מאמר שיטה

Nucleofection של neuroblasts מכרסמים לחקר הגירת neuroblast

DOI:

10.3791/50989

⸱

12 בנובמבר 2013

 ,  ,  ,  , 
1Wolfson Centre for Age-Related Diseases, King's College London, 2MRC Centre for Developmental Neurobiology, King's College London

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגירת neuroblast היא צעד חיוני בנוירוגנזה לאחר לידה. הפרוטוקול מתואר כאן ניתן להשתמש בם כדי לחקור את התפקיד של רגולטורים מועמד של הגירת neuroblast ידי העסקת nucleofection DNA / RNA סיכת הראש קטן (shRNA) וassay הגירת 3D עם neuroblasts מבודדת מהזרם הנודדות מקורי לאחר הלידה המכרסם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אזור subventricular (SVZ) הממוקם בקיר לרוחב של החדרים לרוחב ממלא תפקיד מהותי בneurogenesis למבוגרים. באזור מוגבל זה של המוח, תאי גזע עצביים להתרבות וליצור כל הזמן neuroblasts שנודדים בנקודת השקה ברשתות לאורך הנחל מקורי נודד (RMS) כדי להגיע לנורת חוש הריח (OB). פעם אחת בOB, neuroblasts לעבור להגירה רדיאלי ולאחר מכן להתמיין לתאים בוגרים מסוגלים לשלב ברשת העצבית שכבר קיימת. הגירת neuroblast הנכונה היא צעד מהותי בנוירוגנזה, על מנת להבטיח את ההבשלה הפונקציונלית הנכונה של נוירונים יילוד. בהתחשב ביכולת של neuroblasts נגזר SVZ להתמקד באזורים פגועים במוח, חוקר את המנגנונים תאיים בבסיס תנועתיות שלהם לא רק לשפר את ההבנה של נוירוגנזה אלא גם עשוי לקדם את הפיתוח של אסטרטגיות neuroregenerative.

כתב יד זה מתאר מפורטפרוטוקול עבור transfection של מכרסם העיקרי RMS neuroblasts לאחר לידה והניתוח של תנועתיות שלהם באמצעות במבחנה assay הגירת 3D משחזר מצבם של הגירה ציין in vivo. שתי neuroblasts החולדה והעכבר יכולה להיות במהירות וביעילות transfected באמצעות nucleofection גם עם ה-DNA פלסמיד, סיכת ראש קטן RNA (sh) או התערבות קצרה (si) oligos RNA מיקוד גנים של עניין. כדי לנתח את ההגירה, תאי nucleofected הם reaggregated ב'טיפות תלויות 'ולאחר מכן משובץ במטריצה ​​תלת ממדית. Nucleofection כשלעצמו אינו פוגעים באופן משמעותי את ההגירה של neuroblasts. טיפול תרופתי של neuroblasts nucleofected וreaggregated גם ניתן לבצע כדי ללמוד את התפקיד של איתות מסלולים מעורבים בהגירה neuroblast.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביונקים לאחר הלידה המוח, הדור של נוירונים חדשים (נוירוגנזה) מתרחש לאורך כל חיים, והוא מוגבל לשתי נישות נוירוגנית: אזור subventricular (SVZ) של החדרים לרוחב ואזור subgranular של gyrus משוננת של ההיפוקמפוס 1. מספר מחקרים שנעשו לאחרונה הראו את התפקיד החשוב של neurogenesis למבוגרים בהנחיית משימות למידה וזיכרון 2,3. יתר על כן, ראיות של התפשטות וגיוס של אבות עצביים בעקבות פגיעה מוחית 4-7 מעלה את האפשרות של הפעלה תרופתית הנוירוגנזה בתיקון עצבי.

נוירוגנזה אחרי לידה מוסדרת בקפדנות בכל שלביה, הכוללים ריבוי עצבי אב, הגירה, התמיינות, הישרדות, ואינטגרציה הסינפטי סופית של נוירונים שזה עתה נולד 8. אבות עצביים (neuroblasts) שמקורם בתאי גזע בSVZ נודדים על פני מרחקים גדולים באמצעות הנודדות מקוריזרם (RMS) לכיוון הנורה חוש הריח (OB) שבו הם יבשילו לנוירונים פונקציונליים 9. neuroblasts נודדת הן בעיקר חד קוטבי, עם גוף תא מוארך הארכת תהליך מוביל אחד. תאים אלה עוברים ברשתות באופן קולקטיבי, מחליקים על אחד 10 אחרת. הגירה היא צעד חיוני להבשלה המאוחרת של אבות נגזרים SVZ לנוירונים פונקציונלי 11 ונשלטת על ידי גורמים רבים ומולקולות הנחיה כוללים: מולקולת polysialylated העצבית הידבקות תא (PSA-NCAM) 12, 13 Ephrins, Integrins 14, 15 חרכים, צמיחת גורמי 16 ונוירוטרנסמיטורים 17, לעומת זאת המנגנונים המולקולריים שבבסיס התהליך הזה אינם מובנים במלואם. חוקר את מסלולי איתות תאיים הסדרת הגירת neuroblast לא רק לספק הבנה טובה יותר של neurogenesis למבוגרים, אלא גם יתרום להתפתחות הטיפולית החדשגישות לקידום תיקון מוח.

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט ללמוד את התפקיד של רגולטורים מועמד של הגירת neuroblast במבחנה באמצעות nucleofection וassay הגירת 3D. Nucleofection הוא טכניקת transfection תא המבוססת על שיטה משופרת של electroporation. הנוכחי תאים מהסוג ספציפי חשמל ופתרון nucleofection לאפשר ההעברה של מקרומולקולות polyanionic כגון וקטורי DNA וshRNA וoligonucleotides siRNA ישירות לתוך גרעין התא וtransfection היתר של החלוקה לאט או mitotically תאים פעילים כמו תאי עצב עובריים ויונקים 18. שיטה זו היא מהירה, קלה יחסית לביצוע והתוצאות בtransfection השחזור מאוד של מגוון רחב של סוגי תאים, כולל תאי עצב וneuroblasts 19-21 העיקריים.

דיסוציאציה של רקמת RMS מאפשרת הבידוד של neuroblasts נודד, אשר ניתן nucleofected בהצלחה עם ה-DNA / SHRוקטורי NA או oligos siRNA מיקוד גנים של עניין. בעקבות nucleofection, neuroblasts הם reaggregated בתליית טיפות ומשובצות לאחר מכן במטריצת Matrigel תלת ממדי. תנאים אלה מאפשרים neuroblasts להגר אל מחוץ לאגרגטים התא משחזרים את מצב ההגירה נצפה in vivo, ובכך לספק מערכת מודל מצוינת לחקור מסלולי איתות מעורבים בהגירה neuroblast ולהעריך את השפעתם של טיפולים תרופתיים בתנועתיות של תאים אלה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הליך זה הנו בהתאם לתקנות בבריטניה המשרד הביתית (חוק נהלי בעלי החיים מדעיים, 1986). מדענים צריכים לעקוב אחר ההנחיות שנקבעו ואושרו על ידי ארגוני בעלי החיים שלהם מוסדיים ולאומיים רגולציה.

1. נתיחה ודיסוציאציה של neuroblasts RMS עכברוש

  1. הכן את הפתרונות הנדרשים לנתיחה RMS ודיסוציאציה:

מדיום לנתיחה (100 מיליליטר)
תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) - 98.5 מיליליטר
5 M HEPES pH 7.4-0.5 מיליליטר
פניצילין, סטרפטומיצין (10,000 יחידות / מיליליטר ו -10,000 מיקרוגרם / מיליליטר) - 1 מיליליטר

בינוני דיסוציאציה (2 מיליליטר)
HBSS - 1.760 מיליליטר
10x טריפסין (2.5%) - 200 μl
DNAse1 (1 מ"ג / מיליליטר) - 40 μl

השתנה Dulbecco בינוני של הנשר (DMEM) + 10% עגל בסרום עוברי (FCS) (40 מיליליטר)
DMEM -36 מיליליטר
FCS - 4 מיליליטר

בינוני מלא (12 מיליליטר)

בינוני neurobasal - 11.46 מיליליטר
תוסף B27 - 250 μl
L-גלוטמין (200 מ"מ) - 125 μl
גלוקוז (45%) - 165 μl

2. סנן לעקר FCS% DMEM + 10 ובינוניים המלא וpreequilibrate בC / 5% CO 2 באינקובטור 37 מעלות.

  1. בתור
    1. להקריב המלטת P6-P7 חולדה (כ 12 גורים) על ידי נקע בצוואר הרחם ולערוף במספריים.
    2. עושה חתך anteroposterior בעור לאורך תפר אמצע sagittal מהאף למוח הקטן עם להב סכין מנתחים. לקלף את העור וחוזר על אותן החתך לאורך הגולגולת.
    3. להסיר בעדינות את דשי גולגולת עם מלקחיים ולהסיר בזהירות את המוח עם מרית, מקפיד לכלול את נורות חוש הריח.
    4. חותכים את שליש הזנב ביותר של המוח וזורקים אותו.
    5. קוצץ הרקמת מוח דואר ל1.4 מ"מ פרוסות העטרה עבה באמצעות מסוק רקמות.
    6. מניחים פרוסות במאכלים המכילים מדיום לנתיחה קרה ולהפריד ביניהם בזהירות באמצעות מחט.
    7. RMS מופיע כמשולש, אזור שקוף במרכז חלקי OB וכשטח קטן, עגול בפרוסות מוח הזנב יותר. חותכים את RMS מכל פרוסה עם סכין microsurgical, מקפיד להימנע מלכלול רקמה שמסביב. בגורי החולדה P7, בדרך כלל ~ 8 פרוסות מקורי ביותר (כולל OB) מכילות RMS.
    8. לאסוף את שברי RMS עם פיפטה פסטר מפלסטיק ומניח אותם בצלחת קטנה המכילה מדיום לנתיחה קרה על קרח.
    9. כאשר הנתיחה הושלמה, להעביר את שברי RMS לתוך צינור 15 מיליליטר עם טפטפת פלסטיק. עזוב את הברים להתיישב בחלק התחתון של הצינור.
  2. דיסוציאציה
    1. החלף את המדיום לנתיחה עם 2 מיליליטר של מדיום דיסוציאציה.
    2. Triturate ברי RMS בעדינות על ידי pipetting ההשעיה הבר למעלה ולמטה על 10x באמצעות פיפטה P1000.
    3. השאר את הצינור עם שברי הרקמה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
    4. פיפטה את הפתרון שוב 10x ולהבטיח כי שברים שניתקו (ההשעיה צריכה להיות מעונן).
    5. להשבית טריפסין על ידי הוספת 5 מיליליטר של DMEM + FCS 10% prewarmed.
    6. צנטריפוגה ההשעיה התא ב433 XG במשך 5 דקות.
    7. בaliquot בינתיים את הכמות הנדרשת של siRNA / דנ"א לתוך צינורות Eppendorf (בדרך כלל 3-5 DNA מיקרוגרם / shRNA או 5-9 אוליגו siRNA מיקרוגרם לnucleofection, עם זאת כמות ה-DNA / siRNA עשויה לדרוש אופטימיזציה).
    8. הסר בינוני עודפת וresuspend התא גלולה על ידי pipetting העדין ב 5 מיליליטר של DMEM + FCS 10% prewarmed.
    9. לבצע ספירת תאים. מצפה ~ 1 x 10 6 תאים למוח גור חולדה. מינימום של 2.5 x 10 6 תאים נדרשים לכל nucleofection, בעודתוצאות אופטימליות מושגות באמצעות 3-4 x 10 6 תאים לכל nucleofection.
    10. צנטריפוגה ההשעיה התא ב433 XG במשך 5 דקות. הקפד להסיר כמה שיותר בינוני ככל האפשר.

2. Nucleofection

  1. מייד resuspend התא גלולה בחולדה (או עכבר, אם תוך שימוש בתאי עכבר) פתרון nucleofection נוירון מודגרות בעבר בטמפרטורת חדר. השתמש לnucleofection 100 μl הערה:. בדרך כלל המלטת עכברים של 12 גורים היא מספיק כדי לבצע 4 nucleofections והמלטת עכבר (12 גורים) היא מספיק כדי לבצע 2 nucleofections.
  2. העברת ההשעיה התא 100 μl לכל צינור Eppendorf המכיל siRNA / DNA ומערבבים בעדינות 2-3x ידי pipetting עם טפטפת P200.
  3. הוסף את המדגם (ההשעיה cell-DNA/siRNA) לחלק התחתון של nucleofectioncuvette, לטפל כדי למנוע בועות.
  4. Nucleofect באמצעות תכנית ה-G-013 (לתאי חולדה) או O-005 (עבורתאי עכבר). nucleofection אחד לוקח כ 5 שניות.
  5. מהירות להוסיף 1 מיליליטר של DMEM + FCS 10% prewarmed מדגם nucleofected.
  6. חזור על שלבים 2.4 ו2.5 לכל דוגמאות אחרות. הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות, ההליך כולו nucleofection צריך להימשך לא יותר מ 5 דקות.
  7. העבר כל מדגם לצינור 15 מיליליטר המכיל 5 מיליליטר של DMEM + 10% FCS prewarmed באמצעות פיפטה הפלסטיק הניתנת על ידי ערכת nucleofection. הימנע מהעברה כל פסולת הסלולר לצינור.
  8. צנטריפוגה דגימות 433 XG במשך 5 דקות.
  9. מוציא בזהירות את כל המדיום העודף וresuspend את הכדור ב25-30 μl של DMEM + 10% FCS prewarmed באמצעות פיפטה P20. אין להשתמש יותר מ 30 μl של מדיום.
  10. פיפטה ההשעיה כמו טיפה על הצד הפנימי של מיכסה צלחת P35.
  11. הפוך את המכסה על צלחת P35 המכילה 2 מיליליטר של מדיום שלם (ראה גם איור 1).
  12. השאר בחממה (CO 2 37 ° C / 5%) בשעה 5 לפחות ועד 7 שעות. זמן דגירה ארוך יותר מאפשר reaggregation טוב יותר של צבירי תאים.
  13. להעביר את הטיפות התלויות מהמכסה לתוך המדיום השלם בצלחת באמצעות פיפטה P1000 עם קצה חתוך.
  14. לדגור על 37 ° C / 5% CO 2 למשך 24 שעות לnucleofections DNA ו48 שעות לnucleofections siRNA / shRNA.

3. הטבעה

  1. הכן בינוני מלא (25 מיליליטר) וpreequilibrate זה על 37 ° C / 5% CO 2 למשך כמה שעות.
  2. קח את aliquots הקפואים של מטריצת קרום במרתף ממקפיא -80 ° C ו להפשיר על קרח בחדר הקר.
  3. לכל nucleofection להכין צלחת 6 סנטימטר המכילה עד שמונה coverlips סטרילי 13 מ"מ.
  4. מניחים את הכלים בתיבת קרח מכוסים בניילון. זה חשוב כדי לשמור על coverslips מגניב כדי למנוע התמצקות מטריקס במהלך הליך ההטבעה.
  5. כדי לשמור על לחות, במקום רצועה של רקמה לחה בתוך צלחת 15 סנטימטר כי wחולה לשמש כדי להחזיק עד שלוש מנות 6 סנטימטר המכילות neuroblasts המשובץ.
  6. הוסף בינוני מלא למטריצה ​​מופשרת ביחס 1:3. לדוגמא, לערבב 40 μl של מדיום להשלים עם 120 μl של מטריצה ​​על ידי pipetting. סכום זה של מטריצה ​​מספיק להטבעת מצרפים על שמונה coverslips 12 מ"מ.
  7. העבר את צבירי תאי reaggregated לצינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 433 XG במשך 5 דקות.
  8. הסר בינוני עודפת וresuspend את הכדור ב10 μl של מדיום שלם.
  9. מניחים 2 μl של השעיה המצרפי תא על coverslip כל סטרילי ולהוסיף 18 μl של מטריצה ​​/ תערובת בינונית מלאה. השתמש בקצה פיפטה כדי להפיץ את המטריצה ​​על כל coverslip.
  10. מייד מניח את צלחת 6 סנטימטר המכילה coverslips בצלחת 15 סנטימטר ולהשאיר בחממה (CO 2 37 ° C / 5%) ל15-20 דקות. כאשר המטריצה ​​יש הקרושה, בעדינות להוסיף 5 מיליליטר בינוני מלא לכל טיפול לקיחת מנה 6 סנטימטר לדחוףאת כל coverslip צף עם קצה פיפטה.
  11. דגירה של 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס / 5% CO 2 לתת neuroblasts להעביר מתוך אגרגטים התא.

4. 3D הגירת Assay

  1. הכן את הפתרונות דרושים לimmunostaining.
    1. הכן את פתרון הבלוק:
      פתרון לחסום עיזים (50 מיליליטר)
      בופר פוספט (PBS) - 5 מיליליטר
      סרום עיזים - 7.5 מיליליטר
      10% טריטון X-100-1.5 מיליליטר
      BSA - 50 מ"ג
      H 2 O - 36 מיליליטר
    2. סינון ולאחסן ב 4 ° C.
    3. הכן את פתרון תיקון:
      תיקון פתרון (100 מיליליטר)
      Paraformaldehyde (PFA) - 4 גרם זהירות: תמיד להתמודד עם PFA מתחת למכסת מנוע
      סוכרוז - 20 g (אופציונלי)
      PBS עד 100 מיליליטר
    4. על פלטה חשמלית ותחת בחישה מתמדת לפזר את PFA ב80 מיליליטר PBS נשמר ב65 ° C.
    5. ברגע שPFA נמס, להוסיף 20 גרם של סוכרוז.
    6. התאם ל-pH7.4 (בדרך כלל על ידי הוספה ~ 60 μl 1 M NaOH לפתרון 100 מיליליטר).
    7. להביא עד נפח כולל של עם PBS 100 מיליליטר.
  2. Immunostaining
    1. הנח coverslips בצלחת 24 גם.
    2. יש לשטוף coverslips עם PBS 2x.
    3. תקן מצרפי neuroblast RMS עם פתרון תיקון ל45 דקות בטמפרטורת חדר.
    4. יש לשטוף coverslips עם 3x PBS (5 דקות / לשטוף - על פלטפורמת נדנדה).
    5. חסום לדקות 30-60 עם פתרון לחסום עז.
    6. מדולל נוגדנים עיקריים בפתרון לחסום עז ודגירת הלילה בשעה 4 ° C. (אם תרצו, phalloidin ניאון (1:400) ולצבוע Hoechst (1:10,000) ניתן גם להוסיף לפתרון הנוגדן הראשוני לדמיין אקטין וגרעיני פילמנטיות).
    7. יש לשטוף coverslips עם PBS 3x (5 דקות / לשטוף).
    8. מדולל נוגדנים משני בפתרון לחסום עז ודגירה עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר.
    9. יש לשטוף coversliנ.ב. עם 3x PBS (5 דקות / לשטוף)
    10. הר coverslips עם מדיום הרכבה ניאון ולהשאיר לייבוש למשך הלילה בטמפרטורת חדר.
  3. ניתוח הגירה
    1. צלם תמונות של אגרגטים neuroblast RMS קבועים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מטרת 10X. כולל סרגל קנה מידה בתמונה לדוגמא.
    2. כדי להגדיר את קנה המידה לכימות, למדוד את סרגל קנה מידה בתמונה על ידי בחירה באפשרות "הקו ישר" בסרגל כלי ImageJ.
    3. בחר את האפשרות "לנתח" ולחץ על 'קבע את קנה המידה ".
    4. בחלון קנה המידה להגדיר את 'המרחק הידוע "וסמן את התיבה' הגלובלית 'כדי לשמור על אותן ההגדרות לכל המדידות.
    5. השתמש בכלי 'הקו מקוטע' בסרגל כלי ImageJ כדי למדוד את המרחק מהקצה של המצרף לneuroblast היגרה הרחוקה ב6 מגזרים שונים ברחבי הצירוף כולו (איור 3). שקול רק AG מבודדתgregates לניתוח.
    6. חישוב מרחק הגירה ממוצע מהערכים 6 התקבלו לכל המצרפי.
    7. מדוד 10-20 מצרפים עבור כל תנאי בכל עצמאי תוצאות ניסוי ובריכה ממינימום של שלושה ניסויים בלתי תלויים. תמיד כולל שליטת nucleofection (למשל. GFP או sh שליטה / siRNA).

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuroblasts ניתן לבודד בהצלחה מהרקמה הגזורה RMS (איור 1 א) ומשובץ במטריצה ​​תלת ממדית. תאים מבודדים או עכברוש או RMS לאחר הלידה עכבר הם immunopositive עבור סמני neuroblast נודדים, כגון doublecortin, טובולין βIII או PSA-NCAM (איורים 1 ב-C) (DCX).

neuroblasts ניתקה ניתן nucleofected ביעילות עם ה-DNA (למשל. פלסמיד ה-GFP-קידוד, איור 2) או פלסמידים shRNA (איור 4) כדי להשיג דלדול חלבון, אשר יכול להיות מוערכים על ידי ניתוח כתם מערבי (איור 4) או immunofluorescence (לא מוצגים) .

תאי nucleofected עם פלסמידים קידוד ה-GFP-להגר רדיאלית החוצה אשכולות reaggregated neuroblast (איור 3 א). כימות הודעה היחסית שהועברו מרחק 24 שעות הטבעה (איור 3 ב) לא מראה שום הבדל בהגירה בין ה-GFP-להניח ive תאים ו, תאי ה-GFP-שלילית nonnucleofected (איור 3 ג), המציין כי nucleofection כשלעצמה לא לשבש הגירה. אין גם הבדל משמעותי בהיקף ההגירה בין neuroblasts nucleofected וneuroblasts ישירות נודדת מתוך explants RMS (מידע לא מוצג).

figure-results-1
איור 1. נתיחה של neuroblasts RMS. (א) ייצוג סכמטי של נתיחת neuroblast RMS. לתיאור מפורט עיינו בטקסט. (ב) תאי RMS החולדה מבודדים הם immunopositive למקבלי neuroblast הנודדים DCX וטובולין βlll. תאים בר, 20 מיקרומטר. (C) נודדים מexplants RMS העכבר לבטא neuroblast נודדת סמני DCX וPSA-NCAM. בר, 20 מיקרומטר.0989/50989fig1highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

figure-results-2
איור 2. nucleofection neuroblast עכבר. הניתק העכבר RMS neuroblasts הייתה nucleofected עם Pmax-GFP, reaggregated, משובצת במטריצה ​​תלת ממדים ואפשרו להגר ל6 שעות. Neuroblasts נודדות מתוך מקבץ תאי reaggregated (למעלה, בתמונות בניגוד שלב) מראות יעילות גבוהה transfection (תחתון, תמונות ערוץ GFP). לוחות העמודה הימני מראים תמונות בהגדלה גבוהות יותר המתאימות לריבועים מודגשים בפנלי העמודה השמאליות. ברים, 20 מיקרומטר. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

figure-results-3 ontent-width = src "6in" = "/ files/ftp_upload/50989/50989fig3.jpg" width = /> "500px"
איור 3. assay הגירת 3D. () Neuroblasts עכברוש הייתה nucleofected עם Pmax-GFP (GFP) או pCAG-IRES-EGFP 22 (EV), reaggregated, משובץ במטריצה ​​והשאיר להגר ל24 שעות. תאים אז היו קבועים immunostained עבור ה-GFP (ירוק) וטובולין βIII (אדום). בר, 50 מיקרומטר. (ב) מדידת מרחק הגירה באמצעות ImageJ. אשכול תא reaggregated מחולק 6 מגזרים שווים. המרחק בין הקצה של האשכול (קו מקווקו) והתא היגר הרחוק נמדד עבור כל מגזר. כימות (ג) למרחק היחסי היגרה ידי תאי nucleofected, תאי nonnucleofected (GFP חיובי) ובקרה (ה-GFP-שלילית) . לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

figure-results-4"איור 4" עבור: תוכן width = "6in" רוחב src = "/ files/ftp_upload/50989/50989fig4.jpg" = /> "500px"
איור 4. ניטור נדידת neuroblast לאחר nucleofection shRNA. () Neuroblasts עכברוש הייתה nucleofected עם וקטור שליטת shRNA (PCA-B-EGFPm5 משתיק 3, שמבטא גם EGFP 23) או את אותו וקטור המכיל, חלבון bundling-אקטין shRNA מיקוד fascin 24. תאים היו reaggregated מעל 48 שעות, משובץ במטריצה ​​והשאירו להגר ל24 שעות. מצרפים אז היו קבועים immunostained עבור ה-GFP (ירוק) וטובולין βIII (אדום). fascin האפקטיבי בר, 50 מיקרומטר. (B) דלדול ניתן לאתרם 50 שעות לאחר shRNA nucleofection על ידי ניתוח כתם מערבי. אקטין מוצג כאן כביקורת טעינה (ג) ניתוח כמותי של מרחק הגירה יחסי מראה כי דלדול fascin פוגע הגירת neuroblast באופן משמעותי. (ממוצע ± SEM; ** p <0.01, n = 3 ניסויים בלתי תלויים). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההגירה של neuroblasts לאורך RMS למיקום הסופי בOB היא צעד מהותי בנוירוגנזה לאחר לידה. עם זאת, המנגנונים המולקולריים השליטה תהליך מורכב זה הם רחוק מלהיות מובן במלואו.

הליך הניסוי המתואר כאן מאפשר הלימוד של הגירת neuroblast במבחנה. יש לנו להתאים פרוטוקול שפורסם בעבר לבידוד neuroblasts RMS מתחילת עכבר או חולדה 25 לאחר לידה. כדי להשיג תוצאות אופטימליות חשוב להשתלט על הצעד לנתיחה, שכן הוא חיוני כדי לשמור על מרווח הזמן בין הנתיחה וnucleofection למינימום. לאחר nucleofection, ניתן reaggregated neuroblasts, משובץ במטריצה ​​תלת ממדית והשאיר להגר על פני תקופה hr 24. לחלופין, למטרות אחרות מהגירה (למשל immunofluorescence או ניתוח כתם מערבי), תאים יכולים להיות מצופים מייד לאחר nucleofection על polyornithine/laminin-coverslips מצופה, שבו הם ישרדו עד 4-5 ימים. neuroblasts העכבר והחולדה להעביר בMatrigel במידה דומה, עם זאת תאי עכבר מופיעים יש נטייה חזקה יותר להעברה ברשתות מאשר תאי חולדה.

בהתאם למטרה של המחקר, ניתן nucleofected neuroblasts עם פלסמידים שונים קידוד חלבוני ניאון או חלבונים מסוג / מוטציה פראיות של עניין. לפלסמידים ביטוי חלבון אופטימליים עם אמרגן CAG (אמרגן β-אקטין עם משפר CMV ו poly-זנב גלובין β) 26 מומלצים ביותר. יתר על כן, ניתן nucleofected oligos siRNA או פלסמידים shRNA למציאת מטרות של עניין. דלדול חלבון יעיל ניתן דמיינו ידי immunofluorescence או על ידי כתם מערבי (בדרך כלל lysing אגרגטים מוטבעים מגור חולדה 1 עם 50 μl של חיץ תמוגה הסטנדרטי).

Nucleofection הוא שיטה פשוטה יחסית לtransfect neuroblasts הראשונית, מציע אלטרנטיבה קלה יותר ומהירה יותר לVItransfection RAL וקטור בתיווך, והוא יכול להשיג יעילות transfection (~ 70-80%) גבוהה. זה קריטי כדי לעבוד במהירות במהלך הליך nucleofection, מאז שעזב את neuroblasts בפתרון nucleofection במשך זמן ממושך באופן דרסטי מפחית את כדאיויות תא.

תשואת התא הממוצעת מנתיחת RMS היא נמוכה יחסית לעכברי P7 (~ 5 x 10 5 תאים / מוח) בהשוואה לחולדות P7 (~ 1 x 10 6 תאים / מוח) ולפחות 3 x 10 6 תאים לכל nucleofection נדרשים כדי להשיג transfection עם ~ 50% ביעילות. יתר על כן, neuroblasts העכברוש מופיעה להתנגד עדיף nucleofection לעומת neuroblasts עכבר. לכן, גורי חולדה לאחר הלידה מוקדמת (P6-P7) עשויים לייצג מקור neuroblast נוח, גם בהתחשב בכך שהארגון של RMS חולדה והעכבר להפליא סימי27 lar וכי היקף הגירת neuroblast חולדה ועכבר במבחנה הוא גם דומה. רצוי לא לשמור את אשכולות reaggregated של neuroblasts nucleofected בהשעיה לזמן רב יותר מאשר 48 שעות כדי למנוע תופעות חריגות על מורפולוגיה של תאים והגירה (התצפיות שלא פורסמו שלנו).

Assay 3D המתואר כאן יכול לשמש כדי לכמת הגירת neuroblast בנקודת זמן קבועה לאחר ההטבעה במטריצה ​​(למשל. 24hr). אגרגטים בגדלים שונים ניתן להשתמש בניתוח, שכן אין קשר מובהק בין הגודל של אגרגטים ומרחק הגירה (תצפיות שלא פורסמו שלנו). כדי להמחיש עוד יותר לחקור את הדינמיקה של הגירת neuroblast, ניתן להשתמש בהדמיה הזמן לשגות. מומלץ לבצע את ניתוח ההגירה בתוך מרווח שעות 24 לאחר ההטבעה, שכן המהירות של neuroblasts מופיעה כדי להקטין באופן דרסטי בנקודות זמן ארוכות יותר (תצפיות שלא פורסמו שלנו).

ישנן מספר מגבלות לפרוטוקול זה. ראשית, nucleofection יכול עד כה לשמש לneuroblasts המכרסם לאחר לידה המוקדמת, ואילו זיהום עם וקטורים ויראליים נשאר השיטה transfection היעילה ביותר לneuroblasts המבוגר 28. שנית, במבחנה assay ההגירה לא לשחזר באופן מלא את הארכיטקטורה המורכבת של RMS נצפה in vivo. ואכן, למרות שneuroblasts לשמור על היכולת להעביר באופן דומה לin vivo עמיתיהם, בהגדרת הניסוי שתוארה כאן חסר להם אינטראקציות עם רכיבי RMS אחרים כגון האסטרוציטים וכלי דם, שגם תורמים לתנועתיות שלהם לווסת 9,29, 30. בעיה זו עלולה להיות מופנה בעתיד על ידי אופטימיזציה של מערכות מודל coculture תלת ממדי.

לסיכום, שילוב של nucleofection עם assay הגירת 3D מייצג כלי רב ערך כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים שבבסיסהגירת neuroblast. הליך ניסיוני זה מספק שיטה ראשונית, מהירה ופשוטה יחסית כדי להעריך את התפקיד של רגולטורים מועמד של הגירת neuroblast, שבו ניתן תוקף נוסף על ידי גישות אחרות כמו in vivo electroporation לאחר הלידה והזמן לשגות הדמיה של תרבויות פרוסה מוח 28,31,32 .

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי אמון פרויקט גרנט Wellcome הוענק לפ"ד וGL (089236/Z/09/Z). SG נתמכה על ידי ביוטכנולוגיה ומלגת לימודים לתואר שלישי מחקר מדעי הביולוגיה מועצה. אנו מודים למתיו Vermeren על מתנת סוג של וקטור shRNA וג'ניפר Shieh לייעוץ רב ערך על nucleofection neuroblast.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
האנק' s תמיסת מלח מאוזנת (HBSS)Invitrogen Life Technologies14175129
HEPESSigma-AldrichH3375-25G
פניצילין-סטרפטומיציןInvitrogen Life Technologies15140-122
2.5% טריפסין-EDTA (10x)Gibco15090-046חנות 200 ומיקרו; l aliquots ב-20 & deg; C
DNAse I בקבוקון (D2)וורת'ינגטוןLK003170≥ 1,000 יחידות לבקבוקון; חנות 50 ומיקרו; l aliquots ב-20 & deg; C
Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM)Gibco11960-044
סרום עגל עוברי (FCS)HycloneSH3007902
Neurobasal mediumGibco21103-049
תוסף B27Invitrogen Life Technologies
(200 מ"מ)Invitrogen Life Technologies25030-081
D-(+)-תמיסת גלוקוז (45%)Sigma-AldrichG8769
מטריצת ממברנת הבסיס של מטריג'ל, גורם גדילה מופחת (GFR), ללא פנול אדום, 10 מ"ל, ללא LDEVBD Biosciences356231 להכין 120 ומיקרו; l aliquots ב-4 מעלות; C, ואז לאחסן ב-80 מעלות; C
PFAסיגמא-אולדריץ'441242
סוכרוזBDH102745C
סרום עיזיםסיגמא-אולדריץ'69023
טריטון X-100VWR אינטרנשיונל בע"מ306324N
BSAפישר כימיBPE9701-100
דאקו פלואורסצנטי הרכבה בינוניתDakoS3023
ערכת נוקלאופקציה של נוירון עכברושLonzaVPG-1003
ערכת נוקלאופקציה של נוירון עכברLonzaVPG-1001
סכין מיקרוכירורגיתAngiotech7516
McIlwain קוצץ רקמותהנדסת מעבדת מיקל
Nucleofector IILonza
17504044-L-גלוטמין חברת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ming, G. L., Song, H. J. Adult Neurogenesis in the Mammalian Brain: Significant Answers and Significant Questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
  2. Alonso, M., et al. Activation of adult-born neurons facilitates learning and and memory. Nat. Neurosci. 15, 897-U127 (2012).
  3. Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction? Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
  4. Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
  5. Jin, K. L., et al. Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13198-13202 (2006).
  6. Kim, Y., Szele, F. G. Activation of subventricular zone stem cells after neuronal injury. Cell Tissue Res. 331, 337-345 (2008).
  7. Massouh, M., Saghatelyan, A. De-routing neuronal precursors in the adult brain to sites of injury: Role of the vasculature. Neuropharmacology. 58, 877-883 (2010).
  8. Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
  9. Lois, C., Alvarez-Buylla, A. Long-Distance Neuronal Migration in the Adult Mammalian Brain. Science. 264, 1145-1148 (1994).
  10. Lois, C., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Chain migration of neuronal precursors. Science. 271, 978-981 (1996).
  11. Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal Neuronal Migration Changes the Fate of Developing Neurons in the Postnatal Olfactory Bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
  12. Battista, D., Rutishauser, U. Removal of Polysialic Acid Triggers Dispersion of Subventricularly Derived Neuroblasts into Surrounding CNS Tissues. J .Neurosci. 30, 3995-4003 (2010).
  13. Conover, J. C., et al. Disruption of Eph/ephrin signaling affects migration and proliferation in the adult subventricular zone. Nat. Neurosci. 3, 1091-1097 (2000).
  14. Mobley, A. K., McCarty, J. H. beta 8 Integrin is Essential for Neuroblast Migration in the Rostral Migratory Stream. Glia. 59, 1579-1587 (2011).
  15. Nguyen-Ba-Charvet, K. T., et al. Multiple roles for slits in the control of cell migration in the rostral migratory stream. J. Neurosci. 24, 1497-1506 (2004).
  16. Garzotto, D., Giacobini, P., Crepaldi, T., Fasolo, A., De Marchis, S. Hepatocyte growth factor regulates migration of olfactory interneuron precursors in the rostral migratory stream through Met-Grb2 coupling. J. Neurosci. 28, 5901-5909 (2008).
  17. Platel, J. C., Stamboulian, S., Nguyen, I., Bordey, A. Neurotransmitter signaling in postnatal neurogenesis: The first leg. Brain Res. Rev. 63, 60-71 (2010).
  18. Dityateva, G., et al. Rapid and efficient electroporation-based gene transfer into primary dissociated neurons. J. Neurosci. Meth. 130, 65-73 (2003).
  19. Shieh, J. C., Schaar, B. T., Srinivasan, K., Brodsky, F. M., McConnell, S. K. Endocytosis Regulates Cell Soma Translocation and the Distribution of Adhesion Proteins in Migrating Neurons. PloS One. 6, (2011).
  20. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons. J. Vis. Exp. , e2373(2011).
  21. Gartner, A., Collin, L., Lalli, G. Nucleofection of primary neurons. Method Enzymol. 406 (06), 374-388 (2006).
  22. Causeret, F., et al. The p21-Activated Kinase Is Required for Neuronal Migration in the Cerebral Cortex. Cereb. Cortex. 19, 861-875 (2009).
  23. Bron, R., Eickholt, B. J., Vermeren, M., Fragale, N., Cohen, J. Functional knockdown of neuropilin-1 in the developing chick nervous system by siRNA hairpins phenocopies genetic ablation in the mouse. Dev. Dynam. 230, 299-308 (2004).
  24. Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).
  25. Ward, M., Rao, Y. Investigations of neuronal migration in the central nervous system. Methods Mol. Biol. 294, 137-156 (2005).
  26. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient Selection for High-Expression Transfectants with a Novel Eukaryotic Vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  27. Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp. Neurol. 487, 407-427 (2005).
  28. Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain. J. Vis. Exp. , e4061(2012).
  29. Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).
  30. Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood Vessels Form a Migratory Scaffold in the Rostral Migratory Stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
  31. Sonego, M., Ya, Z., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain. J. Vis. Exp. , in press (2013).
  32. Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A., lique, Neonatal Subventricular Zone Electroporation. J. Vis. Exp. , e50197(2013).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

3D In VitroTime lapseDNAshRNA siRNAWestern Blot

מאמרים קשורים