מאמר שיטה

שימוש

42.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50964

⸱

22 בנובמבר 2013

 ,  ,  , 
1Center for Molecular Bacteriology and Infection, Imperial College London

במאמר זה

סיכום

הזחל של עש mellonella Galleria שעווה הוקם לאחרונה כמודל vivo בללמוד זיהום pneumophila הלגיונלה. הנה, אנחנו מדגימים טכניקות בסיסיות לאפיין את הפתוגנזה של הלגיונלה בזחלים, כוללים חיסון, מדידה של אלימות ושכפול חיידקים, כמו גם הפקה וניתוח של hemocytes הנגוע.

תקציר

הלגיונלה pneumophila, הסוכן סיבתי של דלקת ריאות חמורות בשם מחלת הליגיונרים, הוא הפתוגן אנושי חשוב שמדביק ומשכפל בתוך מקרופאגים מכתשיים. הארסיות שלה תלויה במערכת דוט / ICM הפרשת הסוג IV (T4SS), שהוא חיוני להקמת vacuole מתירנית שכפול המכונה הלגיונלה המכיל vacuole (LCV). L. זיהום pneumophila יכול להיות מודל בעכברי אולם רוב זני עכבר אינם מתירנית, מה שמוביל לחיפוש אחר מודלים זיהום רומן. הראינו לאחרונה כי הזחלים של mellonella Galleria עש השעווה מתאימים לחקירתו של ל ' זיהום pneumophila. ג mellonella משמש יותר ויותר כמודל זיהום לפתוגנים אנושיים ומתאם טוב בין הארסיות של כמה מיני חיידקים בחרקים ובמודלים של יונקים. מרכיב מרכזי של ההגנה החיסונית של הזחלים הוא hemocytes, מקצועphagocytes אל, אשר תופס ולהשמיד פולשים. L. pneumophila הוא מסוגל להדביק, בצורת LCV ולשכפל בתוך תאים אלה. כאן אנו מדגימים פרוטוקולים לניתוח ל ' ארסיות pneumophila בג מודל mellonella, כולל איך לגדל L. זיהומיות pneumophila, pretreat הזחלים עם מעכבים, להדביק את הזחלים וכיצד לחלץ תאים נגועים לכימות ומיקרוסקופיה immunofluorescence. אנו גם מתארים כיצד לכמת שכפול וכושר חיידקים במבחני תחרות. גישות אלו מאפשרות הסינון המהיר של מוטציות כדי לקבוע גורמים חשובים בL. ארסיות pneumophila, המתארת ​​את כלי חדש כדי לסייע להבנה של הפתוגן המורכב זו שלנו.

מבוא

מודלים של בעלי החיים של זיהום הוכיחו לא יסולא בפז בקביעת גורמים ארסי חיידקים. עם זאת, מודלים של חסרי חוליות שזכו לתשומת לב מוגברת כחלופה למודלים מסורתיים של יונקים של זיהום. הזחלים של עש השעווה, הוא יותר ויותר משמשים mellonella Galleria ללמוד מספר פתוגנים אנושיים חשובים, ובם חיידקים גראם חיוביים 1 וגראם שליליים 2,3 וכמה פטריות פתוגניים 4,5. באמצעות מודל חרקים יש מספר היתרונות על פני דגמים של יונקים מסורתיים, כחוליות, ג mellonella אינו כפוף למגבלות האתיות של מודלים של יונקים. בנוסף, ניתן לשמור את הזחלים בקלות, נגועים בהזרקה ללא הרדמה, לעבור טיפול מקדים עם מעכבים כימיים 6 ולקיים דגירה על 37 C ° 7. מעניין לציין, כי קשר טוב בין פתוגניות של כמה מיקרואורגניזמים בג מלlonella ומודלים של יונקים של זיהום כבר נקבעו 2,8. ההבנה המוגברת של המערכת החיסונית של ג mellonella גם סייע באפיון של אורגניזם מודל זה. למרות שאין לי חרקים מערכת חיסונית אדפטיבית כפי שנמצאו ביונקים, יש לי ההגנות סלולריות וההומרוס מתוחכמים הכוללים הייצור של פפטידים מיקרוביאלית 9 שהם. Hemocytes הוא המתווך העיקרי של ההגנות סלולריות והוא סוג התא רב ביותר נמצא בhemolymph (או בדם) של ג mellonella 10, תאים אלה הם phagocytes המקצועי ולבצע פעולות דומות למקרופאגים ונויטרופילים אדם על ידי שני תופסים ומשפילים חיידקים בתא phago-lysosomal 10,11 ויוצרים גושים סביב חיידקים פולשים, המגבילים את שכפול חיידקי 12 פיזי.

הלגיונלה pneumophila הוא הפתוגן בדרכי הנשימה שגורם pneumoni החמור(מחלת הליגיונרים) באוכלוסיות רגישות כגון קשישים או מדוכאי חיסון 13. הלגיונלה נמצאת כל מקום בגוף במקורות מים הן סביבתיים ומעשה ידי אדם, שבו הוא הפתוגן של מינים שונים של אמבות מים מתוקים 14,15. הלגיונלה שורדת ו משכפל בתוך phagocytes המקצועי אלה על ידי שימוש בקומפלקס רב חלבון המכונה Dot / ICM (פגום בסחר אברון כפל תאיים /) הקלד מערכת 4 הפרשה (T4SS) לtranslocate מעל 275 חלבוני מפעיל לתא המארח 16-20. חלבונים אלו משמשים לערער את מסלולי phagocytic התא מארח הרגילים, מה שמוביל ליצירתו של הלגיונלה המכיל vacuole (LCV). LCV מונע התמזגות עם lysosomes ובמקום מגייס reticulum endoplasmic (ER) שמקורם בשלפוחית, וכתוצאה מתא מיוחד שדומה ER מחוספס 21,22. L. pneumophila נחשב נתיב אדם בשוגגעוגן; את אותן אסטרטגיות שתאפשרנה לה לשכפל בתוך אמבות, גם לאפשר שכפול במקרופאגים מכתשיים אדם 23.

מארחים של יונקים היו מאופיינים כמודלים לזיהום הלגיונלה אדם כוללים עכברים וחזירי ים 24,25. עם זאת, הרוב המכריע של זני עכבר עמיד לזיהום הלגיונלה 26 למעט העכבר המולד בקן / J, מפתחת זיהום 24 מתון, מעצמם. למרות שמודל שפן הניסיונות דומה יותר למחלות בבני אדם 25, חוסר מוטנטים והתייקרות מרתיעה את השימוש בם 27. בנוסף, מספר דגמים חסרי חוליות פותחו עבור זיהום הלגיונלה pneumophila כולל Caenorhabditis elegans 28, דרוזופילה melanogaster 29 וכמה מינים של אמבות 30-32. עם זאת, יש מודלים אלה חולשות, ארסיות בג elegans המערכת אינה דוט / ICM תלוי 28, להגביל את השירות של מודל זה. מודל דרוזופילה הוכיח עצם כיעיל בחקירה ארסית חיידקי גורמי 29 ונראה מבטיח עם זאת, מודל זה לא מאופיין במלואו. אמבות חד תאיות הם המארחים הסביבתיים של L. pneumophila והם אידיאליים לחקירת הפעולה של גורמים ארסי ברמה מולקולרית 33 עם זאת חסרים כמה מתווכים חשובים של תגובת התא המארח של יונקים לזיהום כגון caspases 34. החולשות של המודלים קיימים, יחד עם העלות הגבוהה ודאגות אתיות הקשורות לניסויים יונקים, הובילו לחיפוש אחר אורגניזמים מודל מתאימים אחרים 29,35.

אנחנו הוכיחו לאחרונה כי ג mellonella הוא מודל מתאים לL. pneumophila פתוגנזה 36,37. פרוטוקול זה מפרט את ניסיוני בטכניקות המשמשות ללהדביקing G. זחלי mellonella, ניתוח מוסר זחל, חילוץ hemocytes לספירה וimmunofluorescence וקביעת שכפול על ידי CFU קיימא סופרים מזחלים נגועים.

פרוטוקול

1. הכנת ל ' pneumophila לזיהום

  1. הכן פחם תמצית שמרי צלחות (CYE) (פחם 2 גר '/ L מופעל, תמצית 10 גר' / ליטר שמרים, 13 אגר גר '/ ל', 10 גר '/ ליטר N-(2-acetamido)-2-aminothanesulfonic חומצה (אסים), 1 α-ketoglutarate גר '/ ל', pyrophosphate 0.4 g / L-L-ציסטאין HCl ו0.25 L / g וברזל, pH 6.9).
    הערה: אם יש צורך, להוסיף kanamycin (25 מיקרוגרם / מיליליטר) ו / או כלורמפניקול (6 מיקרוגרם / מיליליטר) לCye צלחות.
    1. לבצע את כל L. עבודת pneumophila בבלימת הבטיחות ביולוגית ברמה 2 (BSL-2) בארון בטיחות חיידקים (MSC) בעמידה בכללים מקומיים.
  2. פס ל pneumophila מ-80 מניות גליצרול C ° על צלחות CYE
  3. דגירה צלחות במשך 4 ימים ב 37 ° C.
    הערה: דגירה של צלחות במשך 4 ימים מגדילה את ארסיותו של ל 'באופן משמעותי pneumophila בג mellonella מעל הדגירה במשך 3 ימים.
  4. יום אחד לפני ההדבקה, resuspend פו לולאה אחתll של חיידקים (המכיל כמה מושבות) ב 1 מיליליטר של prewarmed (37 מעלות צלזיוס) האסים תמצית שמרים (AYE) מרק ולמדוד את הספיגה ב 600 ננומטר (OD 600) באמצעות ספקטרופוטומטר.
  5. לחסן תרבות AYE 3 מיליליטר טרי (עם אנטיביוטיקה אם נדרש) לOD סופי 600 של 0.1.
    1. כולל תקשורת רק לשלוט על מנת להבטיח סטריליות של התקשורת.
  6. לדגור על 37 ° C בחממה רועדת בסל"ד 200 21 שעה.
    שים לב: חיידקים צריכים להיות מבוגרים כדי שלב שלאחר מעריכי לזיהום 38. גידול ל21 שעה מאפשר ניסויים כדי להיות אחידים.
    הערה: אם נדרש לזירוז חלבון, להוסיף 0.5 מ"מ איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) למשך הלילה.
  7. מדוד את OD 600 (חיידקים צריכים להיות בשלב שלאחר מעריכי צמיחה, OD 600 2.5-3).
  8. לדלל תרבות חיידקים לתת 1 x 10 9 CFU / מיליליטר בופר פוספט של Dulbecco סטרילי (D-PBS).
    פתק: בהתבסס על תוצאות קודמות, OD 600 של 1 מתאים ל1 x 10 9 CFU / מיליליטר, אולם זה צריך להיות אישר לL. שונה זני pneumophila.
    הערה: אם נדרש גיוס של חלבון מפלסמיד, להוסיף 1 מ"מ של IPTG לבידוד.
  9. פלייט הבידוד כאמור בסעיף 9 כביקורת על מנת להבטיח את CFU הצפוי נמצא בבידוד.

2. הכנת הזחלים

  1. לרכוש G. מספיק mellonella זחלים מן ספק מסחרי. זחלים נשלחים בשלב instar ה -5 או ה -6 (בערך בין 2-3 סנטימטר באורך) ומתאימים לשימוש באופן מיידי.
    הערה: שיטה המתארת ​​כיצד אחורי זחלים כבר תוארו בעבר 39.
    הערה: ניתן לאחסן את הזחלים בטמפרטורת חדר למשך עד שבועיים ואינם דורשים מזון. מייד לבטל את כל זחלים מראים סימנים של התגלמות.
  2. הכן את המכל לזחל ידי placing מעגל 10 נייר סינון סנטימטר בחלק התחתון של צלחת פטרי 10 סנטימטר.
  3. באמצעות פינצטה הטתה בוטה, הנח עשרה זחלים בריאים בגודל כ דומה לצלחת פטרי.
    הערה: מחק חרקים חומים בצבע או כתמים מחפשים לא בריאים. זחלים בריאים הם בצבע אחיד בצבע הקרם ללא אזורים של שינוי צבע כהה והם מסוגלים לתקן את עצמם במהירות אם התהפך.

3. זיהום של ג mellonella זחלים

  1. הכן את פלטפורמת ההזרקה על ידי הדבקת עיגול נייר סינון אל פני השטח.
  2. מאובטח קלטת טיפ P1000 אופקית לנייר הסינון כדי ליצור פלטפורמת הזרקה. זה לא צריך להיות סטרילי.
  3. לעקר מזרק microtiter 20 μl ידי aspirating 70% אתנול ודוגר במשך דקות לפחות 10.
    1. ללבוש כפפות לנקב הוכחה בזמן הזרקה,
  4. הסר את כל אתנול שיורית על ידי נשיפה וגירוש מים סטריליים מספר פעמים.
  5. USIng המזרק, לשאוב 10 μl של L. pneumophila 1 x 10 9 השעיה CFU / מיליליטר.
  6. קח את הזחל אחד ובעדינות אך בתקיפות להפוך אותו על הגב שלה, התכופף קצה P1000.
  7. הנח את הקצה של המזרק מעל proleg הקדמי, זכותם של הזחלים.
  8. בעדינות, הכנס את קצה המחט לתוך proleg, כדי לוודא שהוא נמצא בישוב הזחלים, וצורה חלקה להזריק את כל תכולת המזרק.
    הערה: אם המזרק מוכנס בצורה נכונה, זה צריך להיות אפשרי כדי להרים את הזחלים רק באמצעות המזרק כדי למקם אותו לתוך התא.
    1. לאחר הזרקה, לבחון את הזחלים במשך כמה שניות. הזחלים יתחילו לזחול אחרי כמה שניות אבל לא צריך להפריש נוזלים.
  9. בקצרה לבחון את הזחלים כמה שעות שלאחר זיהום; זיהום עם 10 7 CFU L. 130b pneumophila אינו גורם לתסמינים כלשהם בתוך pi שעה הראשון 5-8 לכן אם הזחלים פונים אפור / שחור לפני שלב זה, לאהוא ניסוי יש להפסיק.
    הערה: הרכבה של זחלים עם 1 מ"מ IPTG אינה משפיעה על כדאיות זחל במהלך הניסוי.
  10. באותו אופן, להזריק כולל של 10 זחלים לכל מצב כולל 10 זחלים מוזרקים עם D-PBS לשמש שליטה לנתח תמותת זחל.
  11. צלחות פטרי קלטת סגורות ומקום בבלימה משנית.
  12. דגירה בחממה חיידקים סטנדרטית על 37 מעלות צלזיוס, למשך תקופת הניסוי.

4. טיפול מקדים של זחלים עם מונעי כימיים

  1. לפני ההדבקה, להכין זחלים להזרקה כאמור בסעיף 3.1-3.6.
  2. הזרק 10 μl של של Cytochalasin D פתרון 100 מיקרומטר לחזית, עזב proleg של 10 זחלים.
    הערה: מונעי מוזרקים לתוך proleg שונה מהשעית חיידקים כדי להפחית את הפגיעה בזחלים.
  3. הזרק 10 μl של DMSO ל10 זחלים כביקורת.
  4. דגירה זחלים בC ° 37 במשך 4 שעות.
  5. הזרק זחלי pretreated כאמור בסעיף 3 לחזית, נכון proleg גם עם 1 x 10 7 CFU של WT ל pneumophila או שליטת PBS.

5. ניתוח של תמותת הזחל

  1. ב18 הודעה hr זיהום (PI), לבחון את כל הזחלים הנגועים לתמותה.
  2. כדי לבדוק תמותה, להשתמש בפינצטה הקהה שקצו למסור את הזחלים ולחפש תנועה של הרגליים, זחלים בריאים צריכים לתקן את עצמם במהירות. פיגמנטציה מציינת תגובה חיסונית חזקה לזיהום. אם יש תנועה, לספור בחיים כמו ש.
  3. מספר שיא של זחלים מתים וחיים.
  4. חזור על תהליך זה בכל נקודות הזמן האחרות שנבחרו.
    הערה: אם הדגירה נמשכת במשך יותר משלושה ימים, גלמים ניתן לראות. הסר את כל גלמים ולהרדים על ידי הקפאה ב-- 20 מעלות צלזיוס לפני מטמורפוזה יכולה להתרחש.

6. הפקת Hemolymph

  1. תבחר באופן אקראי שלושזחלים ומקום לתוך צינור 14 מיליליטר בנקודות זמן נבחרים כגון 5 ו18 pi שעה,
  2. הנח צינור זה על קרח למשך 5-10 דקות, עד שאין תנועה של הרגליים של הזחלים ניתן לצפות.
  3. מניחים את הזחלים הרדימו על צלחת פטרי, ובאמצעות אזמל, עושה חתך בין שני מגזרים ליד הזנב של הזחלים.
  4. לסחוט את הזחלים לתוך צינור צנטריפוגות 1.5 מיליליטר סטרילי כדי לאסוף hemolymph.
    1. hemolymph בריכה מלפחות שלושה אנשים. זחלים אחד נותן בין 15-50 μl של hemolymph תלוי בגודל.
      הערה: במהלך חילוץ hemolymph קל מאוד לשבש את הבטן, וכתוצאה מכך הזיהום פוטנציאלי של הדגימות. להפחית את הזיהום על ידי חיתוך הזחלים ליד הזנב (מהבטן) עם זאת, תמיד תהיה צורך בחירת אנטיביוטיקה כאשר ציפוי החוצה את החיידקים.
      הערה: כדי למנוע hemolymph מהמפנה חום וקרישה, תהליך hemolymph בתוך 10 דקות לאחר איסוף.
  5. מחק את גוף הזחל ל14 מיליליטר צינור פלקון, חותם ומקום חדש ב-- 20 מעלות צלזיוס למשך לילה על מנת להבטיח את הזחלים מתים.
  6. החיטוי זחלים מתים ולהשליך על פי כללים מקומיים.

7. קביעת Hemocyte הכדאיות

  1. לחלץ hemolymph כפי שתואר לעיל.
  2. מערבבים 20 μl של hemolymph חילוץ עם 20 μl של 0.02% (v / v) Trypan כחול ב-PBS באחד טוב של צלחת גם 96.
  3. דגירה במשך 5 דקות ב RT.
  4. טען 10 μl של hemolymph על hemocytometer ולספור תאי קיימא (לא כחולים).
  5. לספור כל דגימה בשלושה עותקים כדי להפחית את השגיאה.

8. עיבוד שחולץ hemocytes לImmunofluorescence מיקרוסקופית

  1. מערבבים את hemolymph נקווה שחולץ מלפחות שלושה זחלים ופיפטה על coverslip זכוכית 10-15 מ"מ בצלחת 24 גם.
    הערה: Coverslips אינו דורש טיפול כמו hemocytes יכול לדבוק בזכוכית.
  2. הוסף 0.5 מיליליטר של D-PBS ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה.
  3. צנטריפוגה את הצלחת 10 דקות ב XG 500 בטמפרטורת חדר (RT) באמצעות בעל צלחת צנטריפוגות תרסיס חזק.
  4. לבחון היטב כל אחד באמצעות מיקרוסקופ הפוכה כדי לבדוק שhemocytes יש דבק.
  5. הסר את supernatant וזהירות לשטוף את התאים שלוש פעמים על ידי הוספת 0.5 מיליליטר D-PBS לקיר היטב, נדנדה הצלחת 2-3x והסרת D-PBS עם טפטפת.
  6. תקן את התאים על ידי תוספת של 0.5 מיליליטר של 4% (v / v) paraformaldehyde (PFA) ב-PBS.
  7. דגירה התאים לבין 20-30 דקות ב RT.
  8. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם D-PBS, כמו קודם.
  9. הוסף 0.5 מיליליטר 15 Cl מ"מ NH 4 בPBS כדי להרוות PFA שייר ולדגור על RT במשך 15 דקות.
  10. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם D-PBS.
    הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן את coverslips לילה בשעה 4 ° C.
  11. הוסף 0.5 מיליליטר 0.1% טריטון X-100 ב PBS ו דגירה במשך 5 דקות ב RT לpermeabilize תאים.
  12. בלוק עבור שעה 1 עם פתרון חסימה (2% (w BSA / V) ב-PBS).
  13. דגירה עבור שעה 1 ב RT בחושך עם הנוגדן הראשוני המדולל חסימת פתרון בדילול שצוין על ידי היצרן.
  14. לשטוף 3x עם PBS.
  15. דגירה עבור שעה 1 עם נוגדנים משני וDAPI להדמיה של חיידקים כאמור לעיל.
  16. לשטוף 3x עם PBS.
  17. הר coverslips באמצעות טיפה אחת של מגיב הרכבה על גבי שקופיות זכוכית.
  18. דגירה הלילה בחושך ב RT לייבש את פתרון ההרכבה באופן מלא.
  19. תמונה מחליקה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

9. כימות קטריאלי CFU

  1. הוספת 100 מיקרוגרם / מיליליטר spectinomycin לCye צלחות כדי למנוע זיהום על ידי צמחיית מעיים. L. 130b מתח pneumophila הוא עמיד באופן טבעי לspectinomycin 40.
  2. לפני מיצוי hemolymph, לשקול 1.5 צינורות צנטריפוגה מיליליטר.
  3. לחלץ hemolymph כאמור בסעיף 6 ומקום בt שקלubes, להוסיף 1 μl של 5 מ"ג / מיליליטר digitonin, מערבב היטב ודגירה במשך 5 דקות ב RT לlyse hemocytes.
  4. Reweigh הצינור עם hemolymph ולקבוע את המשקל של hemolymph חילוץ.
  5. בצע עשרה דילולים סדרתי של פי hemolymph בתקשורת AYE סטרילי.
  6. באמצעות עט, לחלק את הבסיס של צלחת CYE לשישה מגזרים ותווית שווים.
  7. שלוש טיפות צלחת 25 μl של כל דילול (מתחילות עם רוב לדלל) בכל קטע של הצלחת.
  8. דגירה הצלחות עם העפעפיים עליון לילה בשעה 37 ° C.
  9. ברגע שהטיפין התייבשו לחלוטין, להפוך את הצלחת שוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס לפחות עוד יומיים.
  10. לכמת את החיידקים שחולצו על ידי ספירת המושבות בכל דילול ולנרמל למשקל של hemolymph חילוץ.

10. קביעת המדד התחרותי (CI)

  1. ודא ששני הזנים גדלים באותה המידה גם בתרבות במרק ועל prio צלחות אגר CYEr לניסיון המדד התחרותי.
  2. הכן השעיות חיידקים מוטנטים עמידות WT או kanamycin כאמור בסעיף 1 ולערבב ביחס של 1:1.
    1. דילולים סדרתי צלחת של הבידוד על spectinomycin CYE (100 מיקרוגרם / מיליליטר) וCYE spectinomycin / kanamycin
  3. להדביק זחלים וhemolymph תמצית בנקודות זמן מתאימים כפי שתואר לעיל.
  4. לקבוע ספירות קיימא על ידי מיצוי hemolymph וציפוי דילולים סידוריים על גבי spectinomycin CYE וCYE spectinomycin / kanamycin.
  5. לחשב את המדד התחרותי (CI) באופן הבא: CI = (פלט מוטציה / פלט WT) / (הבידוד מוטציה / הבידוד WT).

תוצאות

הנה הוא הוכיח כי ג mellonella הוא מודל מתאים, קל לשימוש ללימודי L. זיהום pneumophila. בעבר זה כבר הראה כי L. ארסיות pneumophila במקרופאגים, אמבות ומודלים של יונקים תלויה בנוכחות של מערכת הפרשת דוט / ICM 41-43. ג זחלי mellonella נדבקו כפי שתוארו לעיל והארסיות של הסוג בר (WT) ומתח דוט / ICM לקוי בהשוואה. זיהום עם 10 7 CFU של L. 130b מתח pneumophila הביא לתמותת 100% בתוך 24 הודעה hr זיהום (PI). עם זאת, ל ' זן pneumophila Δ Dota, שאין לה מערכת הפרשת דוט / ICM T4SS פונקציונלית, היה לא אלים בassay זה (איור 1). זה מוכיח כי ל ' ארסיות pneumophila בג mellonella תלויה בטרנסלוקציה של effectors דוט / ICM, מה שהופך את המודל הזה מתאים לאפיון שלתפקודם של החלבונים האלה.

לאחרונה, זה היה הראה כי עיכוב של phagocytosis על ידי טיפול cytochalasin מוגבר susceptibly של הזחלים לזיהום על ידי קנדידה אלביקנס שמרים 6. כL. pneumophila הוא פתוגן תאיים, הוחלט לקבוע אם ספיגה של החיידקים היא מכרעת בפתוגנזה שלה במודל זה. הזחלים טופלו קודם לכן ב10 μl של 100 מיקרומטר Cytochalasin D (סיד) במשך 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס, אז נדבק ב10 7 CFU של WT ל 130b pneumophila והתמותה במעקב ב24 טיפול pi שעה עם המעכב לבד לא השפיעו על הישרדות זחל. עם זאת, זחלי pretreated, נגועים מוצג הישרדות גבוהה יותר באופן משמעותי (P = 0.0066, מבחן t מזווג) בהשוואה ל, חרקים נגועים טופלו DMSO (איור 2). ההשפעה של טיפול סיד בוטלה על ידי pi 48 שעה (תוצאות לא מוצגות), זה יכול להיות בגלל זמן מחצית החיים של התרופה בגmellonella. זה מוכיח שספיגתו של ל ' pneumophila לג hemocytes mellonella הוא היבט חיוני של ארסיות בקטריאלי.

על מנת לאמת את הביטוי ולקבוע את לוקליזציה subcellular של חלבון מפעיל בג mellonella, hemocytes הופק ועובד למיקרוסקופיה immunofluorescence. זחלים היו נגועים בWT וΔ Dota ל 130b pneumophila לבטא שבר של מפעיל המוגדר היטב T4SS, SidC 41-918, התמזגו 4 תגי HA N-מסוף. מפעיל זה הודגם להיקשר LCV באמצעות תחום phosphoinositide-4-מחייב פוספט 44. שימוש באנטי HA (אדום) ואנטי הלגיונלה נוגדנים (ירוקים), 4HA-SidC 41-918 מקומי לLCV בhemocytes הנגוע (איור 3). לוקליזציה זו יש בעבר הוכח בdiscoideum האמבות Dictyostelium ובמקרופאגים יונקים 44,45 מאשרים את גomparability של מודל זה.

החשיבות של חלבונים לארסיות נקבעה בדרך כלל על ידי השוואת קינטיקה הצמיחה של סוג בר וחיידקים שעברו מוטציה. על מנת לעקוב קינטיקה שכפול החיידקים במהלך הזיהום, שלושה זחלים הוקרבו בכל נקודת זמן (0, 5, 18, ו24 pi hr), hemolymph שנאסף ונקווה וCFU/0.1g של hemolymph חולץ נקבע. לאחר טבילה ראשונית ב5 pi שעה, CFU של חיידקי WT מגדילה עד 24 pi שעה לעומת זאת, מתח Δ Dota עובר שום שכפול ומנוקה ב18 pi שעה (איור 4).

היכולת של L. pneumophila לגרום תמוגה של מקרופאגים באופן T4SS תלוי תועד ארוך 46, עם זאת אין מחקרים דומים בוצעו in vivo. הריכוז של hemocytes במחזור נקבע בבית 5, 18, ו24 pi שעה זחלים היו נגועים בWT או Δ 130b pneumophila Dota ל', hemocytes מופק חרקים נגועים ותאי קיימא נספרים בשיטת הרחקת trypan הכחולה. בשעת 5 pi שעה אין הבדל בספירת hemocyte בין הזנים ניתן היה לראות (איור 5). עם זאת, ב18 pi שעה חלה ירידה משמעותית בריכוז hemocyte ב WT, אבל לא Δ Dota, זחלים נגועים. הבדל זה נמשך ב24 pi שעה הירידה במספר hemocyte, בשילוב עם הנוכחות של חיידקים תאיים כפי שניתן לראות על ידי immunofluorescence, עולה כי ל ' pneumophila משכפל בתוך hemocytes אז lyses, ומאפשר לחיידקים לעבור כמה סיבובים של שכפול.

figure-results-1
איור 1. זיהום עם L. pneumophila גורם דוט / ICM תלוי תמותת זחל. 10 זחלים היו נגועים עם PBS לבד או 10 7 CFU של סוג בר (WT) או 130b pneumophila Δ Dota ל ', טופח על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 72 וזמן מוות של הזחלים שנרשמו. כל הזחלים נגועים בWT נכנעו לזיהום תוך 24 הודעה hr זיהום (PI), עם זאת אין תמותה הייתה לראות בזחלים מחוסן עם PBS לבד או זן Δ Dota. תוצאות הן הממוצעים של שלושה ניסויים נפרדים, ± סטיית תקן.

figure-results-2
איור 2. תמותה היא תלויה בהפנמת חיידקים. 10 L. pneumophila זחלים טופלו קודם לכן ב10 μl של 100 מיקרומטר Cytochalasin D (סיד) במשך 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס ואז נדבקו ב10 7 WT ותמותה במעקב בזחלי pretreated 24 pi שעה הפגינו באופן משמעותי (P = 0.0066, מבחן t מזווג) מופחת תמותה. תוצאות מייצגות את מאהn של בארבעה ניסויים עצמאיים ± סטיות תקן עם 10 זחלים לכל מצב.

figure-results-3
איור 3. ההדמיה Immunofluorescence של חלבוני מפעיל בhemocytes חילוץ. hemocytes הוצאו מזחלים נגועים בL. pneumophila 130b WT או Δ Dota להביע 4HA-SidC 41-918 ב5 תאי pi שעה הוכתמו באמצעות אנטי HA (אדום) ואנטי הלגיונלה נוגדנים (ירוקים) וכתם DAPI ה-DNA (כחול) כדי להמחיש את הגרעינים. 4HA-SidC 41-918 נצפו WT שמסביב, אך לא Δ Dota, חיידקים. בר סולם 5 מיקרומטר.

figure-results-4
איור 4. L. pneumophila משכפל בתוך ג מלונלה באופן דוט / ICM תלוי. זחלים היו נגוע בpneumophila WT או Δ Dota ל 'ו ב 0, 5, 18, ​​ו24 pi שעה hemolymph משלושה חרקים נגועים יקוו, מצופות על צלחות CYE ו CFU נחוש ו מנורמל לבידוד ולמשקל של hemolymph חילוץ. WT L. pneumophila המשוכפל במהלך הניסוי ואילו זן Δ Dota נוקה בתוך 18 תוצאות pi hr הם הממוצע של שלושה ניסויים נפרדים ± סטיית תקן.

figure-results-5
איור 5. זיהום עם WT L. תוצאות pneumophila בהרס hemocyte משמעותי. hemocytes חולצו בשעה 5, 18, ​​ו24 pi שעות מזחלים נגוע בpneumophila WT או Δ Dota ל 'ותאי קיימא נספרים באמצעות hemocytometer. לא נמצא הבדל במספר התאים נתפס בשעה 5 pi שעה בין הזנים עם זאת ב18 pi שעה רק כ 15% מhemocytes להישאר בזחלים נגועים בזן WT בהשוואה לזן Δ Dota. תוצאות הן הממוצעים של שלושה ניסויים נפרדים, ± סטיית תקן.

דיון

מודל זחל mellonella הגלריה לזיהום הלגיונלה pneumophila הוא כלי שימושי עבור במחקרי vivo של פתוגנזה. כאן הוא הראה כי מספר ההיבטים של זיהום מקרופאג יכול להיות סכם בג מודל mellonella, כולל התפקיד של T4BSS דוט / ICM בארסיות ושכפול חיידקים והלוקליזציה של דוט / ICM-מפעיל SidC. בנוסף, אנו מדגימים כי מעכבי כימיים של פילמור אקטין מפחית באופן משמעותי את תמותת זחל, מחקה תוצאות שהתקבלו בmacophages 47 וראיות תומכות שהפנמה של החיידקים נדרשה לגרום לתמותת זחל. בעבר, זה כבר הוכיח כי הווריאציות בארסיות בין L. זני pneumophila ראו במודלים של זיהום אחרים ניתן לאמת בג mellonella ואינדוקציה של גורמים ארסי בשלב צמיחת פוסט מעריכי נדרשים לארסי חיידקים 36, המאשר כי ג mellonella הוא מודל מתאים לL. זיהום pneumophila.

קביעת CFU של L. pneumophila מזחלים נגוע גם ביחידים או בזיהומים מעורבים מגדיל מאוד את התועלת של המודל. בעבר, מספר גורמים כבר גילו שיש להם השפעות עדינות על שכפול חיידקים במודלים של אחד או יותר של זיהום 29,48-51. למרות שהזחלים אינם בעלי מערכת חיסונית אדפטיבית, הנוכחות של התגובה החיסונית המולדת מספקת מבחר חזק יותר בהשוואה למקרופאגים לבד, אשר עשוי לשמש כדי להגביר פנוטיפים עדינים. לכן, לא מן הנמנע כי, בעוד זנים אלה כנראה לא משפיעים על תמותת זחל באופן משמעותי, הם עשויים להפגין ירידת שכפול או כושר חיידקים בג מודל mellonella. כמו גם שכפול של L. pneumophila בזחלים, הראינו דלדול hemocyte משמעותי בשלב מאוחר בזיהום. כL.pneumophila צפוי lyse תאי מארח בסוף מחזור השכפול שלו, מדידת דלדול hemocyte גם יכול לשמש כמדידה עקיפה של שכפול בקטריאלי. דלדול Hemocyte כבר בעבר בקורלציה עם תמותת חרקים בזיהום 3,52, למרות התוצאות האחרונות מצביעות על כך שהתמונה הזאת היא יותר מורכבת מbelived 37 ראשון. לאחרונה, זה כבר הראה כי רעב של זחלים גורם לרגישות מוגברת לזיהום דרך דיכוי תגובות חיסוניים 53. במבחנים שתוארו כאן, זחלים לא האכילו במשך תקופת המחקר ולא ידוע כמה טוב זחלי הפד יגיבו לL. זיהום pneumophila.

אחד היתרונות של ג mellonella כאורגניזם מודל הוא הקלות של מיצוי וכימות של hemocytes מזחלים נגועים. קטעי וידאו קודמים הראו שיטות שונות לhemocytes חילוץ מחרקים 54,55 לעומת זאת, פגשוהוד שהוצג כאן הוא פשוט ומתאים לעיבוד מיידי. חולצו ברגע, hemocytes ניתן לכמת בקלות, המשמש לimmunofluorescence, מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים 36 או cytometry זרימה 56 או מתורבת ונגוע לשעבר vivo 3 המאפשר את התגובה של התאים לזיהום להיחקר בפירוט. זה מגדיל באופן משמעותי את הגמישות של המודל. אזהרה אחת לImmunofluorescence בג mellonella הוא ההיצע המוגבל של נוגדנים תוקף נגד G. חלבוני mellonella. עם זאת, מחקרים הוכיחו את יצירת נוגדנים נגד חלבוני זחל 57 ונוגדנים כנגד חלבונים חיסוניים הקשורים אדם נמצאו להכיר G. חלבוני mellonella 11 מדגימים את הפוטנציאל לimmunofluorescence על G. hemocytes mellonella.

קלות G. זיהום mellonella מאפשר למסכים מהירים, בינוניים תפוקה שיכוליםלהשתמש בהם כדי להשוות את הארסיות של מיני הלגיונלה שונים וזנים ויכולים לשמש כדי לנתח עוד גורמים ארסי זוהו בעבר כגון מולקולות הדבקות 58 או מערכת מהסוג 2 ההפרשה 59 אשר נדרשות לארסיות בדגמים אחרים. בנוסף, שימוש במודל זה יאפשר זיהוי ואפיון נוסף של גורמים ארסי רומן כוללים חלבונים מופרשים מפעיל וtranslocated. לאחרונה, זה כבר הראה כי פעילות C פוספוליפאז של L. יש pneumophila תפקיד בג ארסיות mellonella 60 וכי חלבון מפעיל דוט / ICM SdhA נדרש לארסיות 37. בנוסף, יש לנו הוכיחו לאחרונה כי קיים מתאם בין פנוטיפים נצפו בג mellonella ובזן העכבר / J 37.

זה מדגיש את הערך של כלי זה כדי להשלים protozoan סביבתית ומארח וmuri חד תאייםמודלים זיהום ne. ג מודל mellonella יהיה עוד יותר יקר בעתיד, לאחר שהרצף הגנומי הזחל יהיה זמין וכלים גנטיים יותר מבוססים. צעדים בכיוון זה כוללים את הפרסום האחרון המפרט את transcriptome הקשורות לחיסון 61 וההיווצרות של יוזמה לקידום להשתקת גנים בspp הפרפרים 62.

באמצעות ג זחלי mellonella, יש לנו מספר הקריאות פשוטות, מהירה של ארסי חיידקים שיכולים לשמש כדי לחקור פתוגנזה של L. pneumophila. הקמתה של מבחני אלה והקרנה רחבה יותר של L. זני pneumophila וserogroups יגדילו את התועלת של הכלי החדש הזה ויתרמו להבנה שלנו ל ' פתוגנזה pneumophila.

גילויים

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

CR הרדינג נתמכה על ידי מלגת לימודי WT086724 Wellcome Trust.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומר/ציודACES
תמצית שמרים (AYE) מרק4 גרם ACES, 4 גרם תמצית שמרים, 0.4 גרם α-קטוגלוטראט, pH 6.9, 400 מ"ל H2O, אוטוקלאב, 4 מ"ל תמיסת ברזל*, 4 מ"ל תמיסת ציסטאין*
*הוסף מרכיבים סטריליים לאחר חיטוי
צלחותתמצית שמרים בופר פחם (CYE)כאמור לעיל, בתוספת של 0.6 גרם פחם פעיל ו-6 גרם אגר
תמיסת ברזל סטרילית (ברזל פירופוספט)SigmaP6526תמיסת 0.6 מ"מ,
תמיסת ציסטאין סטריליתסיגמאC78803.3 מ"מ, תמיסת מלונלה סטרילית מסוננת
G. מלונלה (תולעי שעווה)Livefood UKW250
אנטי-HA-טטרמתיל רודמין איזותיוציאנט ( TRITC)SigmaH9037
Anti-Legionella LPSCambridge BiosciencesPA1-7227
Anti-Rabbit IgG Alexa488Jackson Immunoreach711-485-152
איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)SigmaI6758
Dulbeccos phosphate buffered salt (D-PBS)SigmaD8662
ParaformaldehydeAgar ScientificR1026
אמוניום כלוריד (NH4Cl)SigmaA9434
תמיסת טריפן כחולהSigmaT8154
DigitoninSigmaD141
Cytochalasin DBiomol InternationalBML-T109-0001
[header]
<חזק>חומר
מיקרוטיטר מזרקSigma24544
מונה תאים, כפול, משופר Neubauer VWR631-0926
צנטריפוגהללוחות צנטריפוגה
מיקרוסקופ פלואורסצנטיכל מיקרוסקופ עם מסננים מתאימים לפלואורופורים
מיקרוסקופלספירת תאים בת קיימא
כפפה חסינת ניקובעור
מסוננת הנדרשים הפוך צב

מקורות

  1. Olsen, R. J., Watkins, M. E., Cantu, C. C., Beres, S. B., Musser, J. M. Virulence of serotype M3 Group A Streptococcus strains in wax worms (Galleria mellonella larvae. Virulence. 2, 111-119 (2011).
  2. Jander, G., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Positive correlation between virulence of Pseudomonas aeruginosa mutants in mice and insects. J. Bacteriol. 182, 3843-3845 (2000).
  3. Mukherjee, K., et al. Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Appl. Environ. Microbiol. 76, 310-317 (2010).
  4. Mowlds, P., Barron, A., Kavanagh, K. Physical stress primes the immune response of Galleria mellonella larvae to infection by Candida albicans. Microbes Infect. 10, 628-634 (2008).
  5. Renwick, J., Daly, P., Reeves, E. P., Kavanagh, K. Susceptibility of larvae of Galleria mellonella to infection by Aspergillus fumigatus is dependent upon stage of conidial germination. Mycopathologia. 161, 377-384 (2006).
  6. Banville, N., Fallon, J., McLoughlin, K., Kavanagh, K. Disruption of haemocyte function by exposure to cytochalasin b or nocodazole increases the susceptibility of Galleria mellonella larvae to infection. Microbes Infect. 13, 1191-1198 (2012).
  7. Mowlds, P., Kavanagh, K. Effect of pre-incubation temperature on susceptibility of Galleria mellonella larvae to infection by Candida albicans. Mycopathologia. 165, 5-12 (2008).
  8. Joyce, S. A., Gahan, C. G. Molecular pathogenesis of Listeria monocytogenes in the alternative model host Galleria mellonella. Microbiology. 156, 3456-3468 (2010).
  9. Mak, P., Zdybicka-Barabas, A., Cytrynska, M. A different repertoire of Galleria mellonella antimicrobial peptides in larvae challenged with bacteria and fungi. Dev. Comp. Immunol. 34, 1129-1136 (2010).
  10. Lavine, M. D., Strand, M. R. Insect hemocytes and their role in immunity. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1295-1309 (2002).
  11. Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infect. Immun. 73, 4161-4170 (2005).
  12. Ratcliffe, N. A., Gagen, S. J. Studies on the in vivo cellular reactions of insects: an ultrastructural analysis of nodule formation in Galleria mellonella. Tissue Cell. 9, 73-85 (1977).
  13. Fraser, D. W., et al. Legionnaires' disease: description of an epidemic of pneumonia. N. Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
  14. Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
  15. Fields, B. S. The molecular ecology of legionellae. Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).
  16. Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).
  17. Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).
  18. Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
  19. Zhu, W., et al. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS One. 6, e17638(2011).
  20. Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLoS Pathog. 5, e1000508(2009).
  21. Horwitz, M. A. The Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) inhibits phagosome-lysosome fusion in human monocytes. J. Exp. Med. 158, 2108-2126 (1983).
  22. Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect. Immun. 63, 3609-3620 (1995).
  23. Segal, G., Shuman, H. A. Legionella pneumophila utilizes the same genes to multiply within Acanthamoeba castellanii and human macrophages. Infect. Immun. 67, 2117-2124 (1999).
  24. Brieland, J., et al. Replicative Legionella pneumophila lung infection in intratracheally inoculated A/J mice. A murine model of human Legionnaires' disease. Am. J. Pathol. 145, 1537-1546 (1994).
  25. Baskerville, A., Fitzgeorge, R. B., Broster, M., Hambleton, P., Dennis, P. J. Experimental transmission of legionnaires' disease by exposure to aerosols of Legionella pneumophila. Lancet. 2, 1389-1390 (1981).
  26. Wright, E. K., et al. Naip5 affects host susceptibility to the intracellular pathogen Legionella pneumophila. Curr. Biol. 13, 27-36 (2003).
  27. Padilla-Carlin, D. J., McMurray, D. N., Hickey, A. J. The guinea pig as a model of infectious diseases. Comp. Med. 58, 324-340 (2008).
  28. Komura, T., Yasui, C., Miyamoto, H., Nishikawa, Y. Caenorhabditis elegans as an alternative model host for Legionella pneumophila, and protective effects of Bifidobacterium infantis. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4105-4108 (2011).
  29. Kubori, T., Shinzawa, N., Kanuka, H., Nagai, H. Legionella metaeffector exploits host proteasome to temporally regulate cognate effector. PLoS Pathog. 6, e1001216(2010).
  30. Abu Kwaik, Y. The phagosome containing Legionella pneumophila within the protozoan Hartmannella vermiformis is surrounded by the rough endoplasmic reticulum. Appl. Environ. Microbiol. 62, 2022-2028 (1996).
  31. Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).
  32. Solomon, J. M., Rupper, A., Cardelli, J. A., Isberg, R. R. Intracellular growth of Legionella pneumophila in Dictyostelium discoideum, a system for genetic analysis of host-pathogen interactions. Infect. Immun. 68, 2939-2947 (2000).
  33. Hilbi, H., Weber, S. S., Ragaz, C., Nyfeler, Y., Urwyler, S. Environmental predators as models for bacterial pathogenesis. Environ. Microbiol. 9, 563-575 (2007).
  34. Khoa, D. B., Trang, L. T., Takeda, M. Expression analyses of caspase-1 and related activities in the midgut of Galleria mellonella during metamorphosis. Insect Mol Biol. 21, 247-256 (2012).
  35. Brassinga, A. K., et al. Caenorhabditis is a metazoan host for Legionella. Cell Microbiol. 12, 343-361 (2011).
  36. Harding, C. R., et al. Legionella pneumophila pathogenesis in the Galleria mellonella infection model. Infect. Immun. 80, 2780-2790 (2012).
  37. Harding, C. R., et al. The Dot/Icm effector SdhA is necessary for virulence of Legionella pneumophila in Galleria mellonella and A/J mice. Infect. Immun. 81, 10-1128 (2013).
  38. Byrne, B., Swanson, M. S. Expression of Legionella pneumophila virulence traits in response to growth conditions. Infect. Immun. 66, 3029-3034 (1998).
  39. Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis. J. Vis. Exp. , e4392(2012).
  40. Suter, T. M., Viswanathan, V. K., Cianciotto, N. P. Isolation of a gene encoding a novel spectinomycin phosphotransferase from Legionella pneumophila. Antimicrob. Agents Chemother. 41, 1385-1388 (1997).
  41. Hilbi, H., Segal, G., Shuman, H. A. Icm/dot-dependent upregulation of phagocytosis by Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 42, 603-617 (2001).
  42. Watarai, M., et al. Legionella pneumophila is internalized by a macropinocytotic uptake pathway controlled by the Dot/Icm system and the mouse Lgn1 locus. J. Exp. Med. 194, 1081-1096 (2001).
  43. Santic, M., Asare, R., Doric, M., Abu Kwaik, Y. Host-dependent trigger of caspases and apoptosis by Legionella pneumophila. Infect. Immun. 75, 2903-2913 (2007).
  44. Weber, S. S., Ragaz, C., Reus, K., Nyfeler, Y., Hilbi, H. Legionella pneumophila exploits PI(4)P to anchor secreted effector proteins to the replicative vacuole. PLoS Pathog. 2 (4), e46(2006).
  45. Luo, Z. Q., Isberg, R. R. Multiple substrates of the Legionella pneumophila Dot/Icm system identified by interbacterial protein transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 841-846 (2004).
  46. Alli, O. A., et al. Temporal pore formation-mediated egress from macrophages and alveolar epithelial cells by Legionella pneumophila. Infect. Immun. 68, 6431-6440 (2000).
  47. Elliott, J. A., Winn, W. C. Treatment of alveolar macrophages with cytochalasin D inhibits uptake and subsequent growth of Legionella pneumophila. Infect. Immun. 51, 31-36 (1986).
  48. Cirillo, S. L., Yan, L., Littman, M., Samrakandi, M. M., Cirillo, J. D. Role of the Legionella pneumophila rtxA gene in amoebae. Microbiology. 148, 1667-1677 (2002).
  49. Ridenour, D. A., Cirillo, S. L., Feng, S., Samrakandi, M. M., Cirillo, J. D. Identification of a gene that affects the efficiency of host cell infection by Legionella pneumophila in a temperature-dependent fashion. Infect. Immun. 71, 6256-6263 (2003).
  50. Samrakandi, M. M., Cirillo, S. L., Ridenour, D. A., Bermudez, L. E., Cirillo, J. D. Genetic and phenotypic differences between Legionella pneumophila strains. J. Clin. Microbiol. 40, 1352-1362 (2002).
  51. Lomma, M., et al. The Legionella pneumophila F-box protein Lpp2082 (AnkB) modulates ubiquitination of the host protein parvin B and promotes intracellular replication. Cell. Microbiol. , (2010).
  52. Champion, O. L., et al. Galleria mellonella as an alternative infection model for Yersinia pseudotuberculosis. Microbiology. 155, 1516-1522 (2009).
  53. Banville, N., Browne, N., Kavanagh, K. Effect of nutrient deprivation on the susceptibility of Galleria mellonella larvae to infection. Virulence. 3, 497-503 (2012).
  54. Qayum, A. A., Telang, A. A protocol for collecting and staining hemocytes from the yellow fever mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. , e2772(2011).
  55. Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. J. Vis. Exp. , e4173(2012).
  56. Garcia-Garcia, E., Garcia-Garcia, P. L., Rosales, C. An fMLP receptor is involved in activation of phagocytosis by hemocytes from specific insect species. Dev. Comp. Immunol. 33, 728-739 (2009).
  57. Bogus, M., Scheller, K. Allatotropin released by the brain controls larval molting in Galleria mellonella by affecting juvenile hormone synthesis. Int. J. Dev. Biol. 40, 205-210 (1996).
  58. Chang, B., Kura, F., Amemura-Maekawa, J., Koizumi, N., Watanabe, H. Identification of a novel adhesion molecule involved in the virulence of Legionella pneumophila. Infect. 73, 4272-4280 (2005).
  59. Cianciotto, N. P. Many substrates and functions of type II secretion: lessons learned from Legionella pneumophila. Future Microbiol. 4, 797-805 (2009).
  60. Aurass, P., et al. The Legionella pneumophila Dot/Icm-secreted effector PlcC/CegC1 together with PlcA and PlcB promotes virulence and belongs to a novel zinc metallophospholipase C family present in bacteria and fungi. J. Biol. Chem. , (2013).
  61. Vogel, H., Altincicek, B., Glockner, G., Vilcinskas, A. A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella. BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).
  62. Terenius, O., et al. RNA interference in Lepidoptera: an overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. J. Insect. Physiol. 57, 231-245 (2011).

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מיצוי המולימפהמיקרוסקופיה של אימונופלורסצנציהכימות CFUשכפול חיידקימודל זיהוםמערכת הפרשה מסוג IVניתוח המוציטיםהערכת חוליות (Virulence)
שימוש
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.