מאמר שיטה

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

19.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50951

⸱

19 בספטמבר 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Neurology, Hertie Institute for Clinical Brain Research, 2Institute of Pharmacology, University of Bern, 3Department of Immunology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 4Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Clinic Tuebingen, 5Department of Neurology, University Hospital Erlangen

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מפרט שיטה לבודד תאי המציגים אנטיגנים מבלוטת התימוס אנושית דרך שלבים שונים של עיכול אנזימטי של הרקמה ואחריו צנטריפוגה צפיפות של ההשעיה התא בודדת ומיון לבסוף מגנטי ו / או FACS של אוכלוסיות התאים של עניין.

תקציר

בפרוטוקול זה אנו מספקים שיטה לבודד תאים דנדריטים (DC) ותאי אפיתל (TEC) מבלוטת התימוס האנושית. DC וTEC הם תא אנטיגן הצגה הגדול סוגים (APC) נמצאו בבלוטת התימוס נורמלית והיא מבוססת היטב כי הם ממלאים תפקידים שונים במהלך בחירה הרתי. תאים אלה הם נקודתיים במייקר ברור בבלוטת התימוס וכל סוג APC מפצה אוכלוסייה קלה בלבד של תאים. כדי להבין את הביולוגיה של סוגים אלה של תאים נוספים, אפיון של אוכלוסיות תאים אלה רצוי מאוד אך בשל התדירות הנמוכה שלהם, בידוד של כל אחד מסוגי התאים דורש הליך יעיל ושחזור. פרוטוקול זה מפרט שיטה להשיג תאים מתאימים לאפיון של תכונות סלולריות מגוונות. רקמה הרתי מופרת באופן מכאני ולאחר שלבים שונים של עיכול אנזימטי, ההשעיה תא וכתוצאה מכך הוא מועשר באמצעות צעד צנטריפוגה צפיפות Percoll. לבידודה של מיאלואידית DC (CD11c <sup> +), תאים מהשבר בצפיפות נמוכה (LDF) הם immunoselected ידי מיון תא מגנטי. העשרה של אוכלוסיות TEC (mTEC, cTEC) מושגת על ידי דלדול של תאי hematopoietic (היי CD45) מחלק תא Percoll בצפיפות נמוכה המאפשר הבידוד הבא שלהם באמצעות תא קרינה המופעל מיון (FACS) באמצעות סמני תא ספציפיים. התאים מבודדים יכולים לשמש ליישומים במורד הזרם שונים.

מבוא

התימוס הוא האיבר שבו התפתחות תא T מתרחש. גודלו היחסי והמוחלט שלה יורד עם גיל, כאשר הוא הופך להיות מוחלף ברציפות על ידי שומן למרות פעילות הרתי עדיין יכולה להתגלות בגיל המבוגר. חשיבותו לתגובה החיסונית הודגמה בתחילת 1960s 1.

רפרטואר תא T מעוצב באמצעות האינטראקציה של קולטני תא T עם מתחמי פפטיד-MHC על סוגים שונים של APC הרתי, המספקים רמזי הישרדות או מוות לפיתוח תאי T, וכתוצאה מרפרטואר תא T פונקציונלי ובעיקר עצמי סובלני 2.

כ 98% מהתאים בבלוטת התימוס האנושי מתפתחים תאי T המכונים thymocytes. 2% הנותרים מורכבים מכמה סוגי תאים שונים, כוללים מגוון רחב של TEC (קליפת המוח, מדולרית, subcapsular), מיאלואידית וDC plasmacytoid (MDC, PDC), מקרופאגים, תאי B, תאי T מחדש במחזור בוגר, גרנולוציטים של, וibroblasts, תאי אנדותל ותאי אפיתל נדירים מאוד עם פנוטיפ ביטוי דומה לזה של תאים מרקמות אחרות כגון שרירים, תאי עצב והאפיתל בדרכי הנשימה (איור 1). מתוכם, TEC ו DC הם סוגי APC העיקריים שנמצאו בבלוטת התימוס נורמלית. בשנים האחרונות, טיהור של סוגי APC הללו לתרבות ולאפיון מולקולרי צברה יותר ויותר עניין. בשל התדירות הנמוכה שלהם, בידוד של כל אחד מסוגי התאים אלה לניתוח מפורט דורש הליך יעיל, לשחזור וחסכוני. השיטה המוצגת כאן היא שינוי ממחקרים שפורסמו בעבר 3,4.

כמו בכל רקמה אחרת, מיצוי תאים מבלוטת התימוס יכול להיות מושגת על ידי אנזימי disaggregating תאי תאים ורשתות אינטראקציה תאי מטריקס, על מנת לקבל השעיה של תאים בודדים. ישנם פרמטרים מסוימים כמו יעילות דיסוציאציה טובה, תשואת תא, כדאיות תא ושמירה של תא יםסמני urface כי הם קריטיים וצריכים להיות מותאמים לבידוד המוצלח של אוכלוסיות תאים נדירות אלה.

בפרוטוקול זה, בידוד של DC ותת TEC מבוצע על ידי ביצוע השעיה תא בודד של הרקמה על ידי הפרעה מכאנית ועיכול אנזימטי. אנו משתמשים Collagenase מClostridium histolyticum, שבו יש יחס מאוזן של פעילות אנזים שונה, כדי לשבור את קולגן המקומי שמחזיק את הרקמה יחד. אני DNase כלול בפתרון האנזים כדי להפחית צבירת תא בשל DNA החופשי מהתאים מתים (thymocytes רגיש מאוד). כמו כן אנו מספקים גישה חלופית לעיכול הרקמה האנזימטית הטיפוסי מעורב טיפול רקמות מכאני והאנזימטית בסיוע Dissociator רקמות. ההשעיה התא בודדת נתונה אז צנטריפוגה צפיפות Percoll יחידה להעשרת חלק בצפיפות הנמוכה (LDF) של תאים. מחלק זה של תאים, יכול להיות מבודד DC על ידי צביעה ואו סמני DC-פני השטח (כלומר + CD11c) ושימוש בהפרדה מגנטית או תא הקרינה המופעל מיון (FACS). בניגוד לתאי הלימפה המהווים את הרוב המכריע של תאים בבלוטת התימוס, TEC אינו מבטא CD45 ברמות גבוהות, אבל הם חיוביים לEpCAM מולקולת הידבקות תא אפיתל. ניתן להבחין cTEC מTEC מהדולרי על ידי הביטוי של אנטיגן עדיין לא מוגדר שהוכר על ידי CDR-2 נוגדנים (קליפת המוח הדנדריטים reticulocyte-2) 4,5 וביטוי EpCAM נמוך במקצת. ההפרש שיתוף הביטוי של EpCAM וCDR2 מאפשר הבידוד יעיל של תת TEC אלה באמצעות סלולריים במהירות גבוהה מיון 6.

הפרוטוקול המובא כאן הוא מותאם לרקמה הרתי אנושית. משך ההליך תלוי בכמות הרקמה וביכולת של הנסיין, כמו גם את המהירות של סדרן התא, אם נעשה שימוש FACS מיון. בדרך כלל, הפרוטוקול לבידוד של DC יכול להסתיים בתוך 5שעה -6 ועבור הבידוד של TEC ב8-10 שעה. הבידוד של DC ותת TEC מרקמות הרתי הוא זמן רגיש. מהר הליך הבידוד, טוב יותר את מצבו של התאים. לבסוף, התאים מבודדים יכולים לשמש לחקירות נוספות כמו מחקרים השוואתיים של mRNA וביטוי חלבונים, ניסויי PCR, בידוד חלבון, פרופיל מולקולרי (כלומר transcriptomics, ניתוח RNA מיקרו), כמו גם תא תרבות 6.

הצהרת אתיקה

על מנת להיות מסוגל לעבוד עם רקמת התימוס אנושית החוקר צריך לקבל אישור מוועדת האתיקה המקומית או הרשויות אחראים, כמו גם הסכמה מדעת בכתב של התורם (או בדרך כלל הורים שלו או שלה, שכן רקמה בדרך כלל מתקבלת מקטינים ילדים). יתר על כן, יש לטפל בכל הרקמות האנושיות כאמצעי שעלול להיות מדבק ומתאים יש לנקוט, כגון עבודה עם כפפות, וכו '.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת כלים, פתרונות אנזים, וחוצצים

בצע את השלבים הבאים preparative לפני תחילת הפרוטוקול.

  1. כלי עבודה
    חיטוי נקי, יבש ואת הכלים הבאים ולשמור אותם באריזה סטרילית עד לשימוש.
    1. מספריים חדים קטנים עם טיפים או מעוקלים או ישר לחיתוך רקמת התימוס. מלקחיים מעוקלים קטנים עם טיפים משוננים לטיפול ברקמות.
    2. 50 מיליליטר Oak Ridge צינורות צנטריפוגה, PC, לצעד צנטריפוגה Percoll בצפיפות.
  2. פתרונות אנזים
    הכן את Collagenase / DNase אני אנזים לערבב (2 Collagenase מ"ג / מיליליטר ו0.1 DNase אני / מיליליטר מ"ג) באופן הבא:
    1. ממיסים 500 מ"ג lyophilized Collagenase (רוש) ב250 מיליליטר של מישור RPMI 1640 (אין FCS) כדי להשיג פתרון 2 מ"ג / מיליליטר Collagenase. Collagenase הוא די קשה לפירוק, ולכן מומלץ להשאיר אותו קצת זמן על רולר-ייקר ב RT.
    2. ממיסים 100 DNase מ"ג אני (רוש) ב10 מיליליטר של מים מזוקקים סטריליים. ניתן לאחסן 2.5 aliquots מיליליטר ב -20 ° C. הוסף 2.5 מיליליטר שלי DNase הפתרון 10 מ"ג בפתרון 2 מ"ג Collagenase.
    3. סינון סטרילי תמהיל Collagenase / DNase באמצעות יחידת Stericup מסנן (0.22 מיקרומטר). חנות ב10-20 מיליליטר aliquots ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  3. מאגרים ופתרונות
    1. 1.5 פתרון מניות M NaCl: ממיסים NaCl במים סטריליים מזוקקים לריכוז סופי של 1.5 מ 'סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב RT.
    2. חיץ MACS 10x: 1x PBS (Ca 2 + / Mg 2 + ללא) המכיל BSA 5% ו20 mM EDTA. סינון סטרילי הפתרון עם מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 ° C. לפני השימוש להכין פתרון 1x על ידי דילול המניות 10x ל1x ב1x PBS סטרילי הקר.
    3. FACS הצפת: 1x PBS (Ca 2 + / Mg 2 + ללא) המכיל 1% BSA ו0.02% NaN 3.
    4. FACS הצפת למיון תא: 1x PBS (Ca 2 + / Mg 2 + ללא) המכיל BSA 2%. לעקר באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 ° C.

2. הכנה של רקמות

העיבוד של הרקמה צריכה להתבצע באמצעות ריאגנטים סטרילי ועבודה בזרימה למינרית. לפני ההליך מתחיל, להכין את חומרים כימיים וציוד הבאים:

    1. לחמם את הפעולות הבאות כדי RT: מדיום 1640 RPMI מלאים (RPMI 1640, 10% עגל בסרום עוברי, 1% עט / סטרפטוקוקוס), RPMI 1640 רגילים, Ca 2 + / Mg 2 PBS + ללא ופתרון אנזים Collagenase / DNase 2x.
    2. חממה תרמית חמה עם יחידת סיבוב 37 ° C ו צנטריפוגות הרוטור מגניב זווית קבועה עד 4 ° C.
    3. הכן את קופסא עם קרח.

הערה: משך הזמן של שלב זה תלוי במצב ואת הגודל של הרקמה. כ 20-30 דקות היא זמן סביר דרושה לפיסת ti גודל בינוניssue במצב טוב (~ 5 ס"מ רוחב).

  1. הנח רקמות בצלחת פטרי המכילה PBS סטרילית ולשטוף את כל דם שיורית.
    1. הוסף PBS הטרי כדי למנוע רקמות מייבוש ובאמצעות מלקחיים ומספריים לנקות את הרקמה מקרישי דם, רקמת חיבור ושומן וכל חלק שלא נראה בריא.
    2. תשמור על עצמך כדי להסיר רקמת נמקים כי תגדיל את כמות הפסולת.
    3. לאחר הניקוי, לשקול רקמות להתייחסות.
    4. חותכים את הרקמה בכ 1 סנטימטר 3 חתיכות / גושים. להוסיף PBS מספיק כדי לכסות את הרקמה.

הערה: שחזור של תוצאות, רקמה יש לחתוך לחתיכות בגודל אחיד.

  1. שימוש בחלק האחורי של מזרק סטרילי (10-20 מיליליטר) להפעיל לחץ (לא נמרץ או ממושך מדי) על גבי פיסות רקמה הרתי. הליך זה יסיר את חלק הארי של thymocytes, וכך להקטין את נפח הרקמה להתעכל מאוחר יותר. לבצע שלב זה על קרח ולעבוד מהר.
  2. הפתרון יהיה מעונן בעליל כthymocytes הם שוחררו. מערבבים את התבשיל בעדינות ולאחר מכן בעזרת פיפטה 5 מיליליטר או aspirator זכוכית להסיר את supernatant המכיל thymocytes נזהר שלא לשאוב את חתיכות הרקמה בטעות.

טיפ: מגרד תרבית תאים סטריליים יכול לשמש כדי לרכז את כל פיסות הרקמה בצד אחד של הצלחת ואז להטות את הצלחת (זווית ° 45) ולשאוב supernatant. החלף עם PBS הטרי ולחזור על הליך זה עד supernatant הוא יחסית שקוף. לבצע שטיפה האחרונה עם מישור RPMI.

  1. ברר בפיסות רקמות באמצעות מספריים חדים (כדק ככל האפשר, שברים צריכים להיות לפחות 2-4 מ"מ). הברים צריכים להיות קטנים מספיק כדי להיכנס פיפטה 5 מ"ל.

3. הכנת תרחיף תא בודד מרקמות קורנית

כאן,שתי גישות חלופיות לצעד זה מתוארים. הגישה הראשונה מתארת ​​עיכול אופייני האנזימטית רקמה (סעיף 3.1) ואילו השנייה כרוכה בטיפול ברקמה מכאנית והאנזימטית בסיוע Dissociator רקמה (סעיף 3.2).

פרוטוקול זה הוא מותאם לעיבוד דגימות רקמה במשקל של 5 גרם. לדגימות רקמה גדולות יותר או קטנות יותר, להתאים כמויות אנזים בהתאם.

3.1 עיכול רקמה האנזימטית אופייני לקבל השעיה תא בודדת

  1. הנח רקמת חיה ל50 מיליליטר צינורות עם פתרון 10 collagenase מיליליטר / DNase לכל 5 גרם של רקמה. הוספה רגיל RPMI לתת נפח כולל של 20 מיליליטר.

הערה: בצינור 50 מיליליטר לעכל עד 10 גרם של רקמה. התאם אנזים נפח בהתאם.

  1. דגירה ההשעיה הרקמות ל40 דקות ב 37 מעלות צלזיוס תחת סיבוב איטי בחממה תרמית.

הערה: ניתן לבצע את שלבי הדגירה או בחממה תרמית עם יחידת סיבוב, או בחממה חיידקי 37 ° C עם שייקר.

  1. פתרון האנזים יהפוך מעונן כמו תאים משתחררים לתוכה. בסופו של תהליך העיכול, צינור צנטריפוגות ב XG 110 למשך 2 דקות למשקעים שברי רקמה.
  2. איסוף supernatant מסיבוב עיכול זה. גלולה ההשעיה התא 10 דקות ב 400 x גרם. לשאוב supernatant ותאי resuspend ב 10-50 מיליליטר של שלם RPMI תלוי בגודל של התא גלולה.
  3. שמור על השעיה תא ב37 חממת מעלות צלזיוס עם הכובע רופף.
  4. אם מספרי תא גדולים יותר הם רצויים, ניתן לחזור על צעד העיכול עם שברי רקמה שנותרו והראשון ולעכל שני ונקווה. כמו כן, אם TEC צריך להיות מבודד, שני סבבים של digestions צריכים להתבצע.
  5. מדולל aliquot של ההשעיה התא בtrypan הכחול (1:10-1:100) ולספור תאי קיימא באמצעות hemocytometer.
  6. שמור את התאים על 37 מעלות צלזיוס בחממה עד מוכן להמשיך לצנטריפוגה Percoll הצפיפות (סעיף 4). הבידוד הבא של תת DC (סעיף 5) יבוצע מהתאים אלה.

הערה: רקמות הרתי יכולות להשתנות בהרכב שלהם, במיוחד עם גיל, מה שמשפיע על יעילות עיכול ואת הדור של השעיה תא בודד.

  1. לבידוד הבא של תאי אפיתל הרתי (TEC) נדרש סיבוב של עיכול אנזימטי שלישי. שרידי רקמת resuspend ב 10 מיליליטר של תמיסת Collagenase / DNase טרי בתוספת 10 מיליליטר של RPMI רגיל ולהוסיף טריפסין / EDTA (מניית 01:50 מ2.5%) בפתרון.
  2. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך דקות 40 עם סיבוב עדין. במהלך 10 האחרונות - 15 דקות של הדגירה להוסיף FCS (1:5) כדי לנטרל את הפעילות של טריפסין.
  3. צנטריפוגה ב110 XG במשך 2 דקות ב RT למשקעי שברי הרקמה.

g> הערה: הרקמות לא יכולות להתעכל לחלוטין לאחר שלושת סיבובים של digestions אלה. גיל ומצבו הכללי של הרקמות הם שני פרמטרים המשפיעים על יעילות הניתוק של רקמת התימוס.

  1. לאסוף את supernatant התא וזורקים את שברי רקמת משקעים.
  2. צנטריפוגה supernatant התא XG 400 10 דקות. לשאוב supernatant ו resuspend תא גלולה בשלם RPMI.

טיפ: כדורים סלולריים הם די רופפים, אז לטפל בעת השלכת / aspirating supernatant.

  1. ספירת תאי קיימא באמצעות hemocytometer. מניחים את התאים בחממה 37 מעלות צלזיוס עד שתמשיך לPercoll הפרדה (סעיף 4). טרום העשרה עוקבת של תאי TEC ידי דלדול של תאים היי CD45 תבוצע מהתאים אלה (סעיף 6).

3.2 טיפול רקמות מכאני והאנזימטית בסיוע Dissociator רקמה

ass = "jove_content"> שימוש ברקמה Dissociator מתקרבת, ניתן להפחית את צעדי עיכול רקמה למחצית מהזמן דרוש לגישה שתוארה לעיל (סעיף 3.1). הפרוטוקול הבא הוא גרסה שונה של שנהג לנתק את רקמת בלוטת התימוס עכבר לבידודה של TEC 7,8.

  1. העברה 5 גרם של חתיכות טחונות רקמות (שלב 2.5) לתוך צינור C מכיל 10 מיליליטר של תמיסת Collagenase / DNase.
  2. להתאים צינור C על Dissociator הרקמות וm_spleen_02 תכנית הריצה (10 שניות). חזור על תכנית זו 4-5x (40-50 שניות).
  3. דגירה עם סיבוב עדין ל20 דקות ב 37 ° C.
  4. צנטריפוגה ב110 XG במשך 2 דקות ב RT.
  5. איסוף supernatant והמשך כמו בשלב 3.1.4. הוסף 10 מיליליטר של תמיסת Collagenase / DNase טרי.
  6. להתאים צינור C על Dissociator הרקמות וm_spleen_01 תכנית הריצה (56 שניות).
  7. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות עם סיבוב עדין.
  8. צנטריפוגה ב110 XG במשך 2 דקות ב RT.
  9. אוסףsupernatant תא T וגלול את ההשעיה תא 10 דקות ב 400 x גרם. המשך כמו בשלב 3.1.4.
  10. כפי שתואר ב3.1.9 סיבוב של מערכת העיכול שלישי נחוץ לבידוד הבא של תאי אפיתל הרתי (TEC). לשם כך, שרידי רקמת resuspend ב 10 מיליליטר של תמיסת Collagenase / DNase טרי בתוספת טריפסין / EDTA (01:50 דילול של מניות 2.5%)
  11. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך עוד דקות 20 עם סיבוב עדין. הוספת FCS (1:5) ו דגירה של יותר 10 דקות.

שים לב: שימוש בגישה זו, לאחר העיכול אחרון זה צעד הרקמות בדרך כלל מנותקת לחלוטין ואין שברי רקמות מעוכלים הם נצפו.

  1. המשך כמו בשלבים 3.1.11-3.1.14.

4. העשרת LDF של תאים באמצעות הפרדת Percoll צפיפות

לאחר עיכול אנזימטי של הרקמות, הכוללת השעיות תא בודדות הרתי חשופים לcentrifugat צפיפות Percoll אחתצעד יון להעשיר לתאי LDF. LDF של תאים מועשר לAPC. DC וTEC שניהם זוהו בחלק זה של תאים.

  1. השתמש השעיה תא בודדת המתקבלת מst 1 ו 2 nd מעכל לבידוד MDC (תאים נקוו, ראה צעד 3.1.8) או 3 rd לעכל (לבידוד TEC) (3.1.14). השעיה צנטריפוגה תא בודדת המתקבלת מכל אחד משלבי העיכול ב XG 400 10 דקות.
  2. הכן פתרון Percoll עם צפיפות סופית של 1.07 גר '/ מיליליטר במהלך שלב זה לשטוף (ראה דוגמא בטבלה שלהלן).
    הכנת פתרון Percoll לצפיפות סופית של 1.07 גר '/ מיליליטר (ρ = 1.07)
    מס 'צינור 1 2 3 4
    חי Percoll (ρ = 1.130) (מיליליטר) 2.96 5.92 8.88 11.84
    1.5 M NaCl (מיליליטר) 0.6 1.20 1.8 2.4
    מזוקקי H 2 O (מיליליטר) 2.44 4.88 7.32 9.76
    היקף דילול עבודה סופי 6 מיליליטר 12 מיליליטר 18 מיליליטר 24 מיליליטר
  3. מספר צינורות Percoll תלוי במספרים הסלולריים שנקבעו בשלבי 3.1.8 ו / או 3.1.14. לשלב את פתרונות סטרילי ומערבבים היטב. לבידוד אופטימלי, ניתן לטעון 0.6-1 x 10 9 תאים לכל צינור של Percoll. לשלב את פתרונות סטרילי ומערבבים היטב.

טיפ: Percoll הוא רגיש לאור ובנוסף הוא צריך להיות כל הזמן קר. הכן ראשון התערובת המכילה NaCl ו-H 2 O (RT) ולהוסיף Percoll חי אחרון, ממש לפני resuspending התאים בפתרון Percoll.

אוהל "> הערה: צפיפות Percoll עשויה להשתנות בין ספקים וקבוצות שונים אם הצפיפות של פתרון Percoll חי אינה שווה ל1.130 גר '/ מיליליטר, השתמש בהוראות המסופקות על ידי היצרן כדי לחשב את סכומי Percoll ו-H 2 O המדויקים נדרש כדי לקבל צפיפות סופית של 1.07 גר '/ מיליליטר.

  1. Resuspend עד 1 x 10 9 תאים ב6 מיליליטר של הפתרון מוכן Percoll (ρ = 1.07), לערבב במידה מספקת כדי לקבל השעיה הומוגנית, ולהעביר צינור צנטריפוגות כובע בורג פוליקרבונט 50 מיליליטר Oak Ridge.
  2. שכבת זהירות 30 מיליליטר של RPMI מלא לכל צינור עם טפטפת על גבי ההשעיה פתרון Percoll / תא. טען את המדיום באיטיות, כך שהוא נשאר בחלק העליון של ההשעיה ודואג שלא להפריע את השכבה.
  3. לשקול את הצינורות כדי לוודא שיש להם משקל שווה, כך שהם מאוזנים במהלך צנטריפוגה. אם הם לא, בזהירות להוסיף עוד מדיום לצינור הקל יותר (מתחת stתנאי erile).
  4. בזהירות להעביר את הצינורות לצנטריפוגה מקוררת מראש עם הרוטור קבוע זווית, ואת ספין ב3,500 XG במשך 35 דקות, בשעה 4 ° C עם הבלם משם. ודא שהטמפרטורה של צנטריפוגות בגבוהה יותר מאשר 4 ° C. לא
  5. הסר את הצינורות מצנטריפוגות ובזהירות לאסוף את APC המועשר, שנמצא בשלבי ביניים בין Percoll ובינוני (חלק בצפיפות נמוכה) מכל צינור באמצעות פיפטה פסטר סטרילי. העברת תאים לתוך צינור 50 מיליליטר המכיל מלא RPMI קר. מלא את הצינור על מנת לדלל את Percoll הנותר.
  6. צנטריפוגה ההשעיה התא 10 דקות ב 300 XG ב 4 ° C. בטל supernatant ולשטוף חוזר.
  7. Resuspend התא גלולה במדיום ולקבוע את המספר הסלולרי (באמצעות trypan הכחול וhemocytometer). מניסיוננו, אחוז תאי LDF הוא כ 2-20% מהשעית התא הבודד הכוללת המתקבלת לאחר עיכול אנזים. Y טיפוסיield של תאים מועשרים בצפיפות נמוכה (מהתימוס צעיר שנות יום 2 1 טווח,) הוא 1x10 8 תאים לכל 1 x 10 9, המייצג 10% מתאי השעיה תא בודדים בסך הכל.

הערה: בשלב זה, אתה עשוי לצפות כי תאים מצטברים בהשעיה (במיוחד עם דגימות מילדים בגיל מבוגר יותר). גושים סלולריים הם אינדיקציה למוות של תאים והתוצאה משחרורו של ה-DNA מהתאים המתים שיכול להיצמד לתאים יחד. במקרה כזה, להוסיף DNase אני לתוך המדגם (50 מיקרוגרם / מיליליטר) ו דגירה אותו לתקופה של עד 20 דקות ב RT (בעדינות להפוך כל 5 דקות) כדי לעכל את מולקולות ה-DNA בחינם.

5. בידוד של הרתי MDC

לאחר העשרת APC (באמצעות הפרדת Percoll), MDC יכול להיות מבודד ביעילות מLDF הבא בסיבוב הראשון והשני של digestions האנזימטית. הפרוטוקול הבא הוא גרסה שונה של הפרדת תאים המגנטית לבידודה של MDC (CD11c +).

  1. צנטריפוגה APC מועשר בתאים מבודדים מהשעית התא בודדת המתקבלת מעיכול אנזימטי הראשון והשני ונקווה XG 300 10 דקות ב 4 ° C ו resuspend תא גלולה במאגר 100 MACS μl לכל 10 7 תאים.
  2. הוסף 5 μl של נוגדן CD11c-PE לכל 10 7 תאים.

הערה: ניסויי כותרות מומלצים לתוצאות אופטימליות.

  1. מערבבים היטב דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C, מוגן מפני אור.
  2. שטוף תאים על ידי הוספת 1-2 מיליליטר של חיץ MACS לכל 10 7 תאים ו צנטריפוגות XG 300 10 דקות.
  3. לשאוב supernatant לחלוטין וresuspend עד 10 7 תאים ב80 μl של חיץ MACS.
  4. הוספת microbeads אנטי PE 20 μl לכל 10 7 תאים.
  5. מערבבים היטב (לא מערבולת) ו דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C המוגנים מפני אור.
  6. חזור כמו בשלב 5.4.
  7. Resuspend עד 10 8 תאים ב500 μl של חיץ.
  8. במידת צורך, השעיה תא סינון באמצעות מסננת 40 תא מיקרומטר כדי להסיר אגרגטים פסולת ותא שעלולה לחסום את הזרימה של העמודה.
  9. השתמש בעמודת LS מאז השעיות תא התימוס לזרום טוב יותר באמצעות עמודות LS. הכן LS טור הבא הוראות יצרן. השעיה תא פיפטה לאט לתוך טור הימנעות בועות שהניבו. השתמש בעמודה אחת עבור כל 1 x 10 8 תאים.
  10. שטוף טור הבא הוראות היצרן. הסר את העמודה מהמגנט ולמקם אותו ב12 מיליליטר סטרילי סביב צינור פוליפרופילן תחתון. הוסף 3 MACS מיליליטר החיץ על הטור ולאסוף תאים מגנטיים שכותרתו על ידי הכנסה ובתקיפות דוחפים את הבוכנה לתוך הטור.
  11. לאסוף את שבר eluted המייצג את CD11c + MDC ו צנטריפוגות ב XG 400 במשך 6 דקות.
  12. לקבוע מספר תא ולאשר טוהר populati התא הנבחרעל ידי ניתוח התזרים cytometric. סמנים הציעו לכלול CD45, CD11c, וHLA-DR.

הערה: CD11c + MDC עשוי גם להיות מבודד באמצעות סדרן FACS.

6. העשרה של תאי lo / נג CD45 למיון תא של TEC

לבידוד תרמי של TEC, ניתן מראש מועשרים תאים על ידי דלדול של תאים היי CD45 באמצעות microbeads CD45, על מנת להאיץ את הבידוד שלהם באמצעות מיון תא.

השתמש השעיה תא בודדת המתקבלת מהשלב 3 rd העיכול (3.1.14) ולאחר מכן הופרדה על ידי צנטריפוגה Percoll.

  1. צנטריפוגה השעיה תא XG 300 10 דקות ב 4 ° C ו resuspend תא גלולה ב80 MACS μl חיץ לכל 10 7 תאים.
  2. השתמש microbeads CD45 ב 1/3 מהכמות המומלצת (6.7 μl) לכל 10 7 תאים.

הערה: על ידי שימוש בכמות נמוכה יותרשל microbeads מראש להעשיר את התאים לשניהם CD45 הפלא ותאי נג CD45. הכותרות מומלצת לתוצאות אופטימליות.

  1. מערבבים היטב בעדינות על ידי מצליף את הצינורית (לא מערבולת) ו דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C.
  2. microbeads מאוגד לשטוף ידי הוספת 10 מיליליטר של חיץ MACS ו צנטריפוגות במשך 10 דקות XG 300 ב 4 ° C. לשאוב supernatant לחלוטין.
  3. Resuspend עד 10 8 תאים ב500 μl של חיץ.
  4. במידת צורך, השעיה תא סינון באמצעות מסננת 70 תא מיקרומטר כדי להסיר אגרגטים פסולת ותא שעלולה לחסום את הזרימה של העמודה.
  5. השתמש בעמודת LS מאז השעיות תא התימוס לזרום טוב יותר באמצעות עמודות LS. הכן LS טור הבא הוראות יצרן. השעיה תא פיפטה לאט לתוך טור הימנעות בועות שהניבו. השתמש בעמודה אחת לכל 10 8 תאים.
  6. איסוף תאים ללא תווית (זרימה דרך ושוטף) המכיליםשבריר תא lo / נג CD45 ולשטוף טור הבא הוראות יצרן.
  7. צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C ו resuspend תא גלולה במאגר FACS סטרילי על מנת לקבוע את המספר נייד ולהמשיך מכתימים את מיון תא.

7. תאי כתם למיון תא הקרינה הופעל

  1. בצע FCR חסימה לפני מכתים תא, על מנת להפחית את הנוגדן שאינו ספציפי המחייב. דגירה השעיה תא עם פתרון נוגדנים אנושיים ונקווה ל15 דקות ב RT. ריאגנטים אלה הם זמינים באופן מסחרי (כלומר פתרון 10% Gammunex).
  2. שטוף תאים על ידי הוספת חיץ FACS סטרילי קר. צנטריפוגה ב XG 400 במשך 6 דקות ב 4 ° C.
  3. בטל supernatant ותאי resuspend במאגר FACS סטרילי קר. הכן 5 דגימות על פי הדוגמא הבאה:
    מדגם סוג המדגם נוגדן מספר סלולרי נפח כולל
    1. ללא רבב שליטה 1 x 10 6 50 μl
    2.scc * פסיפיק בלו שליטה CD45 פסיפיק בלו 1 x 10 6 50 μl
    3. SCC-APC שליטה CD3-APC 1 x 10 6 50 μl
    4.scc-Alexa 488 שליטה CD8-Alexa 488 1 x 10 6 50 μl
    5. מיון תא אנליטי CD45 פסיפיק בלו
    EpCAM-APC
    CDR2-Alexa 488     		10 x 10 6-50 x 10 6 500 μl
    10 x 10 6 μl cells/100

    * SCC; שליטת צבע אחד

  4. דגירה תאים עם נוגדנים ל30 דקות, על קרח בחושך.
  5. שטוף פעמיים עם חיץ FACS ידי צנטריפוגה תאים ב XG 400 במשך 6 דקות ב 4 ° C.
  6. התאם את ריכוז התא של המדגם להיות מסודר לx10 1 7 תאים / מיליליטר (או לריכוז מומלץ על ידי מתקן מיון התא) באמצעות FACS חיץ סטרילי למיון תא (כלומר ללא NaN 3).
  7. לעבור מדגם תא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר כדי להסיר כל גושי תאים שעלולות לסתום cytometer במהלך מיון.
  8. Resuspend דגימות שליטה ב200-400 μl של חיץ. שמור צינורות על קרח ומוגן מפני אור.
  9. הכן צינורות אוסף עם מדיום.

הערות:

  • בצע טיטרציה של הנוגדנים עבור מכתים אופטימלי.
  • בדגימה אחת למיון, יכולים להיות מוכתמים עד 50 x 10 6 תאים בסך הכל תגובת נפח500 μl.
  • לבצע צביעה של המדגם להיות מסודר ב5 מיליליטר צינורות תחתית עגולים פלקון פוליסטירן. יכול להיות מוכתם שולט צבע אחד בבארות נפרדות מצלחת 96 היטב.
  • מאז תת TEC הם אוכלוסיות נדירות, מומלץ לשימוש אחר סמן חיובי (של תדר גבוה) לכל fluorochrome כדי להקל על קביעת הגדרות FACS תקינה ולוודא שיש לך פיצוי הולם אם הבחירה של fluorochromes דורשת פיצוי. תאים משבריר CD45 + יכולים להיות מוכתמים עם סמנים כגון CD45, CD3 או CD8 לfluorochromes השונים ולאחר הצביעה ניתן להוסיף CD45 + תאים בלא כתם למדגם.

8. בידוד של TEC ידי מיון תא קרינה המופעל

ניתן למיין תת TEC משבריר CD45 lo / נג כCDR2 היי EpCAM - (mTEC) או EpCAM lo CDR2 + (cTEC).

  1. הפעל את שנינות המדגםשעות התאים בלא כתם ולהתאים את קדימה ופיזור בצד על מנת למקם את אוכלוסיית העניין בקנה מידה. התאם את המתח בכל גלאי, כך שהתאים גלויים אך ממוקם ביד החלק השמאלי של ההיסטוגרמה.
  2. הפעל כל דגימה מוכתמת בודדת ולהתאים את הפיצוי לכל צבע.
  3. לאחר התאמת המתח ופיצוי על הפקדים המוכתמים בלא כתם ואחד להפעיל את המדגם כדי להיות מסודר וכלים gating השימוש כדי להגדיר את האוכלוסייה של עניין. השתמש רחב קדימה ושער פיזור הצד כדי להבטיח הכללת כל גדלי תאי סטרומה, תוך הדרת פסולת תא.
  4. על המגרש הנקודה עם CD45 פסיפיק בלו מול שער Forward פיזור על תאי נג נמוכים וCD45 CD45.
  5. החל השער הזה לEpCAM לעומת עלילת נקודת CDR2 ולקבוע על ידי gating האוכלוסיות להיות מסודרים.
  6. ברגע ששערים כבר נקבעו, בחר בשערים המכילים אוכלוסיות של עניין ולהתחיל למיין.
  7. תאים ממוינים ברגע שכבר נאספו, צנטריפוגה את ההשעיה התא, ותאי resuspend במדיום או חיץ של בחירה בהתאם ליישום במורד הזרם המיועד.

הערה: במהלך מיון כדי למנוע מתאים מלהידבק לדפנות צינור האיסוף, הצינור יכול להיות מראש מצופה על ידי מילוי אותו עם 50% FCS ב-PBS וטופחו על RT במשך 30 דקות. מחק את פתרון הציפוי לפני הוספת תקשורת אוסף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כחומר מוצא בפרוטוקול זה אנו משתמשים ברקמת בלוטת התימוס הוסרה מילדים שעברו ניתוח לתיקון לב וכלי דם (מחלקה לבית החזה וניתוח לב וכלי דם, אוניברסיטת מרפאת טובינגן) שהושגו לאחר הסכמה מדעת ותחת הנחיות מוסדיות. חומר שהושלך זה יכול להשתנות במידה רבה בגודל 2-30 גרם או יותר. מספר MDC ותת TEC (cTEC וmTEC) שמתקבלים תלוי בגודל, כמו גם את גיל דגימת רקמת התימוס המשמשת לבידוד.

איור 2 מראה חתיכה די גדולה של רקמה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן הוא שינוי של הפרוטוקול שפורסם על ידי Gotter et al 4. שלבים קריטיים בפרוטוקול הם המצב והכנה ראשונית של הרקמה, כמו גם את הפרדת צפיפות Percoll. אנו ממליצים בחום לעבד את הרקמה בהקדם האפשרי לאחר איסוף. חשוב לעבוד מהר אך ביסודיות בעת ניקוי וחיתוך הרקמות. במהלך שטיפת thymocyte המתוארת בשלב 2.3, חשוב למצוא את האיזון הנכון בעת ​​הפעלה לחץ בגב בוכנת המזרק בחתיכות הרקמה כמו לחץ נמרץ מדי וממושך עלולים לגרום נזק לתאי סטרומה. גם שכבות בינוניות על גבי הפת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגוד האינטרסים הכריז.

תודות

אנו אסירי תודה למנתחים מהמחלקה לכירורגיית בית החזה ולב וכלי דם, אוניברסיטת מרפאת טובינגן שספק לנו דוגמאות התימוס וברונו Kyewski (DKFZ, היידלברג, גרמניה) על מתן נוגדני CDR2. כמו כן, אנו רוצים להודות לאנס יורג Bühring וסברינה גרים ממתקן המיון (אוניברסיטת טובינגן). עבודה זו נתמכה על ידי SFB 685 וקרן Hertie.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים וחומרים
RPMI 1640PAAE15-842 
PAAH15-002של Dulbecco
סרום בקר עוברי-זהבPAAA15-151 
סרום בקר אלבומיןPAAK41-001 
קולגנאז ARoche10 103 586 001 
DNase I, לבלב בקר דרגה IIRoche10 104 159 001 
Trypsin-EDTA 10x במלאי PBSPAAL11-001conc. 20 מ"ג/מ"ל
Alexa Fluor 488 ערכת תיוג חלבוןבדיקות מולקולריותA-10235 
CDR2 אנטי אנושי (מטוהר)ברונו קייבסקי, DKFZ- היידלברג, גרמניהמתויג עם Alexa Fluor 488
CD45 אנטי-אנושי (פסיפיק כחולBiolegend304022 
EpCAM אנטי אנושי (APC)Miltenyi Biotec130-091-254 
CD11c (PE) אנטי אנושיMiltenyi Biotec130-092-411 
מיקרו-חרוזים נגד PEMiltenyi Biotec130-048-801 
מיקרו-חרוזים נגד CD45, אנושיMiltenyi Biotec130-045-801 
עמודות LSMiltenyi Biotec130-042-401 
gentleMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-237למפריד רקמות
פרקול (צפיפות 1.130 גרם/מ"ל)GE Healthcare, מדעי החיים17-0891-01 
מים מזוקקים סטריליים (ללא DNAse/RNAse)GIBCO10977-035 
Gamunex 10%Tajecris-BiotherapeuticsG1200521:10 לפני דילול, יש להשתמש ב-20 μ l/1 x 106תאים
0.22 μ m פילטרMillex GSSLGS033SSמזרק מונע
יחידת מסנן StericupMilliporeSCGPU05REמשאבה מונעת
50 מ"ל PC אלון רכס צינורות צנטריפוגהNalgene3118-005050 מ"
ל 50 מ"ל PP צינורות חרוטייםBecton Dickinson352070 
מבחנות 12 מ"מ x 75 מ"מ 5 מ"לצביעת Becton Dickinson352058FACS
מסננת תאים 70 μ מבקטון דיקינסון352350 
INSTRUMENTS
Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu)Becton Dickinson 
סורוול אבולושן R6 (רוטור)קנדרו 
מסובב REAX 2היידולף 
דיסוציאטור gentleMACSMiltenyi Biotec130-093 235דיסוציאטור רקמות
PBS )

מקורות

  1. Miller, J. F. A. P. The discovery of thymus function and of thymus-derived lymphocytes. Immunological Reviews. 185, 7-14 (2002).
  2. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat Rev Immunol. 9, 833-844 (2009).
  3. Vandenabeele, S., Hochrein, H., Mavaddat, N., Winkel, K., Shortman, K. Human thymus contains 2 distinct dendritic cell populations. Blood. 97, 1733-1741 (2001).
  4. Gotter, J., Brors, B., Hergenhahn, M., Kyewski, B. Medullary Epithelial Cells of the Human Thymus Express a Highly Diverse Selection of Tissue-specific Genes Colocalized in Chromosomal Clusters. The Journal of Experimental Medicine. 199, 155-166 (2004).
  5. Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 36, 1511-1517 (1988).
  6. Stoeckle, C., et al. Cathepsin S dominates autoantigen processing in human thymic dendritic cells. Journal of Autoimmunity. 38, 332-343 (2012).
  7. Woods Ignatoski, K. M., Bingham, E. L., Frome, L. K., Doherty, G. M. Directed trans-differentiation of thymus cells into parathyroid-like cells without genetic manipulation. Tissue Eng Part C Methods. 17, 1051-1059 (2011).
  8. Williams, K. M., et al. Single Cell Analysis of Complex Thymus Stromal Cell Populations: Rapid Thymic Epithelia Preparation Characterizes Radiation Injury. Clinical and Translational Science. 2, 279-285 (2009).
  9. Bendriss-Vermare, N., et al. Human thymus contains IFN-α-producing CD11c-, myeloid CD11c+, and mature interdigitating dendritic cells. The Journal of Clinical Investigation. 107, 835-844 (2001).
  10. Schmitt, N., et al. Ex vivo characterization of human thymic dendritic cell subsets. Immunobiology. 212, 167-177 (2007).
  11. Dzionek, A., et al. BDCA-4: Three Markers for Distinct Subsets of Dendritic Cells in Human Peripheral Blood. The Journal of Immunology. 165, 6037-6046 (2000).
  12. Wu, L., Shortman, K. Heterogeneity of thymic dendritic cells. Seminars in Immunology. 17, 304-312 (2005).
  13. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of Immunological Methods. 385, 23-34 (2012).
  14. Adamopoulou, E., Tenzer, S., Hillen, N., Klug, P., Rota, I. A., Tietz, S., Gebhardt, M., Stevanovic, S., Schild, H., et al. Exploring the MHC-peptide matrix of central tolerance in the human thymus. Nature Communications. , (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Percoll

מאמרים קשורים