מאמר שיטה

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

DOI:

10.3791/50980

⸱

7 בנובמבר 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עיוות מכאנית מהירה של תאים התפתחה שיטה למסירה תאית של מקרומולקולות וננו מבטיחה, ללא וקטור. פרוטוקול זה מספק שלבים מפורטים כיצד להשתמש במערכת עבור מגוון רחב של יישומים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עיוות מכאנית מהירה של תאים התפתחה שיטה למסירה תאית של מקרומולקולות וננו מבטיחה, ללא וקטור. טכנולוגיה זו הראתה פוטנציאל בטיפול ביישומים מאתגרים בעבר, כולל, משלוח לתאים ראשוניים חיסוניים, תכנות מחדש של תאים, פחמן Nanotube, ומשלוח נקודה קוונטית. פלטפורמת microfluidic ללא וקטור זה מסתמכת על הפרעה מכאנית של קרום התא כדי להקל על הגשת cytosolic של חומר היעד. במסמך זה, אנו מתארים את השיטה מפורטת של שימוש למכשירי microfluidic אלה כוללים, הרכבה מכשיר, הכנת תא, ותפעול מערכת. משלוח גישה זו מחייבת אופטימיזציה קצר של סוג המכשיר ותנאי הפעלה ליישומים לא פורסם בעבר. ההוראות שסופקו הן להכליל את רוב סוגי תאים וחומרי אספקה ​​כמערכת זו אינה דורשת מאגרים מיוחדים או צעדי שינוי כימי / הצמידה. עבודה זו מספקת גםשל המלצות על איך לשפר את ביצועי מכשיר וצרות-לירות בעיות פוטנציאליות הקשורות לסתימה, יעילות משלוח נמוכה, וכדאיויות תא.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משלוח של מקרומולקולות להציטופלסמה התא הוא שלב קריטי ביישומים טיפוליים ומחקר. משלוח nanoparticle בתיווך, למשל, הראה פוטנציאל בטיפול גנטי 1,2, תוך מסירת החלבון היא אמצעי מבטיח של משפיע על תפקוד תאי בשני 3 ומעבדה קליניות 4 הגדרות. חומרים אחרים, כגון תרופות מולקולה קטנות, נקודות קוונטיות, או חלקיקי זהב, הם בעלי עניין ביישומים החל תרופות לסרטן 5,6 לתיוג תאיים 7,8, ומולקולה בודדת מעקב 9.

קרום התא הוא במידה רבה בלתי חדיר למקרומולקולות. קיימות טכניקות רבות משתמשות בחלקיקים פולימריים 10,11, ליפוזומים 12, או שינויים כימיים 13 כדי להקל על שיבוש קרום או מסירת endocytotic. בשיטות אלה, את כדאיות יעילות משלוח והתא הן בדרך כלל תלויה במבנה של המולקולת דואר יעד וסוג התא. שיטות אלו יכולות להיות יעילים באספקה ​​של חומרים אחידים מבחינה מבנית, כגון חומצות גרעין, אך לעתים קרובות אינו מתאימות עבור המשלוח של יותר מבחינה מבנית מגוונת חומרים, כגון חלבונים 14,15 וננו 7. יתר על כן, מנגנון שיבוש endosome שרוב השיטות אלה מסתמכים על הוא לעתים קרובות לא יעיל, ולכן משאיר את חומר רב לכוד במבני שלפוחית ​​16. לבסוף, שיטות שלעתים קרובות פותחו לשימוש עם שורות תאים הוקמו לא לתרגם גם לתאים ראשוניים.

שיטות poration ממברנה, כגון electroporation 17,18 וsonoporation 19, הם חלופה אטרקטיבית ביישומים מסוימים, אך הם ידועים כגורמים לכדאיויות תא נמוכות ויכולים להיות מוגבל על ידי המטען של החומר המסירה היעד.

עיוות מכאנית מהירה של תאים, גישת microfluidic למשלוח, יש לאחרונה demonstrated היתרונות שלה על פני שיטות הנוכחיות בהקשר של תא תכנות מחדש 20 ומשלוח nanomaterial 21. שיטה זו מסתמכת על הפרעה מכאנית o קרום התא כדי להקל על הגשת cytosolic של חומרים הנמצאים בחיץ שמסביב. המערכת הוכיחה מאפשרת פוטנציאלי במאתגר בעבר סוגי תאים (למשל תאים חיסוניים ראשוניים ותאי גזע) וחומרים (למשל נוגדנים וצינורות פחמן). בזאת, ההליך הכללי להשתמש במכשירים אלה למסירה תאית של מקרומולקולות היעד מתואר. ההליך הוא להכליל את רוב סוגי תאים וחומרי משלוח, עם זאת, מומלץ שאחד לערוך אופטימיזציה קצרה של תנאים, כמפורט בהנחיות תכנון 20 שדווחו בעבר שלנו, עבור כל יישומים שלא דווחו בעבר. נכון להיום, המערכת כבר שימשה בהצלחה עבור המשלוח של RNA, DNA, חלקיקי זהב, נקודות קוונטיות, צינורות פחמן, חלבוןים, ופולימרים dextran 20,21.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. אחסון

  1. אחסן את מאגרי המים, בעלים, O-טבעות ומכשירי microfluidic ב70% אתנול. השתמש במכל (לדוגמא צנצנת או כוס) שיש לו מכסה כדי למנוע אידוי וזיהום על ידי חלקיקי אבק או בחוץ. הנח את המכשירים במכולה אחת (1), מאגרים וטבעות אטימות במכל שני (2), והמחזיקים בשלישי (3).

שים לב: השימוש באתנול 70% לאחסון הוא לשמור על סטריליות. אם המרכיבים היחידים של הפתרון הם אתנול ומים (כלומר אין סוכני denaturing), כל רכיבי המערכת צריכים להיות תואמים באופן מלא ולא לבזות לאורך זמן.

  1. שינוי פתרון אתנול במכולות (2) ו (3) לפני כל שימוש כדי למנוע זיהום צולב פני ניסויים ולמזער את הנוכחות של חלקיקים לא רצויים שיכול לגרום לסתימה.

2. ניסוי הכנה

  1. מיכלי מקום (2) ו (3) באמבטית אולטרסאונד עבורr דקות 5-10 לפני כל שימוש. מסייע בהסרה כל חלקיקים מזהמים מניסויים קודמים.
  2. סביבת עבודה נקייה בארון בטיחות ביולוגי עם 70% פתרון אתנול.
  3. לרסס את כל החומרים (3 מכולות, ופינצטה) עם פתרון אתנול 70% לפני הצבתם בתוך ארון הבטיחות הביולוגי.

3. עצרת

  1. נקבע 2-3 מגבונים נמוך מוך באזור העבודה.
  2. הסר מאגרי פלסטיק מהמכל שלהם עם פינצטה והעלית אותם במגבונים כדי להקל על אידוי של פתרון אתנול ממשטחים פנימיים. לטפוח בעדינות את המאגרים על פני השטח או לפוצץ באוויר דרך אותם כדי להקל על ההסרה של תמיסת אתנול.
  3. הכנס O-טבעות לתוך החריץ המתאים שלהם במאגרים.
  4. הסר את בעל ושבבים ממכולות בהתאמה ולאפשר אתנול להתאדות (~ 1-2 דק ').
  5. להשתמש בפינצטה כדי למקם את הפנים כלפי מעלה הרצוי שבב (כלומר חורים את גישה) במחזיק. הרם את בעלעם השבב לeyelevel לוודא השבב שוכב בבעל ולהתאים במידת צורך עם פינצטה. חשוב: אם המכשיר אינו מתאים כראוי במחזיק בה, קיים סיכון שהיא תישבר במהלך השלבים הבאים.
  6. בשלב הבא, מניחים בעדינות את המאגרים על בעל וליישר אותם עם הסרטונים. היזהר שO-טבעות לא נופלים מהחריצים שלהם במהלך תהליך זה.
  7. עדינות ללחוץ כלפי מטה על המאגרים, עד שהם לוחצים למקומו. ודא ששני הצדדים של המאגרים מאובטחים, וכי השבב נראה בתנוחה הנכונה.

4. הכנת תא

  1. עבור תאים חסיד (קווים ראשוניים או שהוקמו): תאי פלייט 1-2 ימים לפני הניסוי כזה שהם לא מחוברים יותר מ -80% ביום של הניסוי.
  2. מקום תאים בתרחיף (ב PBS או מדיה רלוונטית) ולשאוף לריכוז פעילות של 1.0 x 10 6 תאים / מיליליטר x ל1.0 10 7 cells / מיליליטר. הערה: לא נצפה בשל ריכוז תא שינויים משמעותיים בביצועי מסירה.
  3. מערבבים את תאים ואת חומר המשלוח הרצוי בצינור נפרד כדי להשיג את ריכוז חומר המבוקש לצורך הניסוי. חשוב: בגלל שיטת ההצגה המתוארת מסתמכת על דיפוזיה כדי להקל על הגשה, ריכוז חומר גבוה יותר יניבו משלוח גבוה יותר. במידת האפשר, מומלץ להשתמש בפתרון 1 מיקרומטר של החומר הרצוי לניסויים ראשוניים. ריכוז זה אז יכול להיות טיטרציה למטה בניסויים עתידיים במידת צורך. הריכוז הנמוך ביותר שדווח בשימוש עם מכשיר זה הוא 10 ננומטר 21.

5. מבצע

  1. תערובת פיפטה של ​​תאים וחומרי אספקה ​​למאגר (יש עיצוב הנוכחי קיבולת μl מקסימום 150). הערה: רוב עיצובי המכשיר הם הפיכים לחלוטין ולכן כיוון הזרימה בצינורות לא משנה. עשויות להיות עמוסות דוגמאות לכל אחד משני המאגרים.
  2. צרף צינורות לחץ למאגר המלא ולהדק את האום כדי להבטיח אטימה נאותה (הדוק אצבע הוא לעתים קרובות מספיק).
  3. התאם את לחץ לרמה הרצויה על הרגולטור. זה מקובע את המהירות שבה התאים לנסוע דרך המכשיר. שים לב שתא הזרימה אינה מתחילה עד שהכפתור נלחץ.

הערה: בעבודה קודמת, חנקן או אוויר דחוס שעבד באותה מידה כמו הגז המוביל.

  1. להעלות את המכשיר לגובה עיניים ולכוון אותו כך שהנוזל במאגר הוא לעין בקלות. הערה: עקוב אחר עמודת הנוזל לכבות את המערכת לפני שהמאגר מתרוקן.
  2. לחץ על לחצן לחצים על המאגר ויתחיל תא זרימה.
  3. כשרמת הנוזל היא כ 2 מ"מ מהחלק התחתון של המאגר, להפוך במהירות לרגולטור 0 psi כדי לעצור את הזרימה. חשוב: אם אחד לא מצליח לעצור את הזרימה לפני המאגר מתרוקן, אחד סיכונים ולהוציא המדגם מcollectioמאגר n. כמו כן שימו לב שאם עמודת הנוזל לא נעה בקצב ניכר, או הואטה באופן משמעותי ביחס לקצב הזרימה הראשוני שלה (למשל 3x איטי יותר), המכשיר המותקן הוא כנראה סתום וצריך להיות מוחלף. הפעלת מכשיר סתום יכולה לגרום למוות של תאים גבוהים יותר.
  4. לאסוף את התאים שטופלו מהמאגר המתאים ולמקם אותם בצינור איסוף / הצלחת הרצויה. חשוב: אל לדלל את התאים שנאספו בכל מאגרים בשלב זה כתאי porated ימשיכו ספיגי חומר לעד 10 דקות 20. לאחר חלון זה חלף, לדלל את התאים בתקשורת / החיץ הרצוי.
  5. כדי לאסוף תאים שטופלו יותר או לנסות תנאי ניסוי חלופיים, חזור על שלבים 5.1-5.7 לפי צורך. נזכיר כי השבבים הם הפיכים, יכולה להיות מותקנת ולכן דגימות בכל מאגר. הקפד להחליף שבבים במידת צורך אם הם סותמים. בטל מכשירים סתומים.

6. פירוק

  1. בעדינות לנתק את המאגרים מהמחזיק העיקרי על ידי לחיצה בצד את זרועות קליפ.
  2. מניחים כל חלק במכל המתאים האחסון (המפורטים בסעיף 1).
  3. הנח שבבים המשמשים במכל נפרד לסילוק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מכיל תיאורים סכמטי של מערכת מסירת microfluidic. איורים 2a-b להמחיש תוצאות טיפוסיות מטיפול בתאי הלה עם עיצובים שונים במכשיר בנוכחות dextran fluorescently מצומדות 3 kDa 20. אם ההליך ואחריו בצורה נכונה, ביצועי מערכת יהיו רגישים לסוג מכשיר ואת מהירות הפעלה. לכן, יש לייעל את התנאים הללו עבור יישום נתון לפני שתמשיך לעוד ניסויים מורכבים. בטווח של תנאי הפעלה שמודגמים באיור, כדאיות תא נשארת מעל 80%, עם זאת, יש לציין שפרמטרים לא טובים המסי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היבטים מסוימים של ההליך המתואר ניסוי (כלומר גורמים אחרים מאשר תכנון שבבים ומהירות הפעלה) ייתכן שיצטרכו להיות מותאמים בהתאם לסוג התא וחומר מסירת המערכת מוחל. הדיון שלהלן כתובות חלק מהגורמים הנפוצים ביותר שיש לשקול בעת תכנון ניסויים.

כדי לשפר את אות המשלוח לתרכובות שכותרתו fluorescently, צריך לטפל במקורות של הקרינה רקע. פני השטח מחייב ואנדוציטוזה, למשל, ניתן לטפל על ידי שטיפת תאי 5-10 דקות לאחר לידה כדי לה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים ארמון שערי, רוברט לנגר, וKlavs פ ג'נסן הם בעלי מניות של SQZ יוטכנולוגיות חברה שמייצרת את מכשירי microfluidic שימוש במאמר זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לט Shatova לדיון מועיל על עיצוב ניסיוני וניתוח נתונים. הסיוע והמומחיות של ג Paradis, כוח האדם של cytometry זרימת הליבה במכון קוך, ואת צוות של המעבדה לטכנולוגית מיקרוסיסטמס במכון טכנולוגית של מסצ'וסטס הכירו בהכרת תודה. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות המענקים RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, וחלקית על ידי מכון הלאומי לסרטן סרטן מרכז תמיכה (Core) מענקי P30-CA14051 וMPP-09Call-לנגר-60.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מחזיק מכשיר & מאגר פלסטיקSQZ Biotechnologiesמחזיק
LSRמנתח פורטסהBecton DickinsonN/Aמכונת ציטומטריית זרימה המשמשת במכון קוך מתקני
ליבה מכשיר מיקרופלואידיתSQZ BiotechnologiesCell Squeeze
O-RingsMcMaster9452K311
מערכת לחץ להפעלת מכשירSQZ Biotechnologiesמערכת
פינצטה
אמבט
לחץ אולטרסאונד

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
  2. Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-138 (2009).
  3. Leader, B., Baca, Q. J., Golan, D. E. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21-39 (2008).
  4. Kim, D., et al. Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells by Direct Delivery of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  5. Dhar, S., Daniel, W. L., Giljohann, D. A., Mirkin, C. A., Lippard, S. J. Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV) Warheads. J. Am. Chem. Soc. 131, 14652-14653 (2009).
  6. Jiang, Z. -X., Zhang, Z. -Y. Targeting PTPs with small molecule inhibitors in cancer treatment. Cancer and Metastasis Reviews. 27, 263-272 (2008).
  7. Derfus, A. M., Chan, W. C. W., Bhatia, S. N. Intracellular Delivery of Quantum Dots for Live Cell Labeling and Organelle Tracking. Adv. Mater. 16, 961-966 (2004).
  8. Michalet, X., et al. Quantum Dots for Live Cells in Vivo Imaging, and Diagnostics. Science. 307, 538-544 (2005).
  9. Dahan, M., et al. Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
  10. Slowing, I. I., Trewyn, B. G., Lin, V. S. Y. Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Delivery of Membrane-Impermeable Proteins. J. Am. Chem. Soc. 129, 8845-8849 (2007).
  11. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 581-593 (2005).
  12. Joseph, Z. Cationic lipids used in gene transfer. Advanced Drug Delivery Reviews. 27 (97), 17-28 (1997).
  13. Verma, A., et al. Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles. Nat. Mater. 7, 588-595 (2008).
  14. Yan, M., et al. A novel intracellular protein delivery platform based on single-protein nanocapsules. Nat. Nano. 5, 48-53 (2010).
  15. Shi Kam, N. W., Jessop, T. C., Wender, P. A., Dai, H. Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells. J. Am. Chem. Soc. 126, 6850-6851 (2004).
  16. Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
  17. li, S. Electroporation Gene Therapy: New Developments In Vivo and In Vitro. Current Gene Therapy. 4, 309-316 (2004).
  18. Fox, M., et al. Electroporation of cells in microfluidic devices: a review. Anal. Bioanal. Chem. 385, 474-485 (2006).
  19. Miller, D. L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation. Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).
  20. Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 2082-2087 (2013).
  21. Lee, J., et al. Nonendocytic Delivery of Functional Engineered Nanoparticles into the Cytoplasm of Live Cells Using a Novel, High-Throughput Microfluidic Device. Nano Lett. 12, 6322-6327 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cell SqueezingMicrofluidic DeliveryIntracellular DeliveryVector Free DeliveryMechanical DisruptionFlow CytometryDevice AssemblyCell PreparationPressure OptimizationClogging Prevention

מאמרים קשורים