ניתוח וידאומורפומטרי של Vasoconstriction ריאתי היפוקסי של עורקים תוך ריאתי באמצעות מוריס דיוק לחתוך פרוסות ריאות

סיכום

איזוקונסטריאקציה ריאתי היפוקסית (HPV) היא תופעה פיזיולוגית חשובה שבאמצעותה ב זלוף ריאות היפוקסיה מכתשי מותאם אוורור. מגזר כלי הדם העיקרי התורם ל- HPV הוא העורק התוך-אציני. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו לניתוח של HPV של כלי ריאות מורין עם קטרים של 20-100 מיקרומטר.

תקציר

היפוקסיה מכתשית חריפה גורמת vasoconstriction ריאתי (HPV) - הידוע גם בשם פון אוילר-Liljestrand מנגנון - אשר משמש כדי להתאים זלוף ריאות לאוורור. עד כה, המנגנונים הבסיסיים אינם מובנים במלואם. מגזר כלי הדם העיקרי התורם ל- HPV הוא העורק התוך-אציני. סעיף כלי זה אחראי על אספקת הדם של acinus בודדים, אשר מוגדר כחלק של דיסטל ריאות לסימפונות סופני. עורקים תוך-אצינריים ממוקמים בעיקר בחלק זה של הריאה שלא ניתן להגיע אליו באופן סלקטיבי על ידי מספר טכניקות נפוצות כגון מדידת לחץ עורק הריאה בריאות מבודדות או הקלטות כוח ממקטעי עורק ריאה פרוקסימליים מנותחים^1,2. הניתוח של כלי subpleural על ידי מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית בזמן אמת מוגבל לכלי עם עד 50 מיקרומטר בקוטר³.

אנו מספקים טכניקה ללמוד HPV של עורקים תוך ריאתי מורין בטווח של 20-100 מיקרומטר קטרים פנימיים. הוא מבוסס על ניתוח וידאומורפומטרי של עורקים חתוכים בפרוסות ריאות חתוכות דיוק (PCLS). שיטה זו מאפשרת מדידה כמותית של vasoreactivity של עורקים פנים-acinar קטנים עם קוטר פנימי בין 20-40 מיקרומטר אשר ממוקמים ב gussets של ספטה מכתשית ליד תעלות מכתשיות של עורקים לפני acinar גדול יותר עם קטרים פנימיים בין 40-100 מיקרומטר אשר פועלים סמוך ברונכי ברונכיולים. בניגוד להדמיה בזמן אמת של כלי תת-חלל בעכברים מורדמים ומאווררים, ניתוח וידאומורפומטרי של PCLS מתרחש בתנאים ללא לחץ גזירה. במודל הניסיוני שלנו שני מקטעי העורקים מציגים HPV מונופאזי כאשר הם נחשפים לגז בינוני עם 1% O₂ והתגובה נמוגה לאחר 30-40 דקות בהיפוקסיה.

מבוא

ברוב מיטות כלי הדם המערכתיים היפוקסיה גורמת vasodilatation, בהשוואה vasoconstriction הנגרמת על ידי היפוקסיה בכלי הדם ריאתי. תגובה ספציפית לריאות זו להורדת מתח החמצן נקראת vasoconstriction ריאתי היפוקסי (HPV), מתחיל בתוך שניות ומתהפך במהירות לאחר מעבר לאוורור נורמוקסי. למרות HPV ידוע במשך יותר מ 60 שנים, חיישני חמצן הסלולר(s) ואת מפל איתות(s) וכתוצאה מכך vasoconstriction עדיין נמצאים בדיון. יש הסכמה רחבה יחסית כי היפוקסיה עוררה redox ושינויים ROS חיוניים עבור HPV ופיתוח יתר לחץ דם ריאתי (נבדק סילבסטר ואח '. ⁴ ושומאקר ואח '. ⁵). הנתונים שלנו תומכים בתפקיד מרכזי של COMPLEX II של שרשרת הנשימה המיטוכונדרית ב- HPV^6,7. לאחרונה, וואנג ואח '. הציגו מושג חדש לחלוטין עבור חישת חמצן HPV: בהתבסס על הנתונים שלהם הם מציעים כי היפוקסיה מכתשית הוא חש על ידי נימים סמוכים גורם depolarization קרום של תאי האנדותל. התגובה מופצת באמצעות צמתים קונקסיון 40 פער של תאי אנדותל המוביל התכווצות של תאי שריר חלקים של arterioles במעלה הזרם⁸.

עורקי הריאה פועלים לצד דרכי הנשימה, מסתעפים איתם, מקטיןים ללא הרף את קוטרם, ולבסוף מספקים דם למערכת נימי הממוקמת בקירות מכתש. זרימת עורקים זו מורכבת ממקטעים נפרדים מבחינה אנטומית ותפקודית. עורקי הצינור הפרוקסימליים, המאופיינים בשפע של סיבים אלסטיים בקירות, מלווים בעורקים תוך-ריאתי שריריים לחלוטין השולטים במידה רבה בהתנגדות כלי הדם הריאה. צעד אחר צעד, העורקים האלה עוברים למקטעים שבהם שכבת השריר הופכת ללא שלמה, ולבסוף כלי הדם נקיים מתאים חיסוניים חלקים בשרירים. העורק התוך-סינארי המאכיל אצינוס ריאתי בודד בדם מייצג קטע שרירי חלקית⁶. כמו כן, מערכת עורקי הריאות אינה מייצגת מבנה אחיד לגבי התגובה ההיפוקסית, אך מציגה מגוון אזורי מסומן^9,10. לדוגמה, בעורקי ריאות פרוקסימליים מבודדים מריאות חולדה היפוקסיה גורם לתגובה biphasic, המציג התכווצות מהירה ראשונית של משך זמן קצר אשר - לאחר הרפיה חלקית - ואחריו התכווצות איטית שנייה אך מתמשכת¹¹. בעורקי התנגדות מבודדים מפרנצ'ימה ריאות חולדה כמו חלוקה רביעית וחמישית של עורקי ריאות (קוטר חיצוני <300 מיקרומטר), היפוקסיה גורמת התכווצות מונופאזית⁹. כבר בשנת 1971 גלזייר ומורי הגיעו למסקנה ממדידות של שינויים בריכוז תאי הדם האדומים נימי בריאות של כלבים מאווררים בתערובות גז היפוקסי כי הגידול היפוקסיה הנגרמת על ידי התנגדות כלי הדם התרחשה בעיקר במעלה הזרם של נימים¹². כיום, מיקרוסקופיה תוך-וורידית של ריאות שלמות של עכברים מורדמים ומאווררים מכנית מייצגת כלי רב עוצמה לניתוח המיקרו-וסקולטורה הריאתית^13,14. כריתת חלון עגול בקיר בית החזה מעניקה גישה מיקרוסקופית לפני השטח של הריאה ומאפשרת ניתוח של כלי ריאות תת-פלורליים בקוטר של עד 50 מיקרומטר. על ידי שילוב טכניקה זו עם עירוי של FITC-dextran, Tabuchi ואח '. הראה כי רק arterioles בגודל בינוני עם קטרים של 30-50 מיקרומטר התערוכה תגובה ניכרת היפוקסיה אשר נמשך על פני תקופה של 60 דקות עם הנחתה קלה לאחר 30 דקות. לעומת זאת, עורקים קטנים עם קטרים של 20-30 מיקרומטר הראו רק תגובה מינורית להיפוקסיה³. עם זאת, טכניקה זו אינה מאפשרת ניתוח של עורקים בקוטר גדול יותר כי 50 מיקרומטר מאז כלי אלה ממוקמים עמוק מדי ברקמת הריאה.

על מנת לגשר על הפער בניתוח של עורקי ריאות גדולים וקטנים מאוד (כגון כלי תת-חלל) של ריאות מורין, אימצנו שיטה שתוארה על ידי מרטין ואח '. לניתוח התגובה של דרכי הנשימה¹⁵. בהתבסס על טכניקת החדרת ג'ל אגרוז, זה מקל על הכנת פרוסות ריאות לחתוך דיוק (PCLS) מאיבר רך יחסית זה אלסטי. בתוך vasoreactivity PCLS של העורקים חתך עם קוטר פנימי בין 20-100 מיקרומטר ניתן לראות ישירות על ידי videomicroscopy. יישום של תרופות במהלך הדגירה היפוקסית של PCLS מאפשר ניתוח של ההשפעות שלהם על HPV. יש חשיבות מיוחדת כי טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם על עכבר מהונדס גנטית. בהתבסס על מיקומם בתוך הריאה, אנו מסווגים את העורקים ככלי טרום ותוך אצ'יניאר, עם קטרים פנימיים של 20-40 מיקרומטר ו 40-100 מיקרומטר, בהתאמה. תחת מבט פונקציונלי העורק התוך-אצינרי מספק אצינוס ריאתי בודד עם דם ואת העורק טרום acinar הוא קטעי כלי הקודם. הקלטת תמונות במצלמה דיגיטלית מאפשרת כימות הבא של vasoreaction. תכונה ברורה של מודל PCLS זה היא חוסר גזירה מתח הפועל על אנדותל. לעומת זאת, בכלי perfused חריפה HPV מוביל לעלייה בלחץ גזירה ובכך גרימת מנגנונים משניים כגון NO RELEASE¹⁶. בנוסף, השימוש ב- PCLS מאפשר מדידות של HPV ללא השפעות עצביות או הורמונליות. בניגוד למערכות תרבית התאים, למשל מוכנות מתאי שריר חלקים עורקיים של כלבים¹⁷, הארכיטקטורה ההיסטולוגית של קיר הכלי נשמרת כמעט לחלוטין.

לסיכום, פרוטוקול זה מספק שיטה מועילה לניתוח חיישני חמצן מולקולריים פוטנציאליים ו/או מסלולים תאיים האחראים על HPV של עורקים תוך-ריאתיים עם קטרים פנימיים בין 20-100 מיקרומטר בתנאים ללא לחץ גזירה.

פרוטוקול

1. הכנת תערובות גז, ציוד, מכשירים ופתרונות

סעיף זה מתאר את הציוד וההגדרה הדרושים עבור הפרוטוקול. פרטים נוספים ופרטי יצרן ניתן למצוא בטבלה הנלווית.

1. להשיג או להכין את תערובות הגז הבאות:
   1. שני בקבוקים עם תערובת גז נורמוקסית המורכבים 21% O₂, 5.3% CO₂, 73.7% N₂.
   2. בקבוק אחד עם תערובת גז היפוקסי מורכב 1% O₂, 5.3% CO₂, 93.7% N₂.
2. אסוף את הציוד הבא:
   1. מיקרוגל, להמסת ההתעוררות.
   2. ארון חימום, לשטיפת ההתעוררות מחלקי הריאות (ראו להלן). הכנס צינור המחובר לבקבוק עם תערובת גז נורמוקסית לתוך הארון.
   3. ויברטום עם סכיני גילוח מתאימים, לחיתוך הריאות לפרוסות בעובי 200 מיקרומטר. זה יתרון אם vibratome מרוהט עם סט קירור כדי לקרר את החיץ באגן vibratome.
   4. תא עירוי-על זורם המותקן על מיקרוסקופ הפוך, לניתוח HPV של עורקים תוך-רמוניים.
      1. כדי להקל על קיבוע מקטעי הריאות לתחתית התא, חבר מיתרי ניילון לטבעת פלטינה (בנויה בעצמה). יש לצרף את תא הזלוף למשאבה פריסטלית עם קצב זרימה מותאם ל-0.7 מ"ל/דקה ו-6 מ"ל/דקה, בהתאמה.
      2. להרכיב את הציוד, כך במהלך הניסויים התקשורת מאוחסנים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס מבעבע עם גז נורמוקסי או היפוקסי באמצעות 21 G x 4 3/4 קנולס. בנוסף להשתמש בחיבור השני מבקבוק הגז כדי לאפשר תערובות גז נורמוקסי / היפוקסי להיות מוזן לתוך המרחב האווירי של תא זלוף. ודא כי כל הצינורות של מערכת זו הם גז הדוק.
   5. מצלמת CCD המותקנת על מיקרוסקופ הפוך זקוף כדי להקליט תמונות של העורק מנותח.
   6. הכינו את המכשירים הבאים:
      1. להכנת הריאות: סט ניתוח סטרילי הכולל מספריים מחוספסים ושני זוגות מלקחיים, מספריים עדינות לפתיחת החזה, מיקרוסיסור לחיתוך חור לקנה הנשימה למילוי הנגרוס, ותפירת כותנה (כ -20 ס"מ) לקשירת קנה הנשימה כדי למנוע זרימה של האגרוז.
      2. למילוי דרכי הנשימה עם agarose: לחבר מזרק 2 מ"ל לצינור פלסטיק גמיש של קנולה השוכן בעירוי (20 G x 1 1/4).
      3. עבור זלוף של הריאות עם חיץ: לתקן מזרק 50 מ"ל כמו מאגר חיץ על 40 ס"מ מעל מקום העבודה להכנת העכבר.
      4. לזרימת המאגר: חבר את המזרק לצינור שאליו מחוברת צינורית בגודל 25 G x 1. השתמש מהדק בצינור כדי להתאים את הזרימה על 1 טיפה / שניה (כ 0.3-0.4 מיליליטר / דקה).
   7. הכן את המאגרים והמדיה הבאים:
      1. הפוך 1,000 מ"ל HEPES-Ringer מאגר (10 mM HEPES, 136.4 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 1 mM MgCl₂•6H₂O, 2.2 mM CaCl₂•2H₂O, 11 מ"מ גלוקוז, pH 7.4). אחסן את המאגר המסוקר הסטרילי (גודל נקבובית של מסנן: 0.2 מיקרומטר) ב 4 מעלות צלזיוס.
   8. כ -30 דקות לפני תחילת הבידוד של הריאות להכין את הפתרונות הבאים:
      1. ממיסים 1.5% עם נקודת התכה נמוכה agarose במאגר HEPES-Ringer (נפח כולל 10 מ"ל) וממיסים אותו על ידי בישול במיקרוגל. לאחר מכן, לקרר אותו עד 37 מעלות צלזיוס על ידי אחסון בארון חימום. מחממים מראש את המזרק 2 מ"ל למילוי agarose לתוך דרכי הנשימה ריאתי.
      2. קח 20 מ"ל של חיץ HEPES-Ringer, להוסיף הפרין לריכוז הסופי של 250 I.U./ml, לחמם את החיץ ל 37 °C (69 °F). מיד לפני השימוש להוסיף נתרן ניטרופרוסיד לריכוז הסופי של 75 מיקרומטר. זה חיץ הזלוף לרוץ את הדם מן כלי הדם ריאתי.
      3. שים חיץ HEPES-Ringer 200 מל ב זכוכית ולאחסן אותו על קרח. חיץ זה יהיה נחוץ לקירור הריאות המבודדות מלאות agarose.
      4. למלא על 200 מל MEM בתוספת 1% פניצילין / סטרפטומיצין ב זכוכית ולאחסן אותו ב 37 מעלות צלזיוס בארון החימום. מבעבעים את המדיום עם תערובת גז נורמוקסית. זה ישמש להסרת agarose מחלקי הריאות.
      5. מחממים 2 בקבוקי MEM בתוספת 1% פניצילין/סטרפטומיצין באמבט מים עד 37 מעלות צלזיוס ומבעבעים אותם עם תערובת גז נורמוקסית והיפוקסית, בהתאמה, לפחות שעתיים לפני תחילת המדידות הוידאומורפומטריות. כ-250 מ"ל MEM יידרשו לכל מדידה.
   9. אסוף את החומרים הנוספים הבאים:
      1. 70% EtOH לחיטוי.
      2. פתרון מלאי של הפרין (25.000 I.U./5 מיליליטר), מאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס (ראה לעיל).
      3. פתרון מלאי של נתרן ניטרופרוסיד ללא תורם (Nipruss): 10 מ"מ ב- H₂O, מאוחסן בקרח (ראה לעיל).
      4. פתרון מלאי של thromboxane אנלוגי U46619: 10 מיקרומטר באתנול, מאוחסן על קרח.
      5. דבק-על.
      6. תפירת כותנה עבור קשירה של קנה הנשימה לאחר מילוי עם agarose.

2. בעלי חיים

השתמש בעכברים (למשל של הזן C57Bl6) משני המינים בגיל 10-25 שבועות. HPV יכול גם להיות מנותח זנים נוקאאוט ואת זנים סוג פראי המתאים.

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות ה-NIH לטיפול ולשימוש בבעלי חיים ניסיוניים, ואושרו על ידי הוועדים המוסדיים המקומיים.

3. בידוד של ריאות מורין והכנת פרוסות ריאות חתוכות דיוק (PCLS)

1. להרוג את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם. מיד לאחר ההרג, לעקר את משטח הגוף הגחוני עם 70% EtOH ולהשתמש במספריים מחוספס לחתוך את העור לאורך קו האמצע הגחוני מן הסנטר אל האגן.
   הערה: מאז ידוע כי הרדמה אינהלטיבית כגון איזופלורן יש השפעה על הטון כלי הדם^18,19, לא להשתמש בהרדמה נדיפה.
2. לאחר פתיחת חלל הבטן, מניחים את לולאות המעי בצד ומנתקים את כלי הבטן הגדולים לדימום. לאחר חדירת הסרעפת עם המספריים העדינים, הריאות יקרסו כתוצאה מכניסת אוויר לחלל. השתמש במספריים כדי לנתק את הסרעפת מצמצם בית החזה הנחות. חותכים את הצלעות ואת עצם הבריח לרוחב כדי להסיר את החלק הגחוני של כלוב לקרוע.
   הערה: חשוב כי הריאות אינן ניזוקו בשלב זה מאז נפיחות אחרת של הריאות עם agarose יהיה בלתי אפשרי! השתמש רק במכשירים סטריליים וכלי זכוכית במעבדה.
3. לפני תחילת זלוף של כלי הדם ריאתי, לחתוך חור קטן לתוך החדר השמאלי של הלב לפריקת החיץ. ממלאים את מאגר המזרק במאגר HEPES-Ringer חם (37 מעלות צלזיוס) המכיל הפרין ונתרן ניטרופרוסיד (חיץ זלוף) ומחלחלים לאט דרך החדר הימני.
   הערה: זלוף יעיל כאשר הריאות משנות את צבען מקבלות מראה לבן. בשלב זה חשוב להוסיף נתרן ניטרופרוסיד לתוך חיץ זלוף; זה מונע את העורקים טרום acinar לקרוע מן הרקמה שמסביב.
4. הסר את בלוטות הרוק, השרירים הקטנים ורקמת החיבור מקנה הנשימה. נתק את קנה הנשימה מרקמת החיבור שמסביב וכותנת תפירה חוט בין הוושט לקנה הנשימה עבור קשירה מאוחרת יותר.
5. השתמש microscissor לחתוך חור קטן לחלק העליון של קנה הנשימה בין שני סחוסים קנה הנשימה השכן. עכשיו להכניס את צינור פלסטיק גמיש של צינור IV השוכן דרך החור הקטן לתוך קנה הנשימה בזהירות לתקן את זה עם כותנה תפירה. ממלאים באיטיות את דרכי הנשימה בנקודת ההיתוך הנמוכה (37 מעלות צלזיוס). שימו לב לריאות: בהתחלה הריאה הימנית מתחילה להתרחב ואחריה הריאה השמאלית. המילוי הושלם כאשר שתי הריאות מנופחות לנפח דומה למצב in vivo (כ 1.2-2.0 מ"ל בהתאם למין, גיל ומשקל).
   הערה: אם רק ריאה אחת מתרחבת, ייתכן שצינור הפלסטיק הוכנס עמוק מדי כך שהגיע לברונכוס. במקרה הזה, צריך לשלוף את זה קצת. זכור כי agarose יתמצק כאשר הוא מתקרר בהדרגה.
6. כאשר הריאות מלאות, בו זמנית לשלוף את צינור הפלסטיק ו ligate קנה הנשימה עם כותנה תפירה כדי למנוע זרימה של agarose. לאחר מכן, חותכים את קנה הנשימה מעל הקשירה ומנתקים ריאות ולב על הגוש מהחזה.
   הערה: למתחילים, מומלץ לבקש מעמית תמיכה בשלב החיבור.
7. מעבירים את מנת האיברים למאגר HEPES-Ringer קר כקרח כדי לחזק את ההתעוררות. זה קורה תוך כמה דקות.
8. להפריד את אונות הריאה בודדים ולתקן אונה אחת עם דבק על מחזיק הדגימה של vibratome.
   הערה: כדאי לתקוע חתיכת פקק שמפניה על המחזיק המשמש להטות במהלך חיתוך רקמת הריאה האלסטית. בהתאם לאונה הריאה בשימוש ועל הכיוון שלה על מחזיק הדגימה, PCLS המתקבל עשוי להיות מתאים יותר לניתוח של כלי קטן או גדול. בעיקר אנו משתמשים באונה השמאלית ובאונה הגולגולתית הימנית להכנת ה- PCLS. כדי לקבל חתך עורקים תוך-אצ'יניים קטנים חתוכים, הדבק את האונה הימנית הגולגולתית עם ההילום למחזיק ופרוס מהפריפריה. כדי לקבל חתך עורקים טרום acinar, ליישר את hilum של האונה הימנית עם פקק שמפניה.
9. השתמש vibratome מצויד סכין גילוח טרי לחתוך את אונה הריאה לתוך 200 פרוסות עבות מיקרומטר (מהירות: 12 = 1.2 מ"מ / שניה; תדירות: 100; משרעת: 1.0). לאסוף את PCLS באגן ויברטום מלא 4 °C (60 °F) קר HEPES-Ringer מאגר.
   הערה: מומלץ לצלם את ה-HEPES-Ringer אך לא חיוני.
10. להסרת agarose, להעביר את חלקי האיבר לתוך זכוכית מלא כ 200 מיליליטר 37 °C (70 °F) חם MEM. מכניסים את הכומתה לארון החימום שלתוכו מחובר צינור לבקבוק עם תערובת גז נורמוקסית. מבעבעים את ה-MEM עם הגז הנורמוקסי כך שמקטעי הריאות נעים לאט במדיום. לאחר כשעתיים, "לוחות agarose" מילוי המרחב האווירי יוסרו מרקמת הריאה. זה יכול להיות מוכר על ידי העובדה כי החלקים כבר לא שוחים על החלק העליון של המדיום אבל להתיישב על החלק התחתון של הכוויה.

4. ניתוח וידאומורפומטרי של עורקים תוך-רחמיים של PCLS

1. לניתוח וידאומורפומטרי של עורקים תוך-ריאתיים, העבר PCLS אחד לתוך תא הזרימה-דרך superfusion מלא 1.2 מ"ל נורמוקסית גז MEM. תקן את ה- PCLS בתחתית התא עם מחרוזות ניילון המחוברות לטבעת פלטינה (קוטר חיצוני/פנימי: 14/10 מ"מ).
2. סרוק את ה- PCLS מיקרוסקופית לאיתור עורקים חתוכים עם קטרים פנימיים בין 20-100 מיקרומטר.
   
   הערה: לומן העורקים מרופד בתאי אנדותל שטוחים. ניתן לזהות את תאי השרירים החלקים שמסביב בתמונת ניגודיות הפאזה כ"טבעת כהה" המקיפה את הלומן (ראו תמונות ניגודיות פאזה באיור 2). לעומת זאת, דרכי הנשימה ניתן לזהות על ידי אפיתל טוררי מדומה בתחילה אשר עובר בדרך אל פני השטח pleural לתוך אפיתל טורי פשוט ואחריו אפיתל cuboidal פשוט.
   
   1. למדוד את הקוטר הפנימי בתחילת כל ניסוי.
      הערה: בכלי חיתוך מעט אלכסוני, הקוטר הפנימי האמיתי של המבנה הצינורי ניתן לקבוע בזווית של 90 ° לציר הארוך ביותר של לומן. עורקים גדולים טרום acinar עם קטרים פנימיים >40 מיקרומטר לרוץ סמוך ברונכי ברונכיולים. עורקים פנים-אצ'יניים קטנים בקוטר פנימי <40 מיקרומטר ממוקמים ב- gussets של ספטה מכתשים ליד תעלות מכתשים וכתמיות⁶.
3. תכנון ניסיוני:
   1. התחילו כל ניסוי ב"שלב הסתגלות" שבו החדר מלא במדיום גז נורמוקסי (קצב זרימה: 0.7 מ"ל לדקה; 10 דקות). לאחר מכן, בדוק את הכדאיות של הכלי: לנתח התכווצות של העורק על ידי תוספת של 12 μl של 10 מיקרומטר U46619 (ריכוז סופי 0.1 מיקרומטר; 10 דקות; אין זרימה).
      הערה: עבור עבודה זו, כלי מוגדר קיימא כאשר האזור הזוהר מצטמצם בלפחות 30% (עבור שיטת מדידה ראה להלן).
   2. לאחר שטיפת התרופה עם בינוני גז נורמוקסי (קצב זרימה: 6 מיליליטר / דקה; 10 דקות) ל מורחבים את העורק על ידי יישום של 3 μl של 10 מ"מ Nipruss (ריכוז סופי 25 מיקרומטר; 10 דקות; אין זרימה).
   3. שוב, להסיר את התרופה על ידי לשטוף 10 דקות עם בינוני בגז נורמוקסי (קצב זרימה: 6 מיליליטר / דקה) ואחריו 10 דקות בזרימה של 0.7 מיליליטר / דקה.
   4. לגרום vasoconstriction ריאתי היפוקסי על ידי דגירה של PCLS עם בינוני גז היפוקסי (קצב זרימה: 0.7 מיליליטר / דקה; 40 דקות). על ידי מערכת צינור נוספת, להאכיל את תערובת הגז היפוקסי לתוך החלל האווירי של תא זלוף.
   5. הסר את המדיום היפוקסי על ידי לשטוף 20 דקות עם בינוני בגז נורמוקסי (קצב זרימה: 6 מיליליטר / דקה).
   6. בסוף כל ניסוי, להוסיף 1.2 μl של 10 מיקרומטר U46619 (ריכוז סופי 0.01 מיקרומטר; 20 דקות; אין זרימה) לתא זלוף כדי לגרום vasoconstriction.
      הערה: שלב סופי זה מאפשר לקבוע אם שינוי בתגובה היפוקסית (למשל הנגרמת על ידי יישום בו זמני של תרופה בשלב היפוקסי או נצפתה PCLS מוכן ממתח עכבר נוקאאוט) הוא ספציפי עבור התכווצות הנגרמת על ידי היפוקסיה או אם זה משקף השפעה כללית על התכווצות. הריכוז של 0.01 מיקרומטר תואם לערך EC50 של U46619 שהוערך במדידות קודמות של התכווצות ריכוז (לא פורסם).
   7. השתמש PCLS אחר כדי לבצע ניסויי בקרה עם נורמוקסית במקום MEM גז היפוקסי ותערובת גז נורמוקסית במרחב האוויר של תא זלוף.

5. ניתוח של ואסראקטיביות ומצגת גרפית

1. באמצעות תוכנה מתאימה לצלם מן העורק חתך כל דקה במהלך הניסוי כולו.
2. באמצעות תוכנה מתאימה להעריך שינויים של האזור הזוהר של כלי על ידי רירית הגבולות הפנימיים ביד באמצעות תמונות מסך מלא.
   הערה: מספיק לנתח כל תמונה שנייה כדי לקבל גרפים ברורים. עם זאת, כאשר תנאי אחד בתא הזרימה-דרך superfusion משתנה למשנהו, לנתח כל תמונה. התמונות הנותרות משמשות כגיבוי למקרה שלא ניתן יהיה לנתח תמונה אחת.
   למרבה הצער, צעד זה זמן רב צריך להיעשות ביד ולא על ידי תוכניות מתאימות שכן לפעמים תאי הדם מחוברים לקיר כלי הדם אשר נעים במהלך המדידה או שזה לא חתך מושלם של הכלי אבל קטע משיק שבו לוקליזציה אמינה של הגבולות הפנימיים יכול להיעשות רק תחת שליטה חזותית.
3. הגדר את הערך המתקבל עבור האזור של לומן כלי בתחילת הניסוי כמו 100% ובטא vasoconstriction או חלוקה כמו ירידה יחסית או עלייה של ערך זה.
4. עבור כל ניסוי להתוות את האזור הזוהר היחסי נגד הזמן באמצעות תוכנה מתאימה.
5. לסיכום מספר ניסויים, התווה את האמצעים של האזורים הזוהרים היחסיים +/- שגיאת תקן של הממוצע (SEM) כנגד הזמן.
   הערה: לקבלת מצגת ברורה של ההשפעות של חומרים שונים על היפוקסיה- או U46619-induced vasoconstriction ריאתי או של התגובה היפוקסית של זני עכבר נוקאאוט, השלב הראשוני של הניסויים, שבו הכדאיות של הכלי נבדק, ניתן להשמיט מן הגרף. במקרה זה, הערכים המתקבלים בתחילת החשיפה לחמצן מופחת מוגדרים כ -100%.

6. ניתוח סטטיסטי

1. לנתח את ההבדלים בין קבוצות ניסיוניות עם Kruskal-Wallis- ואת מאן-ויטני-מבחן, עם p≤0.05 נחשב משמעותי, ו p≤0.01 משמעותי מאוד.
   הערה: למידע נוסף על ההכנה והשימוש התפעולי ב- PCLS ראו גם^20,21.

תוצאות

באיור 1 ניתנות תוצאות המדידה של HPV של עורק קדם-סינארי גדול ובאיור 2 של עורקים תוך-אצינריים קטנים. בתמונות ניגודיות הפאזה (איורים 1A ו- 2A) מתברר כי ניתן להפלות את 2 סוגי העורקים האלה על סמך מיקומם בתוך רקמת הריאה: עורקים טרום-אצ'יניים פועלים בשכונה קרובה לסמפונצ'י וברונצ'ולי(איור 1A),ואילו העורקים התוך-סינאריים ממוקמים בגוסטות של ספטה מכתשית ומוקפים מכתשית(איור 2A). עם קצת תרגול אפשר לראות את השינויים באזור הזוהר בתגובה U46619 על תמונות ניגוד פאזה (איורים 1A ו 2A). עם זאת, vasoconstriction ריאתי היפוקסי הוא לעתים קרובות לא כל כך בולט ומתברר רק לאחר הערכה מלאה של השינויים של האזורים הזוהרים (איורים 1B, 1C, 2B, ו, 2C). מסיבה דידקטית נתנו דוגמה של עורק טרום acinar אשר מראה vasoconstriction בולט במיוחד. בממוצע, HPV תוצאות 20-30% הפחתה של האזור הזוהר.

באיור 2 ההקלטות של עורקים תוך-אצ'יניים קטנים עם מדיום בגז היפוקסי עם או בלי 50 μM pinacidil (פותחן לא אלקטיבי של תעלות אשלגן רגישות ל-ATP מיטוכונדריאלי) מוצגות וההשפעה המעכבת של התרופה הופכת גלויה בבירור. החלק האחרון של הניסוי מדגים את הסלקטיביות של הפעולה של התרופה על HPV: Vasoconstriction המושרה על ידי U46619 אנלוגי thromboxane אינו משתנה על ידי תוספת של pinacidil. אכן, העקומה עבור העורק חשפה את pinacidil פועל נמוך באופן מובהק מאשר שני האחרים, אבל היקף ההפחתה של האזור הזוהר על ידי U46619 לבד הוא דומה. במקרה זה היה זה היפוך לא שלם של HPV אשר גורם להבדל בין העקומות. בגרף זה גם עורק שנחשף למדיום גז נורמוקסי נכלל כבקרה נוספת. בתנאי זה, לא ניתן לזהות שינויים באזור הזוהר.

באיור 3 מוצגים נתוני סדרת המדידות המלאה על השפעת פינצ'ידיל על HPV. לשם השוואה בין שתי הקבוצות להבדלים סטטיסטיים, נותחו ערכות הנתונים של נקודות הזמן שצוינו עם מבחן קרוסקל-וואליס ומבחן מאן-וויטני. HPV בוטל בבירור בנוכחות פינצ'ידיל ואילו התכווצות הנגרמת על ידי U46619 לא השתנתה.

לחלופין, ניתן לזהות הבדלים בין קבוצות על ידי השוואת השטח מתחת לעקומה כמתואר מולר-רדצקי ואח '. ^{22 (22)}

איור 1. מדידה של HPV של עורק קדם-אצינרי גדול. (A)תמונות ניגודיות פאזה של עורק טרום-אצינרי חתך (א) הפועל בשכונה קרובה לברונכי חתך רוחב(B). התמונות מצולמות בנקודות הזמן שצוינו ב- (B) על ידי עיגולים: בתחילת המדידה (א), בסוף הטיפול עם U46619 (ב), בסוף החשיפה לניברוס (c), לאחר 30 או 40 דקות במדיום בגז היפוקסי (ד, ה), לאחר שטיפה עם מדיום גז נורמוקסי (ו), ואחרי היישום הסופי של U46619 (ז). בגרף (B) שינויים באזור הזוהר מותווים כנגד הזמן ואילו האזור הזוהר בתחילת הניסוי מוגדר כ- 100% ו vasoconstriction/-dilatation ניתנים כערכים יחסיים. במקרה זה היפוקסיה גורם 60% הפחתה של האזור הזוהר. (C) להצגה ברורה יותר של התגובה ההיפוקסית, השלב הראשוני של הניסוי שבו נבדקה vasoreactivity אינו כלול, אבל הערך המתקבל מיד לפני החשיפה לחמצן מופחת מוגדר 100% (ראה גם איור 2). לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.

איור 2. ההשפעה של פינקידיל (פותחן לא נבחר של ערוצי אשלגן רגישים ל-ATP מיטוכונדריאלי; mitoKATP) על HPV של עורקים תוך-סינאריים קטנים. (A)עורקים תוך-אצ'יניים (א) ממוקמים ב gussets של ספטה מכתש. אלב = אלבולוס. רצף התנאים הבודדים המיושמים בניסויים אלה ניתן בכותרת הגרף (B). חשיפה היפוקסית מבוצעת בנוכחות או היעדר 50 μM פינצ'ידיל. הדגירה הבקרה נעשית עם מדיום גז נורמוקסי. תמונות המוצגות ב- (A) מצולמים בתחילת המדידה (a, a', a"), בסוף הטיפול עם U46619 (ב, b', b"), בסוף החשיפה לנייפרוס (c, c', c"), לאחר 30 או 40 דקות במדיום גז היפוקסי או נורמוקסי (d, d', d"; e', e"), לאחר שטיפה עם מדיום בגז נורמוקסי (f, f', f"), ולאחר היישום הסופי של U46619 (g, g', g"). להצגה ברורה יותר של התגובה לנורמוקסיה/היפוקסיה/היפוקסיה+פינצ'ידיל, הערכים המתקבלים מיד לפני החשיפה למדיום נורמוקסי/היפוקסי-גז מוגדרים כ- 100% (C). לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.

איור 3. עיכוב של HPV על ידי פינצ'ידיל. ההקלטות של עורקים פנים-acinar קטנים חשופים בינוני גז היפוקסי עם או בלי 50 μM pinacidil מסוכמים ומוצגים כאמצעי ± SEM. ב -( A) ההקלטות המלאות ניתנות, ב - (B) הנתונים היחסיים ביחס לערך בתחילת הדגירה ההיפוקסית מוצגים. לא ניתן לזהות vasoreactivity ב- PCLS אשר נחשפים למדיום היפוקסי-גז המכיל פינצ'ידיל. Vasoconstriction המושרה על ידי U46619 אינו מושפע על ידי התרופה. "n" בסוגריים מתייחס למספר העורקים/ מספר בעלי החיים שממנו נוצרו PCLS. במילים אחרות, המספר הראשון מתאר את ספירת מקטעי הריאות שנותחו והמספר השני נותן את ספירת העכברים שממנה הוכנו מקטעים אלה. בנקודות הזמן הנתון ההבדלים בין שתי הקבוצות נבחנים למשמעות. n.s.: לא משמעותי, *: p≤0.05, **: p≤0.01, ***: p≤0.001. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.

איור 4. מבט כולל סכמטי על פעולת השירות. בקצרה, עכברים נהרגים על ידי נקע בצוואר הרחם. לאחר פתיחת החזה, הריאות מלאות בנקודת התכה נמוכה agarose ולאחר קירור לחתוך לפרוסות ריאות 200 מיקרומטר דיוק עבה לחתוך (PCLS). לאחר הסרת agarose ב 37 °C (70 °F) PCLS אחד מועבר לתוך תא זרימה דרך superfusion שבו הוא נחשף בינוני נורמוקסי או בינוני גז עם 1% O₂. Vasoreactivity נרשם כשינויים באזור הזוהר. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.

דיון

ריאת העכבר המבודדת והמוזערת היא מודל מצוין לניתוח התגובה הפיזיולוגית של מערכת כלי הדם הריאה על שינויים באספקת החמצן ובין היתר מאפשרת מדידה רציפה של לחץ עורקי ריאתי¹. עם זאת, מודל זה אינו מאפשר זיהוי וניתוח של מקטעי כלי דם אלה המציגים את התגובה החזקה ביותר להיפוקסיה. זהו היתרון של ניתוח videomorphometric שלנו של PCLS אשר מקל על מדידת HPV של עורקים בודדים עם קטרים פנימיים של 20-100 מיקרומטר. PCLS מייצגים מודל במבחנה אטרקטיבי שכן הם דומים מאוד לאיבר שממנו הם מוכנים. בניגוד למערכות תרבית התאים, כל סוגי התאים נמצאים בתצורת מטריצת הרקמות המקורית שלהם. יתר על כן, ריאה אחת מספיקה להכנת PCLS רבים, כך שלפחות באופן חלקי ניסויים יכולים להיות מתוקננים על ידי שימוש בקטעים מאותו עכבר. על פי מושג 3R (הפחתה, עידון והחלפה של חיות מעבדה במדעי החיים) של ראסל וברץ^'23 עובדה זו טוענת גם לשימוש PCLS.

עם זאת, יש לזכור, כי הרקמה נפגעת על ידי חיתוך עם ויברטום איתות אורך למשל באמצעות תאי האנדותל כפי שהניח על ידי Kübler ואח '. ¹⁴ כבר לא אפשרי.

בתחילה, PCLS יושמו בעיקר עבור מחקרים ביוכימיים, פרמקולוגיים וטוקסיקולוגיים, אבל בינתיים הם משמשים גם למדידת התכווצות הסימפונות, תפקוד רירי ותגובות כלי דם (עבור ביקורות ראה סנדרסון²⁰ ודיוויס²¹). מוחזק ואח '. ביצעו מחקר שבו הם השוו את המודלים של ריאות עכבר מבודדות ומאווררות ושל PCLS²⁴. הם מצאו על ידי ניתוח של התגובות של דרכי הנשימה וכלי הריאות למגוון מתווכים אנדוגני כי מאפיינים חשובים של הריאה כולה נשמרו PCLS.

ב- PCLS, תנאים היפוקסיים אינם נקבעים דרך דרכי הנשימה כמו בריאה שלמה אלא על ידי דגירה של סעיף הריאות במדיום בגז היפוקסי. ניתחנו את הלחץ החלקי חמצן (pO₂₎של בינוני pregassed עם 1% O₂, 5.3% CO₂, 93.7% N₂ ועם 21% O₂, 5.3% CO₂, 73.7% N₂, בהתאמה, באמצעות מנתח גז דם. מיד לפני האכלתו לתוך תא זלוף, pO₂ של MEM גז היפוקסי היה 40 מ"מ היג וזה של גז נורמוקסי בינוני 160 מ"מ^{גרם 6}.  בריאה שלמה HPV הוא המושרה כאשר pO מכתש₂ טיפות מתחת 50 מ"מ-ח"ג²⁵, מצב אשר ניתן לחקות ללא ספק על ידי יישום של מדיום בגז היפוקסי. הנתונים שלנו על היקף HPV תואמים היטב לתוצאות שהושגו בגישה ניסיונית שונה. ימגוצ'י ואח '. יש להחיל ריאות חולדה מבודדת לבחון microvessels עם קוטר של 20-30 מיקרומטר על ידי בזמן אמת confocal לייזר סריקת מיקרוסקופיה זוהר בשילוב למצלמה רגישות גבוהה עם מגבר תמונה¹⁰. הם הבחינו בירידה ממוצעת בקוטר של 2.7 מיקרומטר לאחר חשיפת הריאות להיפוקסיה. אפשר לחשב כי הפחתה של 20% של האזור הזוהר כפי שאנו מודדים אותו במערכת שלנו מתאים כ 15% ירידה בקוטר.

בניסויים שלנו סיווגנו את העורקים ככלי טרום ותוך אצ'יניאר, בהתאמה, עם קטרים פנימיים של 40-100 מיקרומטר ו 20-40 מיקרומטר. בבני אדם המעבר מעורקים שריריים לעורקים לא שריריים מתרחש בטווח הקוטר של 70-100 מיקרומטר. בעכברים, תאי שריר חלקים נמצאים עד לקוטר חיצוני של 20 מיקרומטר²⁶. מסיבה זו לא ניתן לנתח עורקים עם קטרים מתחת 20 מיקרומטר שכן הם לא יכולים להיות אמינים להיות מזוהים בהתבסס על תמונת ניגודיות פאזה. בקצה השני של הסולם, כלי עם קטרים מעל 100 מיקרומטר הם בקושי למצוא PCLS ובדרך כלל הפשיט מן הרקמה שמסביב.

למעשה, מספר מועמדים מולקולריים נידונים כמו חיישני חמצן מולקולריים(s) או כמרכיב של מפל איתות וכתוצאה מכך HPV (לסקירה ראה סילבסטר ואח '. ⁴). פעם עכברי נוקאאוט מתאימים זמינים videomorphometry ניתן להשתמש לניתוח של vasoreactivity של העורקים טרום ותוך אצ'יניאר לעומת בעלי חיים מסוג בר. עם זאת, PCLS שימשו גם עבור בעיות אחרות: פארו ואח '. העסיק אותם כדי לאפיין את הפיתוח של תדרוך תלוי אנדותל בריאה לאחר הלידה²⁹ ו PCLS מוכן שרקנים חשופים עשן או אוויר מדי יום במשך 2 שבועות שימשו כדי להדגים את ההשפעה של עשן סיגריות על vasoreactivity באמצעות אינדוקציה של תפקוד אנדותל³⁰.

שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול

בניסויים שלנו סיווגנו את העורקים כקדם-acinar (קטרים פנימיים של 40-100 מיקרומטר) ו תוך-acinar (קטרים פנימיים של 20-40 מיקרומטר). במיוחד להכנת קטעי ריאות אשר יש להשתמש בהם לניתוח של כלי גדול יותר חשוב להוסיף נתרן nitroprusside למאגר זלוף. תרופה זו מונעת את התכווצות כלי הדם במהלך הכנת המדגם ובכך לקרוע שלהם מן הרקמה שמסביב המוביל vasodilation שלם. נתרן nitroprusside במאגר זלוף לא כל כך חשוב להכנת סעיף ריאות אשר יש להשתמש בהם לניתוח של עורקים קטנים כי הם מעוגנים בחוזקה ספטה מכתשי.

כל הניסויים צריכים להתחיל עם דגירות שבהן תגובתיות העורקים נבדקת. לעתים רחוקות, השגנו תכשירי ריאות שבהם לא ניתן היה לזהות תגובה של כלי שיט לקבלנים או ל מורחבים. אנחנו לא יודעים את הסיבה לכך: יכול להיות כי נפח של agarose מלא לתוך הריאות היה גדול מדי או נמוך מדי, כך חיתוך של האיבר לתוך PCLS לא היה אופטימלי. לחלופין, ניתן להעלות על הדעת כי agarose היה להתקרר מהר מדי במהלך הליך החדרה וכתוצאה מכך נזק ללחץ גזירה. במקרה שבמחשב PCLS בודד אין עורק בר קיימא ניתן לגילוי, יש להשליך את המקטע ולהחליף אותו בעורק אחר.

ההחלטה על הכדאיות של עורק התקבלה על סמך התגובה ל- U46619. יישום של U46619 בריכוז של 0.1 מיקרומטר גורם vasoconstriction אשר - לאחר פעילות גופנית מסוימת - גלוי ישירות ברצף התמונה על המסך. מאז יש כמה שונות vasoreactivity אנו חוקרים את ההשפעה של תרופה על HPV על ידי מדידת vasoresponse בקטעי ריאות חשופים לתרופה או למדיום לבד בתורו.

HPV של עורק בודד הוא לעתים קרובות בקושי לזיהוי במיקרוסקופ, ובממוצע זה גורם להפחתת האזור הזוהר של כ 20-30%. עם זאת, שינויים קטנים בקוטר של עורק יש קלט ברור על התנגדות זרימה. על פי המשוואה "R = 1/r⁴" עם R = התנגדות r = רדיוס, התנגדות הזרימה היא ביחס הפוך לכוח הרביעי של הרדיוס. תן לי לתת דוגמה: "עורק אידיאלי" המציג חתך מעגלי בקוטר של 40 מיקרומטר (r = 20 מיקרומטר) יש שטח לומינלי של כ 1,260 מיקרומטר². כאשר האזור הזוהר מצטמצם ב -20%, אנו יכולים לחשב שקוטר הכלי מצטמצם ב -10.5% ל -35.8 מיקרומטר (r = 17.9 מיקרומטר). על פי המשוואה שניתנה לעיל, התנגדות הזרימה של כלי זה תגדל מ 6.25 x 10^-6 ל 9.71 x 10^-6 כי הוא על ידי כ 55%. במקרה של צמצום האזור הזוהר בכ-30% הרדיוס יקטן בכ-16%, אך עמידות הזרימה תגדל בכ-100%. למרות חישובים אלה הם פשטנות יתר שבה זרימת דם למינארית צורה של צינור נוקשה הם הניחו שזה מרמז על ההשפעה של שינויים קלים כבר של הקוטר על עמידות בפני זרימה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Vibratome "Microm HM 650 V"	Microm/Thermo Fisher Scientific, שוורטה, גרמניה
תנור מיקרוגל	בוש, פרנקפורט, גרמניה	HMT 702C
ארון חימום	Heraeus/Thermo Fisher Scientific, שוורטה, גרמניה
תא היתוך סופר-זרימה	הוגו זקס אלקטרוניק, מרץ, גרמניה	PCLS-אמבט סוג: 847 SN:4017
מיקרוסקופ הפוך זקוף מצויד במטרות 4X, 10X, 20X ו-40X	לייקה, וצלר, גרמניה
מצלמת CCD	Stemmer Imaging, Puchheim, גרמניה
משאבה פריסטלטית Minipuls 3	Gilson, Limburg-Offheim, גרמניה
אמבט מים " איזוטם אוניברסלי Wasserbad 205"	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, גרמניה	9452450
צינורות אטומים לגז Tygon R3603-13       ואוסלאש; i: 3/32 אינץ', ואוסלאש; ת: 5/32 אינץ', קיר: 1/32 ב	- VWR, דרמשטדט, גרמניה
מספריים ומלקחיים
תפירת כותנה
2 מ"ל מזרק	Braun-Melsungen AG, Melsungen, גרמניה
מזרק 50 מ"ל	Braun-Melsungen AG, Melsungen, גרמניה
צינור פלסטיק גמיש של צינורית שוכנת IV " IntrocanR-W" (צינורית 20 גרם x 1 ו-frac14; אינץ', 1.1 x 32 מ"מ)	Braun-Melsungen AG, Melsungen, גרמניה	4254112B	להחדרת האגרוז לתוך
הריאה Cannula 21 G x 4 ¾ in; 0.8 x 120 מ"מ	Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany	4665643	לבעבוע של הצינורית הבינונית
מס' 17, 24 G x 1, 0.55 x 25 מ"מ	Terumo, Eschborn, גרמניה	NN 2425 88DSF18	לזלוף ריאות
תערובת גז נורמוקסי (21% O2, 5.3% CO2, 73.7% N2)	Linde, Hildesheim, גרמניה
תערובת גז היפוקסית (1% O2, 5.3% CO2, 93.7% N2)	Linde, הילדסהיים, גרמניה
HEPES	Sigma, Deisenhofen, גרמניה	H 4034
NaCl	Roth, קרלסרוה, גרמניה	3957.1
KCl	Merck, דרמשטאדט, גרמניה	1.04936.0500
MgCl2• 6H2O	Merck, דרמשטאדט, גרמניה	1.05833.0250
CaCl2• 2H2O	Merck, דרמשטאדט, גרמניה	1.02382.0500
גלוקוז D-(+)	Sigma, Deisenhofen, גרמניה	G 7021
נקודת התכה נמוכה agarose	Bio-Rad, מינכן, גרמניה	161-3111
Heparin-sodium	Ratiopharm, אולם, גרמניה	5120046
מדיום חיוני מינימלי (MEM) נטול פנולרד,	Invitrogen, דרמשטדט, גרמניה	5120046
70% EtOH לחיטוי	Stockmeier Chemie, Dillenburg, גרמניה
Superglue	UHU, Bü hl/Baden, גרמניה או מסופרמרקט
U46619 (אנלוגי טרומבוקסן)	Calbiochem/Merck, דרמשטדט, גרמניה	538944
נתרן ניטרופרוסיד (Nipruss)	Schwarz Pharma, Monheim, גרמניה	5332804
תוכנת Optimas 6.5	Stemmer , Puchheim , גרמניה
SPSS 19	AskNet , קרלסרוה, גרמניה