מאמר שיטה

בידוד של טיפות שומנים נייד: שתי טכניקות טיהור החל מתאי שמרים ושליות אדם

DOI:

10.3791/50981

⸱

1 באפריל 2014

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cellular and Molecular Biology, University of Tennessee, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Tennessee

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שתי טכניקות לבידוד טיפות שומנים סלולריות מ1) תאי שמרים ו2) שליות אדם מוצגות. במרכזו של שני ההליכים הוא צנטריפוגה שיפוע הצפיפות, שבו השכבה הצפה וכתוצאה מכך המכילה טיפות ניתן דמיינו בקלות על ידי העין, שחולצה, ולכמת על ידי ניתוח כתם מערבי לטוהר.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפות שומנים הן דינמיים אברונים שניתן למצוא ברוב התאים פרוקריוטים אוקריוטים ומסוימים. מבחינה מבנית, הטיפות מורכבות מליבה של שומנים ניטראליים מוקפים monolayer פוספוליפידים. אחת הטכניקות שימושיות ביותר בקביעת התפקידים הסלולריים של טיפות כבר זיהוי proteomic של חלבונים קשורים, שיכול להיות מבודד יחד עם הטיפות. הנה, שתי שיטות מתוארות לבודד טיפות שומנים וחלבונים הקשורים שלהם משני אאוקריוטים רחבים היקף: שמרי ביקוע ותאי villous שליה אנושיים. אף שיש שני השיטות הבדלים, השיטה העיקרית - צנטריפוגה שיפוע צפיפות - משותפת לשני הכנות. זה מראה את התחולה רחבה של טכניקות בידוד אגל שהוצגו.

בפרוטוקול הראשון, תאי שמרים מומרים לspheroplasts ידי עיכול אנזימטי של קירות התא שלהם. אז spheroplasts כתוצאה מכך הם גנטly lysed בhomogenizer רפוי. Ficoll מתווסף lysate לספק שיפוע צפיפות, ואת התערובת centrifuged שלוש פעמים. אחרי הראשון הספין, טיפות השומנים הם מקומיים לשכבת ציפה בצבע הלבנה של צינורות צנטריפוגה יחד עם reticulum endoplasmic (ER), קרום הפלזמה, ווקואולות. שני ספינים שלאחר מכן משמשים להסרת שלושת אברונים אחרים אלה. התוצאה היא שכבה שיש לו רק טיפות וחלבונים קשורים.

בפרוטוקול השני, תאי שליה villous מבודדים משליות טווח אדם על ידי עיכול אנזימטי עם טריפסין וDNase I. התאים הומוגני בhomogenizer רפוי. צעדים במהירות נמוכה ובינונית צנטריפוגה במהירות משמשים להסרת תאים רצופים, פסולת תאית, גרעינים, ומיטוכונדריה. סוכרוז מתווסף homogenate לספק שיפוע צפיפות והתערובת היא centrifuged להפריד את טיפות השומנים מcellula האחרותשברים r.

טוהר טיפות השומנים בשני הפרוטוקולים אושר על ידי ניתוח כתם מערבי. ברי הטיפה משני preps מתאימים לניתוח proteomic וlipidomic שלאחר מכן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפות שומנים סלולריים הן אברונים דינמיים המשרתים פונקציות רבות בתאים. הם רכזות אחסון שומנים ניטראליים, הניתן להמרה לאנרגיה או משמשים לסינתזת פוספוליפידים. הטיפות ממלאות תפקידים מרכזיים במצבים פיסיולוגיים ופתולוגיים כוללים טרשת עורקים, השמנת יתר ומחלות מטבוליות בנושא, וגם במחלות זיהומיות 1,2. בנוסף, הם מקורות מסקרן עבור דלק ביו דיזל.

מידע רב על התפקידים הסלולריים של טיפות שומנים כבר מתקבל מניתוח proteomic וlipidomic של טיפות מטוהרים מאורגניזמים רחבי היקף 3. אורגניזמים אלה כללו חיידקים 4,5, שמרי 6-11, שותלים 12,13, נמטודות 14, ועף 15,16. לאור ההתעניינות בתפקיד של טיפות שומנים במחלות מטבוליות אדם, טיפות יש גם מבודדות מהתאים של בעלי חיים מתורבתים ורקמות nimal. שורות תאים בתרבית כללו adipocytes 3T3-L1 17, תאי K2 השחלה אוגר סיני (CHO) 18, hepatocyes האנושי 19,20, ושורות תאי אפיתל 21. רקמות בעלי החיים שממנו הטיפות היו מבודדות כללו עכבר שרירי שלד 22, כבד 23, ובלוטות החלב 23. כאמור, המטרה של רוב מחקרי בידוד רביב היא לבצע ניתוח proteomic בגורמים קשורים וניתוח lipidomic על ניטראלי ופוספוליפידים.

מאז שומנים ניטראליים - המרכיב רב ביותר של טיפות שומנים - הם פחות צפופים מרוב החומרים תאיים אחרים, בידוד של טיפות באופן מסורתי מתבצע באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות. טכניקה זו היא במרכזו של שני preps שהוצג כאן. טכניקות קודמות 6,24 משולבות והותאמו למצגת חזותית של הבידוד של טיפות מתאי שמרי ביקוע תרבותייםותאים אנושיים noncultured מתקבלים מרקמת שליה. המטרה היא להראות את תחולתה הרחבה של טכניקה זו על ידי בחירה בשני סוגים שונים בהרבה תא כהחל נקודות עבור בידוד רביב. טכניקה זו צריכה להיות שימושית לכל מי שרוצה לבודד את טיפות מרוב האורגניזמים.

פרוטוקול 1 מתאר את הבידוד של טיפות שומנים משמרי הביקוע, pombe Schizosaccharomyces, אשר שימשו כמודל להתבוננות היווצרות טיפה במהלך חלוקת תא אוקריוטים 25. שמרי ניצני שמר אפייה כבר נעשה שימוש נרחב כאורגניזם מודל ללימוד ביולוגיה אגל שומנים בדם. פרוטוקול 1 הוא ישים שני אורגניזמים והבדלים בהכנות מודגשים.

פרוטוקול 2 מתאר את הבידוד של טיפות שומנים מתאי villous שליה, אשר בתורו המתקבל משליות טווח אנושי.אוסף של שליות טווח מספק הזדמנות ייחודית בצורה בטוחה ואתי כדי להשיג 200-250 גרם של רקמה זמינה אדם 26, המכילה מספר משמעותי של טיפות שומנים. זאת בניגוד למרבית עבודות בידוד טיפת שומנים באאוקריוטים גבוהים יותר שבו טיפות מקורן תאים בתרבית. במחקרים אלה, חומצות שומן מתווספות לעתים קרובות לתרבות כדי לקדם את הסינתזה של שומנים ניטראליים ובכך הצמיחה של טיפות. זאת בניגוד לעבודה כאן שבו טיפות שומנים נוצרות בתנאים מקומיים ברקמת שליה.

Purities של השברים טיפת שומנים בדם נקבעת על ידי ניתוח הכתם המערבי באמצעות נוגדני סמן אברון. שני פרוטוקולים אלה יניבו שברים אגל שומנים המתאימים לניתוח proteomic וlipidomic שלאחר מכן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בידוד טיפות שומנים מתאים (ביקוע) שמרים

בידוד של טיפות מאורגניזם המודל הפופולרי ניצני cerevisiae שמרי Saccharomyces הוא כמעט זהה לפרוטוקול הבא 6. הבדלים בהכנות הם ציינו.

1. תאי שמרים גדל

  1. הכן את אמצעי התקשורת. שלב 36 גרם של אבקת YE5S לליטר של DH 2 O בבקבוקי זכוכית או צלוחיות תרבות. כ -2 ליטר של תקשורת יהיה צורך. החיטוי התקשורת ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאפשר התקשורת להתקרר לטמפרטורת חדר. עבור ס cerevisiae להחליף YE5S עם YPD.
  2. הנח 10-20 מיליליטר של תקשורת YE5S מקוררת לתוך בקבוק תרבות 250 מיליליטר באמצעות טכניקות סטרילית. לחסן את התקשורת עם כמות קטנה של תאי שמרים מצלחת אגר באמצעות מקל עץ סטרילי או שווה ערך. בואו התאים לגדול לצפיפות האופטית הרצויה ב30 ° C. מדוד את הצפיפות האופטית באורך גל של 595 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.
  3. הנח את התקשורת שנותרה בצלוחיות L 2.8. שימוש לא יותר מ 1 ליטר של מדיה ל2.8 L בקבוק כדי להבטיח ערבוב נכון במהלך צמיחת תאים בחממה הרועדת. התשואה הסופית של תאים רטובים צריכה להיות על 10 גרם לתוכל לרכוש מספיק טיפות שומנים לניתוח proteomic וlipidomic.
  4. להציג את התאים מן השלב 1.2 ל2.8 צלוחיות L כל אחד מהם 1 ליטר של מדיה שהוכנו בשלב 1.1.
  5. לגדל את התאים לצפיפות הרצויה ב30 ° C.
  6. ודא שיש לי התאים טיפות שומנים. המילואים 1 מיליליטר של התאים. מדוד את הצפיפות האופטית (OD) של המדגם. הוסף 0.1 מיליליטר של מניית מ"מ 100 של BODIPY 493/503 באתנול בקוטר חיצוני של תאים לדוגמא. מניחים 3 μl של המדגם בין שקופיות זכוכית ולהחליק את מכסה זכוכית. דמיינו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן ה-GFP (איור 1 א).
  7. גלולה תאי משלב 1.5 ב 4 & #176; C ב 3,800 XG 10 דקות. לעבוד בקבוצות בהתאם לקיבולת של צינורות צנטריפוגה.
  8. יוצקים את תקשורת YE5S ולשטוף את התאים עם חיץ של EMM + 600 מ"מ סורביטול. סורביטול מספק תמיכה האוסמוטי.
  9. להעביר את תאי צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר סטרילי וגלולת התאים ב 4 ° C XG ב 2000 10 דקות. הסר את supernatant. לשקול את התאים הרטובים. Resuspend התאים 2 מיליליטר של חיץ (EMM + 600 מ"מ סורביטול) לגרם של תאים.

2. המרת תאי שמרי ביקוע לspheroplasts ותמוגה הבאה

  1. הוסף 5 מ"ג כל אחד מ1) אנזים שמרי ממס ו2) שמרי lysing אנזימים מTrichoderma harzianum לגרם של תאים רטובים שנשקלו בשלב 1.9. עבור ס cerevisiae להגדיל את האנזימים האלה עם אותה הכמות של Zymolyase.
  2. דגירה התאים ב 30 מעלות צלזיוס מתחת עדין רועד ל60 דקות 100 סל"ד.
  3. בדוק כדי לוודא שיש לי spheroplasts ד"ר שומנים בדםoplets. על ידי חזרה על שלב 1.6 (איור 1).

3. צנטריפוגה שיפוע צפיפות

  1. גלולה spheroplasts ידי צנטריפוגה ב 4 ° C XG ב 2000 למשך 5 דקות.
  2. מוציא בזהירות את supernatant באמצעות פיפטה העברה פלסטיק.
  3. בעדינות resuspend spheroplasts הטבליות עם הקרח קר 10 מ"מ טריס-HCl, 600 מ"מ סורביטול, ו200 מיקרומטר EDTA. זכור כי spheroplasts הם מאוד שביר.
  4. גלולה spheroplasts שוב עם אותן ההגדרות כמו בשלב 3.1. מוציאים בזהירות את supernatant ו resuspend spheroplasts באמצעות פיפטה פלסטיק העברה ב12% Ficoll, 10 מ"מ טריס-HCl, ו200 מיקרומטר EDTA בריכוז של 2 מיליליטר / g-תאים.
  5. העבר spheroplasts resuspended לhomogenizer זכוכית ובעדינות homogenize על קרח, 20-30 שבץ, עם העלי הרפוי של homogenizer הזכוכית.
  6. העבר spheroplasts lysed לצינורות צנטריפוגות וכיסוי עם אותו volume של 12% Ficoll, 10 מ"מ טריס-HCl, ו200 חיץ EDTA מיקרומטר. בחר את מספר צנטריפוגות צינורות לשימוש, כך שכל צינור מלא כשני שלישים.
  7. צנטריפוגה ב 4 ° C ב100,000 XG במשך 1.5 שעות ברוטור SW28 או שווה ערך. לאפשר הרוטור לחוף לעצירה (האטת רוטור = 0).
  8. בעדינות להעביר את השכבה העליונה צף לבנה (איור 2 א), המכילה את הטיפות, לצינור חדש צנטריפוגות (ים) או באמצעות pipettor או פיפטה פסטר כפופה. הוסף מספיק נפח 12% Ficoll, 10 מ"מ טריס-HCl, ו200 חיץ EDTA מיקרומטר למדגם, כך שהוא ממלא כשליש מצינור צנטריפוגות.
  9. הוסף את ההיקף שווה הערך של 8% Ficoll, 10 מ"מ טריס-HCl, ו200 חיץ EDTA מיקרומטר לחלק העליון של הדוגמא (ו) בצינור החדש צנטריפוגות (ים). לאחר תוספת של זה חיץ הצינורות צריכים להיות כשני שליש מלא.
  10. צנטריפוגה ב 4 ° C ב100,000 XG במשך שעה 1 ברוטור SW28 או שווה ערך. לאפשר הרוטור לחוף לעצירה (r otor האטה = 0).
  11. בעדינות להעביר את השכבה העליונה צף לבנה (איור 2), שתכיל את הטיפות, לצינור חדש צנטריפוגות (ים) או באמצעות pipettor או פיפטה פסטר כפופה. הוספת 600 מ"מ סורביטול, 8% Ficoll, 10 מ"מ טריס-HCl, ו200 חיץ EDTA מיקרומטר למדגם, כך שהוא ממלא כשליש מצינור צנטריפוגות.
  12. הוסף את ההיקף שווה הערך של 250 מ"מ סורביטול, 10 מ"מ טריס-HCl, וחיץ EDTA 200 מיקרומטר לחלק העליון של הדוגמא (ו) בצינור החדש צנטריפוגות (ים). לאחר תוספת של זה חיץ הצינורות צריכים להיות כשני שליש מלא.
  13. צנטריפוגה ב 4 ° C ב100,000 XG במשך שעה 1 ברוטור SW28 או שווה ערך. לאפשר הרוטור לחוף לעצירה (האטת רוטור = 0).
  14. העבר את השכבה העליונה לבנה (איור 2 ג), שאמור להכיל רק טיפות שומנים וחלבונים קשורים, לצינורות דיאליזה, וdialyze O / N ל10 מ"מ טריס-HCl ו200 חיץ מיקרומטר EDTA לחסל Ficoll.

class = "jove_title"> 2. בידוד טיפות שומנים מתאי אדם השליה villous

שליות נאספו מנשות בריאות עם הריונות סינגלטון עוברים ניתוח קיסרי אלקטיבי משלוח לפני תחילת עבודה ספונטנית במועד. נושאים נתנו הסכמה בכתב, הודיעה לאיסוף השליה שלהם. האוסף, והשימוש הבא, של שליות בוצעו באישור מאוניברסיטת טנסי והאוניברסיטה של ​​בית הספר לרפואה של בוגרת טנסי בנוקסוויל דירקטוריון סקירה מוסדית (8757B # ו # 3338, בהתאמה).

1. בידוד תאי villous שליה אדם

חלק 1 של הפרוטוקול הוא שינוי של פרוטוקול שפורסם קודם לכן על ידי Petroff et al. 26

הכן את הפתרונות הבאים:

  • NaCl (1 ליטר): להמס 9 גרם NaCl (58.4 M g / mol) ב DH 2 O להניב פתרון 1 ליטר. סנן לעקר (0.2; מיקרומטר קרום).
  • תמיסת מלח מאוזנת של 10x האנק (10x HBSS) (1 ליטר): 4 גרם KCl (74.5 M g / mol); 0.6 KH גרם 2 PO 4 (136.086 M g / mol); 80 גרם NaCl (58.44 M g / mol); Na 2 HPO 4 (141.96 M g / mol); 10 D-גרם גלוקוז (180.16 M g / mol). להמס כל אחד מהמרכיבים בDH 2 O להניב פתרון 1 ליטר. סנן לעקר (0.2 קרום מיקרומטר).
  • חיץ אנזים עיכול (0.6 מיליליטר): לשלב 70 מיליליטר 10x HBSS עם 3.3 מיליליטר 7.5% Na Biscarbonate, 17.5 מיליליטר 1 M HEPES, ו266.1 מיליליטר DH 2 O; סנן לעקר (0.2 מיקרומטר קרום). חנות ב 4 ° C.
  • DNase אני: רק לפני השימוש, מוסיף 5 מיליליטר 0.9% סטרילי NaCl לבקבוקון של DNase. שמור על קרח עד לשימוש או חנות ב -20 ° C.
  1. שליה מתכוננת לנתיחה
    1. השג שליה ותהליך קרוב לזמן לידה ככל האפשר אנושיות. השתמש בכלי אטום כגון קריר כדי להעביר את השליה. השתמש תמיד במשנה זהירות בעת ידחומרים ביולוגיים אנושיים לינג.
    2. ב למכסת מנוע הבטיחות הביולוגית, להעביר את השליה למכל autoclavable סטרילי, ולשטוף בזהירות דם משליה וקרומים באמצעות תמיסה סטרילית 0.9% NaCl (מלח). בטל מלוח דמים בכוס 1 ליטר כפסולת ביולוגית נוזלית.
    3. מניחים את השליה בשדה סטרילי, עם המשטח החלק הנושא את חבל הטבור כלפי מעלה. עם, מספריים עדין נקודה חדה ומלקחיים להסיר קרומים עובריים וחבל טבור.
    4. להעיף את השליה על כך את פני השטח האימהיים (משטח מחוספס) פונה כלפי מעלה. להסיר את רקמת צלחת הבסיסית שמעליה, כ -3 מ"מ מעל פני השטח.
  2. לנתח את השליה
    1. לנתח טבורית אחד בכל פעם הימנעות צלחת כוריוני. איסוף רקמות villous לתוך מבחנה 250 מיליליטר עם מי מלח.
    2. יש לשטוף מספר פעמים רקמות בכוס נפרדת עם 0.9% NaCl על ידי מתערבל עם מלקחיים, תוך שימוש בכוס 1 ליטר לפסולת נוזלית.
    3. העבר את טבורית אחד בכל פעם לצלחת פטרי 150 מ"מ. מחזיק עם מלקחיים ולגרד רקמות עם סכין גילוח מכלי על צלחת פטרי. הנח רקמה מגורדת לתוך כוס נפרדת המכילה 0.9% NaCl. חזור על פעולה עבור כל פיסות הרקמה.
    4. העבר את החלק קטן של הרקמה למסננת תא דיסוציאציה ולשטוף עם 0.9% NaCl בהרחבה עד eluate הופך להיות ברור. חזור על פעולה עבור כל הרקמה.
    5. לאחר שטיפת הרקמה מגורדת במסננת התא דיסוציאציה, מסנן אותו מנוזלים ומשקל עודפים.
      בשלב זה הרקמות עשויות להיות מאוחסנים O / N בבקבוק Erlenmeyer סטרילי על 4 מעלות צלזיוס בDMEM.
  3. עיכול אנזימתי של רקמת השליה
    1. מכין את תערובת עיכול רקמה: של חיץ דילול אנזים prewarmed 100 מיליליטר, 1 מיליליטר DNase אני ו20 מיליליטר 2.5% טריפסין 10x.
    2. מחלקים את הרקמה, העברת 60 גרם מרקמות שנאספו בסך הכל (בדרך כלל על 250-300 גר ') לבקבוק Erlenmeyer סטרילי 500 מיליליטר.
    3. מוסיפה את התערובת לעיכול רקמה לבקבוק Erlenmeyer המכיל את הרקמות, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס שייקר ל45 דקות ב150 סל"ד.
  4. איסוף התאים ניתקו
    1. לאחר ניתוק דקות הראשון 45, הגדר את בקבוק העיכול בהטיה עד רקמה תשקע.
    2. לאסוף את supernatant, נזהר שלא לאסוף רקמת undissociated. מוסיף כמות שווה של HBSS לsupernatant נאסף ולהעביר לתוך צינורות 15 צנטריפוגות מיליליטר סטרילי. לחלקים נוספים של רקמת undissociated, לחזור על הליך החל מהשלב 3.2 עם רקמת undissociated.
    3. צנטריפוגה homogenate ב 4 ° C XG ב 1000 ל15 דקות.
    4. עבור כל אצווה, בעקבות צנטריפוגה, לשאוב supernatant מבלי להפריע גלולה. תאי villous השליה הם בעיקר בחלק הלבן של גלולה, שמעל תאי דם האדומים.
    5. להעביר את תאי villous (חלק לבן של גלולה) לרחerile 50 מיליליטר צינור צנטריפוגות חרוטי ולשמור על קרח.
    6. לאחר איסוף התאים מכל שלושת שלבי העיכול, לסנן את ההשעיה באמצעות מסננת תא ניילון 100 מיקרומטר מוכנסת בחלקו העליון של צינור צנטריפוגות סטרילי 50 מיליליטר חרוטי. אם הסינון של ההשעיה התא מאט, הרם כלפי מעלה על המסנן לצייר ואקום בתוך הצינור.
    7. צנטריפוגה ב 4 ° C XG ב 1000 10 דקות. מוציא בזהירות את supernatant מבלי להפריע גלולה.

2. מאחד תאי villous שליה

  1. לפני שמתחיל בתהליך הבידוד, להכין 50 מיליליטר של hypotonic תמוגה בינוני (HLM) המכיל 20 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4 ו1 mM EDTA. הוספת מעכבי פרוטאז לHLM רק לפני השימוש ולשמור את המדיום על קרח.
  2. ב למכסת מנוע הבטיחות הביולוגית, להוסיף 4 פעמים את התא גלולה נפח HLM קר כקרח לתאים. בעדינות וביסודיות resuspend התאים על ידי pipetting התאים למעלהד למטה באמצעות פיפטה 10 מיליליטר.
  3. דגירה התאים התלויים על קרח דק 10.
  4. להעביר את תאי homogenizer Dounce, שאמורה להיות על קרח. לאט homogenize התאים על ידי יישום 20-25 משיכות עדינות עם העלי הרפוי של homogenizer.
  5. צנטריפוגה lysate התא על 4 מעלות צלזיוס ב3,000 XG במשך 10 דקות כדי להסיר תאים רצופים, פסולת וגרעינים סלולריות.
  6. לאסוף את supernatant ולהעביר לצינור SW28 (או חלופה שניתן centrifuged ב25,000 XG). צנטריפוגה ב 4 ° C ב25,000 XG עבור 20 דקות כדי להסיר את המיטוכונדריה.

3. בידוד טיפות שומנים על ידי ultracentrifugation

  1. הכן 50 מיליליטר של 100 סודיום קרבונט מ"מ (M 106 g / mol) חיץ (pH 11.5) וסוכרוז 50 מיליליטר של 60% פתרון (w / w). הוסף מעכבי פרוטאז למאגר סודיום קרבונט רק לפני השימוש ולשמור על קרח.
  2. לאסוף את supernatant משלב 2.6 לתוך צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר, להתאים20% של סוכרוז והעברה לתוך החלק התחתון של צינור ultracentrifuge לרוטור SW28, או שווה ערך. supernatant צפיפות כיסוי מותאם עם ~ 10 מיליליטר של חיץ קר כקרח פחמה 100 נתרן מ"מ (pH 11.5) ו0.5-1 מיליליטר של HLM קר כקרח כדי למלא את הצינור.
  3. צנטריפוגה ב C ° 4 ב130,000 XG דקות 45 באמצעות הרוטור דלי מתנדנד SW28. לאפשר הרוטור לחוף לעצירה (האטת רוטור = 0).
  4. לאסוף את השכבה הצפה, להסתגל לסוכרוז 10% ולהעביר לתוך החלק התחתון של צינור ultracentrifuge 13.2 מיליליטר לרוטור SW41Ti, או שווה ערך. צפיפות כיסוי יותאם supernatant עם כ -5 מיליליטר של חיץ קר כקרח סודיום קרבונט 100 מ"מ (pH 11.5) ו0.5 מיליליטר של HLM קר כקרח.
  5. צנטריפוגה ב C ° 4 ב274,000 XG במשך 60 דקות באמצעות הרוטור דלי מתנדנד SW41Ti. לאפשר הרוטור לחוף לעצירה (האטת רוטור = 0) כדי למזער את ההפרעה של שכבת טיפת שומנים בדם.
  6. לאסוף את השכבה הצפה העליונה (איור 2 ד) המכילה בזהירותטיפות שומנים עם טפטפת מיליליטר 1 וחזור על שלב 3.4.
  7. צנטריפוגה ב C ° 4 ב274,000 XG במשך 30 דקות באמצעות הרוטור דלי מתנדנד SW41Ti. לאפשר הרוטור לחוף לעצירה (האטת רוטור = 0).
  8. לאסוף בזהירות את שכבת הציפה בצבע לבנה העליונה המכילה טיפות שומנים עם פיפטה פסטר כפופה לשלושה 1.5 מיליליטר צינורות המכילים 100 HLM μl.

שבריר טיפות שומנים אפיון (פרוטוקולי 1 ו -2)

ההתאוששות והטוהר של שבריר טיפת שומנים בדם יכולים להיות מאומתת על ידי הכתם המערבי בשילוב עם אור או במיקרוסקופ אלקטרונים. בנוסף, ניתן לאסוף aliquots לאחר צעדי צנטריפוגה שונים ונשמרים לקביעת יעילות טיהור. במערבי סופג, זה מתאים יותר להשוואת היקף של שבריר אגל שומנים המייצג שווה ערך של כל התא lysate מאשר השוואת טיפות שומנים לשברים קרום אחרים על tהוא הבסיס של תכולת חלבון כוללת 24.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אם צנטריפוגה שיפוע הצפיפות עבדה כצפוי, את השכבה הצפה צריכה להכיל טיפות שומנים ולהיות מדולדלת של אברונים אחרים בהתקדמות של הספינים במהירות גבוהה.

לפרוטוקול 1, כתמים מערביים בוצעו עם נוגדני סמן לטיפי שומנים (Erg6p), ואברונים שכבר נמצאו באינטראקציה עם טיפות שומנים בשמרים, ER (Dpm1p), מיטוכונדריה (Por1p), קרום פלזמה (Pma1p), ווקואולות (Vma1p).

כמויו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלבים קריטיים בפרוטוקול זה

הפוך להיות עקבי עם תקשורת וצפיפות תאים במהלך הצמיחה של תאים בתרבית בטוח. טיפות שומנים נייד הן ייחודיות בכך שהחלבונים הקשורים שלהם תלויים במידה רבה על הסביבה שבה התאים 17 בתרבית. לכן, אמצעי התקשורת שבו התאים גדלים והצפיפות של התאים צריכים להיות תחת פיקוח הדוק לפני תמוגה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הפרס איגוד לב האמריקאי 13SDG14500046 לפ"ד, חינוך בר קיימא באנרגיה ומחקר מרכז פרס (אוניברסיטת טנסי) לפ"ד, ועל ידי החינוך הרפואי 'הרופאים וקרן מחקר (אוניברסיטת טנסי) הפרס לג' מחברים מודים קרוליין Leplante (ייל Univ.) לפרוטוקול להמרת שמרי ביקוע לspheroplasts; אריק ט Boder (אוניברסיטת טנסי) לשימוש בחממות שלו רועדות, צנטריפוגה שולחן, וציוד ניתוח כתם המערבי, והמרכז עבור הסביבה ביוטכנולוגיה (אוניברסיטת טנסי) לשימוש באולטרה צנטריפוגה; גינטר דאום לשמרי נוגדנים (גראץ אונ טכנולוגי, אוסטריה.); כוח האדם של המחלקה למיילדות וגניקולוגיה (המרכז רפואי טנסי Univ.) לקבלת סיוע טכני .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>פרוטוקול 1
<חזק>1. גידול תאי שמרים והמרה לספרופלסטים
אדינבורו מדיה מינימלית (EMM)Sunrise Science Products2005
עם 5 תוספים (YE5S)Sunrise Science Products2011YE5S Media עם 225 מ"ג/מ"ל מכל תוסף: אדניני, היסטידין, לאוצין, ליזין, אורציל. המקבילה לשמרים ניצנים תהיה YPD.
אבקת YPDSunrise Science Products1875עבור S. cerevisiae
SorbitolFisher ScientificBP439
אנזים ליטישמרים MP ביו-רפואי215352610
אנזימי ליסינג מ-Trichoderma harzianumSigma-AldrichL1412
Zymolayse-20TSunrise Science ProductsN0766391עבור S. cerevisiae
BODIPY 493/503InvitrogenD-3922
שקופיות מיקרוסקופפישר סיינטיפיק12-544-7
כיסוי מיקרוסקופ זכוכיתפישר סיינטיפיק12-542-B
פיפטה להעברת פלסטיקפישר סיינטיפיק137115AM
1 ליטר
בקבוק זכוכית250 מ"ל בקבוק
2.8 ליטר צלוחיות <חזקות
>2. בידוד טיפות שומנים שמרים
Tris-HClפישר סיינטיפיקBP153
EDTAפישר סיינטיפיקBP120
Ficoll 400פישר סיינטיפיקBP525
12-14k ספקטרום/פור דיאליזהספקטרום SpectrumLabs132680
טבליות קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTARoche Diagnostics11873580001הומוגנייזר Dounce מגרה
 Sigma-AldrichD9938
25 מ"מ x 89 מ"מ (עבור SW28)Beckman-Coulter355642
ספקטרום ממברנת דיאליזה 12-14k ספקטרום/פורספקטרום SpectrumLabs132680
שייקר מבוקר טמפרטורהניו ברונסוויק סיינטיפיקC25KC
Thermo Sorvall Legend XTR צנטריפוגהתרמו-מדעית75004521
רוטור צנטריפוגה דלי מתנדנדThermo-Scientific75003607
Fiberlite* F15-6x100Y רוטור בזווית קבועהThermo-Scientific75003698
אולטרה-צנטריפוגה LB-MBeckman-Coulter
SW28 רוטור אולטרה-צנטריפוגהבקמן-קולטר342204
<חזק>פרוטוקול 2
<חזק>1. בידוד תאי שליה
רפידות תחתונות חד פעמיותפישר סיינטיפיק23666062
מחבת ניתנת לחיטוי (מיכל), 3 ליטרפישר סיינטיפיק1336110
מספריים עדינות, חדים-חדים, ישריםכלים מדעיים עדינים1406011
LondonForceps Fine Science Tools1108002
Dumont #7b מלקחייםFine Science Tools1127020
סכיני גילוחFisher ScientificS65921
מסך עבור CD-1Fisher ScientificS1145
40 מסך רשת פישר סיינטיפיקS0770
מכתמי תאים של פישרברנד 100 μ mפישר סיינטיפיק22363549
150 מ"מ צלחות פטריפישר סיינטיפיקNC9054771
NaClפישר סיינטיפיקS642
KClפישר סיינטיפיקP333
KH2PO4Fisher ScientificP386
Na2HPO 4Fisher ScientificS374
D-גלוקוזפישר סיינטיפיקD16
HEPESFisher ScientificBP310
2.5% טריפסין 10xInvitrogen15090046
DNase I דרגה II, מלבלב בקרRoche Applied Science10104159001
תמיסתנתרן ביקרבונטSigma-AldrichS8761
500 מ"ל צלוחיות
250 מ"ל כוסות
15 מ"ל צינורות
10 מ"ל פיפטות סרולוגיות
50 מ"ל צינורות צנטריפוגה
DMEMInvitrogen11965084
<חזק>2. בידוד טיפות שומן מתאי שליה וילוסיים
Tris-HClFisher ScientificBP153
EDTAFisher ScientificBP120
D-סוכרוזFisher ScientificBP220
סודיום קרבונט פישר סיינטיפיקBP357
מעכב פרוטאז ללא EDTA טבליות קוקטיילRoche Diagnostics11873580001מגרה
Dounce הומוגנייזר Sigma-AldrichD9938
25 מ"מ x 89 מ"מ (עבור SW28)Beckman-Coulter
Ultra-Clear 14 מ"מ x 89 מ"מ (עבור SW41)Beckman-Coulter344059
חד פעמי זכוכית בורוסיליקט צנרת פסטרפישר סיינטיפיק1367820C
קולט אדים לבטיחות ביולוגית Thermo-Scientific
WaterbathFisher Scientific
שייקר מבוקר טמפרטורהניו ברונסוויק סיינטיפיקC25KC
Thermo Sorvall Legend XTR צנטריפוגהתרמו-מדעית75004521
מתנדנד דלי צנטריפוגה רוטורתרמו-מדעי75003607
אולטרה-צנטריפוגה LB-Mבקמן-קולטר
SW28 רוטור אולטרה-צנטריפוגהבקמן-קולטר342204
SW41 Ti רוטור אולטרה-צנטריפוגהבקמן-קולטר331336
<כתם מערבי>חזק
IRDye 680 עז נגד ארנב IgGLI-COR926-68071דילול 1:15,000
IRDye 800CW עז אנטי-עכבר IgGLI-COR926-32210דילול 1:5,000
NuPAGE Novex 12% ג'ל ביס-טריסInvitrogenNP0341
<חזק>נוגדנים ראשוניים לפרוטוקול 1
Erg6pמתנה מד"ר G. DaumGraz האוניברסיטה הטכנולוגית של גראץ, אוסטריהדילול 1:5,000
Dpm1pAbcamab1136864 μ גרם/מ"ל
מתנת Por1pמד"ר ג. דאוםהאוניברסיטה הטכנולוגית של גראץ, אוסטריהדילול 1:5,000
Pma1pמתנת ד"ר ג. דאוםהאוניברסיטה הטכנולוגית של גראץ, אוסטריהדילול 1:10,000
Vma1p (אנטי-ATP6V1A)Abcamab1137450.5 μ גרם/מ"ל
<חזק>נוגדנים ראשוניים לפרוטוקול 2
פריליפין 2 (אנטי-ADFP)Abcamab523552 μ גר'/מ"ל
טכנולוגיית איתות תאיםCalnexin2679דילול 1:1,000
GM130Biorbytorb40533דילול 1:25
COX IVטכנולוגיית איתות תאים4850דילול 1:1,000
MEK1Biorbytorb38775דילול 1:50
תמצית שמרים צינורות אולטרה-צנטריפוגה ארלנמאיירצנטריפוגהצינורות אולטרה-צנטריפוגה צינורות צנטריפוגה 355642

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ploegh, H. L. A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the endoplasmic reticulum. Nature. 448, 435-438 (2007).
  2. Herker, E. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat. Med. 16, 1295-1298 (2010).
  3. Ding, Y. F., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nat. Protoc. 8, 43-51 (2013).
  4. Kalscheuer, R., et al. Preparative isolation of lipid inclusions from Rhodococcus opacus and Rhodococcus rubber and identification of granule-associated proteins. Arch. Microbiol. 177, 20-28 (2001).
  5. Low, K. L., et al. Lipid droplet-associated proteins are involved in the biosynthesis and hydrolysis of triacylglycerol in mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin. J. Biol. Chem. 285, 21662-21670 (2010).
  6. Leber, R., Zinser, E., Zellnig, G., Paltauf, F., Daum, G. Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 10, 1421-1428 (1994).
  7. Grillitsch, K., et al. Lipid particles/droplets of the yeast Saccharomyces cerevisiae revisitied: lipidome meets proteome. Biochim. Biophys. Acta. , 1165-1176 (2011).
  8. Binns, D., et al. An intimate collaboration between peroxisomes and lipid bodies. J. Cell Biol. 173, 719-731 (2006).
  9. Ivashov, V. A., et al. Lipidome and proteome of lipid droplets from the methylotropic yeast Pichia pastoris. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 282-290 (2013).
  10. Connerth, M., Grillitsch, K., Kofeler, H., Daum, G. Analysis of lipid particles from yeast. Lipidomics: Vol. 1: Methods and Protocols. 579, 359-374 (2009).
  11. Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods Mol. Biol. 457, 151-163 (2008).
  12. Jolivet, P., et al. Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS. Plant Physiol. Biochem. 42, 501-509 (2004).
  13. Katavic, V., Agrawal, G. K., Hajduch, M., Harris, S. L., Thelen, J. J. Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivers. Proteomics. 6, 4586-4598 (2006).
  14. Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol. Cell. Proteomics. 11, 317-328 (2012).
  15. Krahmer, N., Hilger, M., Kory, N., Wilfling, F., Stoehr, G., Mann, M., Farese, R. V., Walther, T. C. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol. Cell Proteomics. 12, 1115-1126 (2013).
  16. Cermelli, S., Gou, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. The lipid-droplet proteome reveals that droplets are a protein-storage depot. Curr. Biol. 16, 1783-1795 (2006).
  17. Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J. Biol. Chem. 279, 46835-46842 (2004).
  18. Liu, P. S., Ying, Y. S., Zhao, Y. M., Mundy, D. I., Zhu, M. F., Anderson, R. G. W. Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be metabolic organelles involved in membrane traffic. J. Biol. Chem. 279, 3787-3792 (2004).
  19. Fujimoto, Y., et al. Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7. Biochim. Biophys. Acta. , 47-59 (2004).
  20. Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. J. Biochem. 139, 921-930 (2006).
  21. Umlauf, E., Csaszar, E., Moertelmaier, M., Schuetz, G. J., Parton, R. G., Prohaska, R. Association of stomatin with lipid bodies. J. Biol. Chem. 279, 23699-23709 (2004).
  22. Zhang, H. N., et al. Proteome of skeletal muscle lipid droplet reveals association with mitochondria and apolipoprotein A-I. J. Proteome Res. 10, 4757-4768 (2011).
  23. Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).
  24. Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).
  25. Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic. 13, 705-714 (2012).
  26. Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
  27. Cho, S. Y., et al. Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets. J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).
  28. Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse. Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).
  29. Jagerstrom, S., et al. Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23. Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).
  30. Xu, N. Y., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).
  31. Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane. J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).
  32. Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors. Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).
  33. Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
  34. Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria. Protein Cell. 2, 487-496 (2011).
  35. Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres. Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).
  36. Goodman, J. M. The gregarious lipid droplet. J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).
  37. Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion. J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Lipid Droplet IsolationDensity Gradient CentrifugationYeast SpheroplastsPlacental Villus CellsFicoll GradientSucrose GradientWestern Blot AnalysisFluorescence MicroscopyProteomic AnalysisLipidomic Analysis

מאמרים קשורים