 M CaCl 2, 10 succinate נתרן -6 M, 10 -6 הידרוקורטיזון M, 20% פלזמה אנושית (ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין רגילים או ממאיר שנאסף מתורמים או מטופלים בריאים), בRPMI-1640. ניתן לאחסן CaCl 2, succinate נתרן, ותוספי הידרוקורטיזון ב-80 מעלות צלזיוס למשך> 6 חודשים כפתרונות מניות x 1,000. כאשר גידול שורות תאים, בסרום שור העובר (FBS) ניתן להחליף לפלזמה אנושית.
  8. הכנת פורמלין 10% הניטרלי שנאגרו (NBF): הוסף 37% מניות פתרון פורמלדהיד ל1X PBS ב10% v / נ מערבבים היטב ולאחסן בטמפרטורת חדר למשך 2-3 שבועות המוגנים מפני אור.
  9. אופן ההכנה של 1% אלבומין בסרום שור (BSA): לשקול כמות מתאימה של ארגון ה-BSA ולפזר אותו ב1x PBS. חנות ב 4 ° C ולהשתמש תוך שבוע 1. פתרון BSA נוטה לקבל מזוהם אם שמר בקירור לתקופות ארוכות יותר. לחלופין, פתרון BSA ניתן aliquoted והוקפא ב -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך. הימנע להקפיא להפשיר מחזורים.
  10. הכנת פתרון התאוששות תא (CRS): הפוך 5 מ"מ EDTA, vanadate נתרן 1 מ"מ (Na <פלואוריד הנתרן תת> 3 VO 4) ו1.5 מ"מ (פתרון NAF) ב 1x PBS. סינון סטרילי ולאחסן ב 4 ° C עד 6 חודשים.

3. תרבות 3-D גלום של תאי BM האדם nonmalignant ומאירה

  1. לטהר את התאים מונונוקלארים BM ראשוניים על ידי צנטריפוגה שיפוע Ficoll-הרובד לפי הוראות יצרן.
    שלב אופציונאלי: יכולים להיות מתויגים תאים עם diacetate 0.25 מיקרומטר carboxyfluorescein, succinimidyl אסתר (CFSE) לפי הוראות יצרן לעקוב התפשטות תאים לאורך כל תקופת התרבות.
    פתרון בעיות: אם תאים מתים לאחר צביעת CFSE, לכיל את כמות CFSE כריכוז תלוי בסוג התא; 0.25 מיקרומטר עובד היטב עבור תאים מונונוקלארים BM עיקריים.
  2. הוספת 65 μl של פתרון קורע לבאר כל צלחת תרבות טופלה רקמות 48 היטב. מורחים את הפתרון באופן שווה על מנת לכסות את כל פני השטח של היטב דגירה ל> 30דקות ב RT.
  3. הכן את ההשעיה התא בצפיפות של 0.5 x 10 6 תאים ב10 μl של 1x PBS לכל גם צלחת 48 היטב. בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר לערבב את ההשעיה התא עם מטריצה ​​של RBM 100 μl לכל טוב. מערבבים את התאים ומטריקס RBM ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה; למנוע החדרת בועות. שמור את תערובת תא / מטריצה ​​על קרח, כדי למנוע gelling של מטריקס.
    הערה: מערכת RBM היא להרחבה מלאה; להגדיר את המערכת בפורמט שאינם 48 היטב, להתאים את הכמויות של כל חומרים כימיים (מטריצות ובינוניות) המבוסס על פני השטח של הצלחת בשימוש. קנה מידה של מספר התאים להיות מצופה בהתאם.
  4. לשאוב לקרוע שנותר ומוסיף את תערובת תא / מטריצה ​​למרכז גם. במהירות, מורח את תערובת תא / מטריצה ​​על מנת לכסות את כל פני השטח של היטב באופן שווה. מניחים את הצלחת ל30-60 דקות ב37 מעלות צלזיוס, 5% תרבות חממת CO 2 רקמה כדי לאפשר את המטריצה ​​כדי לחזק. אין לנער או דיסturb הצלחת במהלך דגירה.
    פתרון בעיות: כדי למנוע חלוקה לא שווה של תאים בRBM, ומערבב היטב לפני ציפוי. מערבבים אחרי כל 5 גם ה מצופים להימנע מתאי שיקוע לחלק התחתון של הצינור. מצופים ברגע, תאים לא ישקעו לתחתית הבאר בשל שטח מתח במטריצה.
    פתרון בעיות: כדי למנוע חלוקה לא שווה של תאים בRBM, ומערבב היטב לפני ציפוי. מערבבים אחרי כל 5 גם ה מצופים להימנע מתאי שיקוע לחלק התחתון של הצינור. מצופים ברגע, תאים לא ישקעו לתחתית הבאר בשל שטח מתח במטריצה.
  5. Prewarm BMGM באמבט מים מוגדר 37 ° C.
  6. לאחר 30 דקות, בדוק שהמטריצה ​​יש להגדיר כראוי; זה יהיה בצורת ג'ל רך כמו שכבה שאינו זז בעת הצלחת מוטה. Overlay שכבת תאים / מטריצה ​​עם 1 מיליליטר של BMGM החם. כדי להימנע מקריעה של פיפטה מטריקס הבינוני מאוד בעדינות (מחלק טיפה אחר טיפה) באמצעותפיפטה סרולוגיות. הנח את תרבות RBM התאסף לתוך ° C 37, 5% חממת CO 2 רקמת תרבות ותרבות לתקופה הזמן הרצויה.
    הערה: כדאיות תא נשמר לפחות 30 ימים ללא שינוי בינוני, ואם נדרש שינוי בינוני רק לשנות 50% מבינוניים בכל פעם.
    שלב קריטי: זה חיוני כי המדיום הוא לא קר כמו טמפרטורה קרה עלולה להפריע מטריקס כבר נקבע. יש להיזהר שלא להשפריץ בינוני על גבי המטריצה ​​בזה עלול לשבור את שכבת המטריצה ​​הרכה.
    פתרון בעיות: אם כדאיות תא במערכת RBM היא נמוכות, צפיפות תאים תצטרך להיקבע באופן ניסיוני בעבודה עם תאים אחרים מאשר תאים חד גרעיניים עיקריים מaspirates BM. כאשר עובד עם שורות תאים, להקטין את המספר הסלולרי של פי 10, כמו שורות תאים הונצחו מתרבות מהר יותר מאשר תאים ראשוניים.

4. הדמיה "במטריצה"

  1. במיקרוסקופ אור
    1. תמונת התאים בתרבית באופן ישיר בRBM באמצעות שדה בהיר, התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC), confocal או כל טכניקות הדמיה אחרות המאפשרות הדמיה למרחקים ארוכים כמטריצה ​​היא כ 1 מ"מ עובי. השתמש בתכונת Z-המחסנית נגיש בהרבה של המיקרוסקופים לתמונה כל התרבות מלמעלה עד למטה.
  2. מכתים immunofluorescence
    טיפ: לקבלת פרוטוקול immunostaining מתחת להימנע aspirating פתרונות מכתים / כביסה, במקום להטות את הצלחת ולהסיר את הפתרונות באמצעות פיפטה.
    1. הסר את BMGM באמצעות פיפטה ולשטוף 2-3x עם 100 μl / לשטוף / היטב RT 1x PBS. ודא כי מספיק PBS משמש כדי לכסות את כל פני השטח של הבאר.
    2. תקן את התאים במטריצה ​​על ידי הוספת 100 μl / טוב (לצלחת 48 היטב) של 10% NBF 15 דקות ב RT. הסר NBF ולשטוף תאים פעמיים עם 100 μl / לשטוף / היטב RT 1x PBS.
      פתק: הימנע משימוש בNBF הקרה כפי שהוא עשוי נזל המטריצה.
    3. הסר PBS, להוסיף BSA 1% עבור שעה 1 ב RT או 4 ° C למשך הלילה כדי לחסום ספציפי מחייב של נוגדנים.
    4. הכן את פתרון נוגדן ראשוני בBSA 1% בדילול הנדרש. דילול ישתנה עבור כל נוגדן, בדוק עם היצרן או לכיל כדי לקבוע את ריכוז נוגדנים האופטימלי. הוספה 100 μl / טוב של פתרון נוגדן ראשוני ודגירה על פי הוראות היצרן.
      שלב קריטי: יש לבצע כל incubations מעורב נוגדנים מצומדות כדי fluorophores או צבעי ניאון בחושך.
    5. הסר פתרון נוגדן ראשוני ולשטוף 3x עם 1x PBS במשך 5 דקות.
    6. עבור מכתים immunofluorescence עקיף, דגירה עם נוגדנים משני מצומדת לבדיקת ניאון עבור שעה 1 ב RT. לדלל את הנוגדנים בBSA 1% בריכוז שהוצע על ידי היצרן.
    7. הסר את המשניפתרון ntibody ולשטוף 3x עם 1x PBS במשך 5 דקות.
      פתרון בעיות: כדי להימנע מרקע גבוה במהלך הדמיה, לכיל נוגדנים משני מצומדות fluorescently ולהשתמש בריכוז הנמוך ביותר המספק אות מספקת. אם רקע גבוה הוא עדיין בעיה, להגדיל את המספר ומשך צעדים לשטוף, או להשתמש בנוגדנים ראשוניים מצומדת באופן ישיר, ולדלג על שלב 4.2.6.
    8. כדי להכתים את הגרעינים להוסיף 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) פתרון מכתים גרעיני, בדילול שהוצע על ידי היצרן, ודגירה של 7-10 דקות ב RT.
    9. הסר פתרון מכתים גרעיני ולשטוף 2x עם 1x PBS במשך 5 דקות.
    10. הסר את PBS מהשטיפה האחרונה ולהוסיף טיפה של מדיום הרכבה (סט קבוע), על המדגם לשמר הקרינה. תמונה באמצעות הגדרות עירור / פליטה מתאימות במיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal.
      שים לב: הדמיה צריכה להיעשות בתוך 2 ימים של מכתיםכדי להימנע משפלה של מטריצה ​​ואובדן שלמות RBM ואובדן אות ניאון. אם לא צילמו באופן מיידי, יש לשמור דגימות מוכתמות ב 4 ° C, מוגן מפני אור, עד הדמיה.

5. בידוד של תאים מRBM

  1. הסר בינוני בעדינות מבלי להפריע את שכבת מטריקס. לא לשאוב.
  2. שטפו תאי 2X עם סטרילי 1X PBS. לא לשאוב.
  3. הוסף 0.5 מיליליטר של CRS קר כקרח היטב כל אחד ולהסיר את כל שכבת מטריקס יחד עם התאים, על ידי במרץ pipetting למעלה ולמטה. לאסוף את התאים, מטריקס, וCRS בצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge. מניחים על קרח.
  4. הוספת 0.5 מיליליטר CRS נוסף לאותו היטב ולאסוף את כל חומרים שנותרו. העבר לאותו הצינור microcentrifuge.
  5. מערבולת התערובת של תאים, מטריקס, וCRS ולדגור על קרח למשך 1 שעות. תאי ורטקס כל 15 דקות כדי להקל על שחרור מהמטריצה.
  6. בדוק את התערובת לאחר 1 שעות, ללא גושים נראים לעיןשל מטריצה ​​צריך להיות נוכח.
    פתרון בעיות: אם גושים של מטריצה ​​הם עדיין גלויים לאחר 1 שעות, תאי העברה / מטריצה ​​/ תערובת CRS לצינור גדול יותר, תוסיף 2-5 מיליליטר נוסף של CRS, ודגירה של 30-60 דקות נוספות.
  7. צנטריפוגה תאים בCRS ב1,000 סל"ד 5-10 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר של 1x PBS הקר.
  8. צנטריפוגה ב 1,000 סל"ד 5-10 דקות ולהסיר את supernatant. חזור על לשטוף PBS עוד פעם אחת.
  9. לשטוף PBS השני משלים את ההחלמה של תאים ממטריצה ​​ותאים מבודדים יכולה לשמש לכל יישומים במורד כגון בידוד DNA / RNA / חלבון, cytometry זרימה, in vivo השתלה, וכו '.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מכיוון שתאי מח עצם העיקרי אינם מצליחים להתרבות בתנאי תרבית רקמה רגילים, מערכת RBM נוצרה כדי לחקות באופן הדוק microenvironment העצם, מתן מערכת לתרבות ולהרחיב את תאי BM vivo לשעבר. המרכיבים העיקריים של מטריצת BM תאית, פיברונקטין, קולגן I, קולגן IV, וlaminin 21, שולבו מטריצת RBM לספק הפיגום המבני לתרבות 3-D. Endosteum, הממשק בין העצם וBM, עשיר בקולגן ופיברונקטין אני, שוחזר על ידי ציפוי פני השטח של צלחת תרבית רקמה עם חלבונים אלה. דיבור בין תאים סלולריים המרובים בתו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דגם RBM מספק מערכת מקיפה שבו הרכב תאי של BM נשמר vivo לשעבר לתקופה של עד 30 ימים. תאי BM גדלו בRBM עצמי רבד פי הפונקציה שלהם מחקה את ארכיטקטורת BM מצאה in vivo בשיתוף פעולה הדוק. יתר על כן, זוהי המערכת הראשונה המאפשרת להרחבת שיבוט מיאלומה הנפוצה 8. השלבים הקריטיים ביותר להבטחת הצמיחה החזקה של תאים בע"מ וההצלחה הכוללת של התרבות הם: 1) כדי לקבל אוכלוסייה בריאה של תאי BM עם כדאיות> 70% ובעיקר חופשי של תאי דם אדומים, 2) כדי להבטיח כי רכיבי המטריצה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שום אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות, המכון לאומי לסרטן (1R21CA141039), BD Biosciences מענק מחקר פרס, האגודה האמריקנית לסרטן המחקר המוסדי גרנט (IRG # 58-006-53), למרכז אוניברסיטת פרדו למלחמה בסרטן מחקר, והמכון הקנדי לבריאות מחקר והתכנית ליוזמות מחקר אלברטה סרטן הדירקטוריון. חבר הפרלמנט נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות, המכון לאומי לסרטן, תכנית למניעת סרטן התמחות (R25CA128770; PI: ד טיגרדן) מנוהל על ידי המרכז למדעי אונקולוגית ומרכז המחקר למידה הגילוי באוניברסיטת פרדו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת התפשטות CFSE של CellTrace - לזרימה ציטומטריתInvitrogen/Life TechnologiesC34554
פיברונקטין מפלזמה אנושיתMilliporeNG1884448
Ficoll-Paque PLUSGE Lifesciences17-1440-02
מטריצת ממברנת בסיס מטריג'לBD Biosciences354234
קולגן זנב חולדה מסוג IBD Biosciences354249קולגן I מבית Millipore אינו פולימריזציה כראוי באמצעות פרוטוקול זה
VECTASHIELD הרכבה מדיום לפלואורסצנטי (סט רגיל)Vector LaboratoriesH-1000
SigmaFast Red TR / Napthol AS-MX טבליותSigma-AldrichF4648עבור TRAP צביעת
SigmaFast BCIP / NBT טבליותSigma-AldrichB5655עבור צביעת פוספטאז אלקליין
מיקרוסקופ LSM 510 קונפוקלי Zeiss תוכנת Carl Zeiss
Zeiss 510Carl Zeissתוכנת ניתוח תמונה לניתוח קונפוקלי
Zeiss Axiovert 200M מיקרוסקופ הפוך תוכנת Carl Zeiss
MetaMorphמולקולרייםתוכנת ניתוח תמונה עבור Axiovert 200M
FACSort flow cytometer תוכנת BD Biosciences
CellQuest Pro תוכנת BD Biosciencesלניתוח נתוני זרימה ציטומטרית
מכשירים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carrel, A. On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism. J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).
  2. Harrison, R. G. Observations on the living developing nerve fiber. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4, 140-143 (1907).
  3. Earle, W. R. Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. J. Natl. Cancer Inst. 4, 165-212 (1943).
  4. Gey, G. O., Coffman, W. D., Kubicek, M. T. Tissue Culture Studies of the Proliferative Capacity of Cervical Carcinoma and Normal Epithelium. Cancer Res. 12, 264-265 (1952).
  5. Barcelloshoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional-Differentiation and Alveolar Morphogenesis of Primary Mammary Cultures on Reconstituted Basement-Membrane. Development. 105, 223-227 (1989).
  6. Lamb, R., Ambler, C. A. Keratinocytes propagated in serum-free, feeder-free culture conditions fail to form stratified epidermis in a reconstituted skin model. PloS One. 8, (2013).
  7. Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q. Z., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro model for studying oral cancer cell invasion. Int. J. Exp. Pathol. 86, 365-374 (2005).
  8. Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
  9. Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. J. Cell Sci. 115, 39-50 (2002).
  10. Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 100, 521-526 (2003).
  11. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
  12. Gunn, E. J., et al. The natural products parthenolide and andrographolide exhibit anti-cancer stem cell activity in multiple myeloma. Leukemia Lymphoma. 52, 1085-1097 (2011).
  13. Hsiao, A. Y., et al. 384 hanging drop arrays give excellent Z-factors and allow versatile formation of co-culture spheroids. Biotechnol. Bioeng. 109, 1293-1304 (2012).
  14. Meads, M. B., Gatenby, R. A., Dalton, W. S. Environment-mediated drug resistance: a major contributor to minimal residual disease. Nat. Rev. Cancer. 9, 665-674 (2009).
  15. Golde, D. W., Cline, M. J. Growth of Human Bone-Marrow in Liquid Culture. Blood. 41, 45-57 (1973).
  16. Gartner, S., Kaplan, H. S. Long-Term Culture of Human-Bone Marrow-Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. Biol. 77, 4756-4759 (1980).
  17. Caligaris-Cappio, F., et al. Role of bone marrow stromal cells in the growth of human multiple myeloma. Blood. 77, 2688-2693 (1991).
  18. Pike, B. L., Robinson, W. A. Human bone marrow colony growth in agar-gel. J. Cell. Physiol. 76, 77-84 (1970).
  19. Bug, G., et al. Rho family small GTPases control migration of hematopoietic progenitor cells into multicellular spheroids of bone marrow stroma cells. J. Leukocyte Biol. 72, 837-845 (2002).
  20. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, (2006).
  21. Tancred, T. M., Belch, A. R., Reiman, T., Pilarski, L. M., Kirshner, J. Altered Expression of Fibronectin and Collagens I and IV in Multiple Myeloma and Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance. J. Histochem. Cytochem. 57, 239-247 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים