מאמר שיטה

שיטות איסוף חלב לעכברים וריבס 'Muntjac צביים

20.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51007

⸱

19 ביולי 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Prion Research Center, Colorado State University

במאמר זה

סיכום

איסוף חלב ממודלים של בעלי חיים מקל על כיווני מחקר שונים: הבנת חסינות פסיבית, זיהוי פתוגנים האחראים להעברה אנכית, ובאמצעות שימוש בעכברים טרנסגניים, אפילו ייצור מסחרי של חלבונים המצויים בחלב אם. כאן אנו מדגימים שיטה פשוטה לאיסוף חלב בעכברים ובאייל המונטג'אק של ריבס.

תקציר

מודלים של בעלי חיים משמשים בדרך כלל במעבדות מחקר כדי להשיג את מה שבדרך כלל נחשב לא מעשי במארח הטבעי של פתוגן. איסוף חלב מבעלי חיים מאפשר למדענים את ההזדמנות לחקור היבטים רבים של רבייה, כולל העברה אנכית, חסינות פסיבית, ביולוגיה של בלוטות החלב והנקה. השגת כמויות נאותות של חלב למחקרים אלה היא משימה מאתגרת, במיוחד ממודלים של בעלי חיים קטנים. כאן אנו מדגימים שיטה זולה וקלה לאיסוף חלב בעכברים ובאייל מונטג'אק של ריבס שאינה דורשת ציוד מיוחד או הכשרה נרחבת. שיטה מסוימת זו דורשת שני חוקרים: אחד לשאוב את החלב ולייצב את החיה, ואחד לאסוף את החלב במיכל מתאים ממודל מונטג'אק או עכבר. דגם העכבר דורש גם שימוש בפיפטמן P-200 ובקצות פיפטה מתאימים. אמנם שיטה זו זולה וקלה יחסית לביצוע, אך יש לייעץ לחוקרים כי הרדמת החיה נדרשת לאיסוף חלב אופטימלי.

מבוא

מודלים של בעלי החיים לספק תובנות לגבי הפתולוגיה מחלה שלא ניתן להשיג על ידי ניתוח במבחנה. כדי לספק את התוצאות יעילות ביותר, זה חשוב להשתמש במודל של בעלי חיים הקשור באופן הדוק למחלה והמינים של עניין. לדוגמא, muntjac 'ריבס (reevesi Muntiacus), צבאים קטנים אסיה 1,2, ועכברים מהונדסים המבטאים את חלבון cervid הפריון (CerTgPrP) 3 הם מודלים של בעלי חיים שימושיים למיני cervid. שני המינים הם polyestrous, המאפשרים גידול בכל ימות שנה, ולכן מקור עקבי לרקמות הקשורים להריון ונוזלים ללמוד מנגנונים ספציפיים בביולוגיה cervid. יש מחקרים על חלב מגוון רחב של יישומים, כי הם יותר פשוט (וזולים) השיגו במודלים של בעלי חיים מאשר בבני אדם. חוקרים יכולים לחקור חלב וקולוסטרום כמקור פוטנציאלי של 1 העברת מחלות מידבקת), 2) נוגדנים שהועברו מאם לצאצאים בdevelopment חסינות פסיבית 4 ו -3) לקטופרין, חלבון המצוי בחלב אם אנושי המעורב בחסינות פסיבית שחוקרים כעת מנסים לייצר באופן מסחרי 5.

איסוף כמות משמעותית של חלב מבעלי חיים קטנים יכול להוכיח להיות משימה קשה. רוג'רס הציע גישה לאיסוף חלב מחולדות 6, אשר לאחר מכן נעשה שימוש בעכברים. DePeters וHovey הציעו שתי שיטות לאיסוף חלב, אחד באמצעות ואקום שנוצר באופן ידני המיוצר על ידי הנורה פיפטה גומי המחובר לפיפטה פסטר, ושנייה המחייב את הבנייה של יחידת חליבה, אשר מחוברת אז למקור ואקום (כגון כרז) למסוק חלב עכבר 7. כאן אנו מציעים שיטה פשוטה, עלות נמוכה לאיסוף חלב משני עכברים והצבאים muntjac ריבס ', אשר דורש ציוד מעבדה רק זמין וכישורים טכניים בסיסיים. השיטה שלנו מניבה כמויות מספיקות של חלב לשונהיישומים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. עכבר חליבת פרוטוקול

השיטות שתוארו בפרוטוקול זה אושרו על ידי IACUC.

1. הפרדה של הסכר מצאצאים

  1. בחר את הסכר לחליבה. בחר סכר עם המלטה של ​​4 או יותר גורים שהוא 8-12 ימים שלאחר המלטה כדי לספק חלב מקסימאלי אוסף-למרות שהאוסף הוא אפשרי בכל נקודה שלאחר המלטה עד זמן 21 ימים.
  2. הפרד את הסכר מההמלטה שלה לפחות 2 שעות לפני החליבה.
    הערה: יש רצון אחד לחלוב סכר יותר מפעם אחת בתקופת זמן נתונה, זה מקובל על בית הסכרים המופרדים באותו הכלוב עם אוכל הולם ואספקת מים.

2. מנהל של אוקסיטוצין, הרדמה ועיני חומר סיכה

  1. לנהל 2 IU / קילוגרם של אוקסיטוצין intraperitoneally (IP). אוקסיטוצין הוא הורמון שפועל על בלוטות החלב של נקבות מניקות כדי לעורר את שחרורו של חלב. ניתן לרכוש אוקסיטוצין frאום וטרינר.
  2. לנהל תערובת הרדמה המכילה 80-100 מ"ג / קילוגרם קטמין בשילוב עם 5-10 מ"ג / IP xylazine קילוגרם. לדוגמא, תערובת הרדמה מיליליטר מניית 10 יכולה להיות מוכנה מראש לעכברים במשקל של כ 30 גרמו ותכלול 0.1 מיליליטר xylazine, 8.9 מיליליטר H 2 O, ו1.0 מיליליטר קטמין. 0.25 הרדמה כוללת מיליליטר תהיה להרדים את העכבר בגודל זה לכ 20-30 דקות, אשר אמור לספק מספיק זמן לאיסוף חלב.
    הערות: כדי לקבוע כי בעל החיים כבר הרדימו בהצלחה, מניחים בעדינות אותה על בטנה על משטח מוצק; היא לא צריכה להיות להזיז את רגליה או מנסה לקום על רגליה אם היא בהרדמה מלאה. במקרה של עכבר לא להיות מורדם באופן מלא עם המינון המקורי, החוקר רשאי לנהל אחר ¼ או ½ מהמינון המקורי של תערובת ההרדמה בהתאם לגודל של העכבר ו / או ברמה של הרגעה שהעכבר כבר השיג . עם זאת, זה אני יכולncrease הסיכוי של תגובה שלילית להרדמה, וגם עלול לגרום לעכבר להיות מורדם ו / או מורדם לתקופה ארוכה יותר של זמן עמוקים יותר.
    הערה: אם חליבת סכר יותר מאחד, יש צורך לזעזע אוקסיטוצין וזריקות הרדמה בשל זמן מחצית החיים הקצר של אוקסיטוצין ופעמים הרגעה לקטמין ו xylazine.
  3. למרוח כמות קטנה של חומר סיכה העין לפינה של כל עין והתפשט כדי למנוע את עיניו של העכבר מהתייבשות בזמן שתחת הרדמה.

3. אוסף חלב

אוסף חלב מתבצע בקלות עם שני חוקרים: חוקר אחד להחזיק את העכבר הרדים תוך הבעת חלב (המכונה R1), וחוקר אחד כדי לאסוף את חלב (R2) באופן ידני. שיטה זו יכולה להתבצע גם עם אדם אחד, אם העכבר הוא מאובטח על משטח שטוח כדי למנוע נזק.

  1. R2 צריך להיות מצויד בכריות הכנת אלכוהול סטרילי, פיפס P-200etman, קצה פיפטה נקי לכל עכבר, ומכל להחזיק חלב, כגון צינור Eppendorf 1.5 מיליליטר או cryovial 1.2 מיליליטר (ראה טבלה של חומרים).
  2. כמו אוקסיטוצין מתחיל להיכנס לתוקף, האכזבה חלב תהיה גלויה באזור החלב של העכבר (ראה איור 1 א). R1: לגולל כרית הכנת אלכוהול סטרילי ולנגב בעדינות את אזור החלב של העכבר כדי לנקות את האזור לפני החליבה. ידני לשאוב חלב מהפטמה באמצעות האגודל והאצבע לעסות בעדינות ולסחוט את רקמת השד בתנועה כלפי מעלה עד שחרוז גלוי של חלב מתחיל להיווצר בבסיס הפטמה.
  3. לחץ על בוכנת pipetman P-200 לתחנה הראשונה שלה לשחרר אוויר מקצה פיפטה ולהתכונן לאוסף חלב.
  4. מקם את קצה פיפטה בחלק העליון של טיפת חלב, ומשוך בעדינות את החלב לתוך קצה פיפטה ידי שחרור לאט את לחץ על הבוכנה. יש להיזהר שלא לשים את הקצה קרוב מדי לפטמה או העור (ראהאיור 1). אין זה הכרחי כדי לשחרר לחלוטין את הבוכנה כמו זה יהיה למשוך את חלב כל הדרך לחלק העליון של קצה פיפטה ויקשה לגרש את חלב לעתים קרובות צמיג לתוך המכל מחזיק.
  5. לגרש את חלב לתוך המכל על ידי שימוש באגודל כדי ללחוץ על בוכנת עבר התחנה הראשונה (ראה תרשים 1C). כדי להקל על גירושם של נפחים קטנים, לחץ על קצה פיפטה נגד הצד של הצינור, כך שנוזל לא הולך לאיבוד.
  6. תמשיך להביע באופן ידני חלב מפטמה, נע בכל כיוון השעון או נגד כיוון השעון כדי לא לדלג על כל פטמות. זה גם מקובל ושימושי לחזור וללשאוב חלב ללא הרף מאותו העטין זה צריך לייצר יותר חלב מאשר אחר.

4. היפוך הרדמה בסכר

  1. ברוב המקרים, זה נפוץ לסכר להתחיל להתחיל להתעורר במהלך תהליך החליבה. אם זה לא המקרה, הנח את הסכר בCAGדואר בעקיפין מתחת למקור חום, כגון שמיכה במחזור מחוממת, עד שהיא מתחילה להתעורר.
    הערה: כסכר מתחיל להתעורר, לשמור על התבוננות קרובה של פעילותה עד שהיא תוכל ללכת על הכלוב שלה בכוחות עצמה.
  2. ברגע שהסכר הוא נע על הכלוב בלי מאבק, הנח אותה בחזרה לכלוב המקורי שלה עם גוריה. השפעות שליליות לא כבר ציינו ביחס ליכולתם של הגורים כדי להאכיל לאחר איסוף חלב.

2. Muntjac חליבת פרוטוקול

השיטות שתוארו בפרוטוקול זה אושרו על ידי IACUC.

1. הפרדה של פלוני מצאצאים

  1. בחר את האיילה לחליבה. צבי muntjac ריבס 'בדרך כלל ללדת אחד חום בהיר 2. לחלוב את האיילה ביום שלאחר לידה כדי לאפשר את ההזדמנות להתחנף כדי לקבל גישה לחומרים מזינים חיוניים בקולוסטרום 8.
    הערה: חום בהיר בדרך כלל מסתיר ולא מופיע שוב במהלך procedure; הפרדה של זוג אם הצאצאים אינה הכרחית.

2. מנהל של אוקסיטוצין, הרדמה ועיני חומר סיכה

  1. לנהל 10 IU / קילוגרם של אוקסיטוצין לשריר (IM). אוקסיטוצין הוא הורמון שפועל על בלוטות החלב של נקבות מניקות כדי לעורר את האכזבה של חלב. אוקסיטוצין ניתן לרכוש מוטרינר.
  2. לנהל את ההרדמה BAM 11 IM מכיל 0.45 מ"ג / קילוגרם butorphanol, azaperone מ"ג / קילוגרם 0.25, medetomadine 0.07 מ"ג / קילוגרם. מנה אחת של תערובת ההרדמה BAM תהיה להרדים muntjac לכ 20-30 דקות, המספקת מספיק זמן לאיסוף חלב מלא. אפשרות נוספת להרדמה היא midazolam ב1-2 מ"ג / קילוגרם, אשר להרדים muntjac כ 10-15 דקות. אמנם זה מספק מספיק זמן לאיסוף חלב, הרדמה זה עובר מטבוליזם במהירות רבה יותר מאשר BAM ובעלי החיים עשויים לנסות לברוח בתום תקופת הזמן הקצר יותר.
    הערה: תגובה מינימאלית לכאב, רפלקסים קטין עם הנגיעה האוזניים, ואחריו את היכולת של R1 להחזיק MJ ללא מאבק מצביעים על כך שבעלי החיים כבר הרדימו בהצלחה.
    הערה: במקרה של muntjac לא להיות מורדם באופן מלא עם המינון המקורי, החוקר רשאי לנהל אחר ¼ או ½ מהמינון המקורי של תערובת ההרדמה בהתאם לגודלו של בעל החיים ו / או ברמה של הרגעה שכבר היה הושג. עם זאת, זה יכול להגדיל את הסיכוי לתגובה שלילית להרדמה, וגם עלול לגרום לmuntjac להיות עמוק יותר בהרדמה ו / או מורדם לתקופה ארוכה יותר של זמן.
  3. למרוח כמות קטנה של חומר סיכה לפינה של כל עין והתפשטות כדי למנוע את עיניו של muntjac מהתייבשות בזמן שתחת הרדמה.

3. אוסף חלב

אוסף חלב מתבצע בקלות עם שני חוקרים; חוקר אחד להחזיק muntjac הרדים בהברכיים תוך הבעת חלב (המכונה R1), וחוקר שני כדי לשמור על ראשו של muntjac בתנוחה נוחה ובטוחה ולאסוף את חלב (R2) באופן ידני.

  1. בהתאם להרדמה המשמשת, חליבה צריכה להתבצע גם 1) בעטים שלהם על מנת לספק מקום בטוח עבורם הם צריכים להתעורר במהלך ההליך (או מושרה midazolam) 2) בחדר המתנה ללא מצעים כדי לשמור על ניקיון (BAM- מושרה).
  2. R1 ו R2 צריך להיות מצויד בגזה ספוגת אתנול וכמה מיליליטר 15 צינורות פוליפרופילן חרוטי להחזיק את חלב.
  3. כמו אוקסיטוצין מתחיל להיכנס לתוקף, האכזבה חלב תהיה גלויה באזור החלב של muntjac. R1: לטהר את הידיים בכפפות ואצבעות, כמו גם את כל העטין וכל פטמה בודדת של בעלי החיים עם הגזה ספוגת אתנול. R2: החזק את ראשו של muntjac בעמדה בטוחה ונוחה כדי לאפשר להקל על נשימה ולעזור למנוע regurgitation כרס הפנימי. החזק את CL צינור האיסוף OSE לפטמה שחלב מבלי לגעת בו על מנת למנוע זיהום פוטנציאלי.
  4. לשאוב חלב מפטמה אחת על ידי שימוש באגודל ובאצבע כדי לסחוט בעדינות את רקמת השד בתנועה כלפי מעלה עד שהפטמה היא צבה עם חלב, ובעדינות לגלגל את חלב מהפטמה ולתוך הצינור שR2 מחזיק (ראה איור 2 ).
  5. הערה: חלב יוצא בזרם, ולכן חשוב לR2 כדי לקבל את צינור האיסוף מוקם כך שלא מעט חלב יהיה מבוזבז.
  6. העטין של muntjac מחולק לרבעים. R1: המשך להביע את חלב מכל רבע עד שהחלב כבר לא זורם בקלות. אם חלב לא יכול לבוא לידי ביטוי מפטמה אחת, להביע מכל הפטמות האחרות לפני ההחזרה לראשונה. זה גם מקובל ושימושי לחזור וללשאוב חלב ללא הרף מאותו העטין זה צריך לייצר יותר חלב מאשר אחר.

4. היפוך הרדמה בDoe

t "> זה נפוץ איילה מושרה midazolam להתחיל להתעורר במהלך תהליך החליבה. ברוב המקרים, האיילה תנסה לברוח לפני שכל חלב כבר הביע. איפוק קטן משמש במאמץ להגביר את חלב תשואה, אך הבטיחות והנוחות של שני החוקרים והאיילה הן חשובים לא פחות.

  1. לנהל atipamezole ב2.5 מ"ג / מ"ג medetomadine תת עורי להיפוך מהיר של BAM הרדימה איילה.
    שים לב: עם שני הסוגים של הרדמה, יש צורך לשמור על התבוננות קרובה של האיילה עד שהיא מסוגלת ללכת בכוחות עצמה בלי למעוד או ליפול, והוא מסוגל לאכול ולשתות ללא חשש של שאיפה או חנק. השפעות שליליות לא כבר ציינו ביחס ליכולתו של העופר להניק לאחר איסוף חלב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עכבר

מהניסויים שלנו, יש לנו קבענו כי ניתן לגבות כ 100-400 μl חלב מעכבר מעבדה אחד, תלוי במספר משתנה. משתנה אלו כוללים 1) כמות הזמן להפריש עבור אוסף, 2) במינון של אוקסיטוצין מנוהל, 3) כמה גורי הסכר הוא כיום סיעוד ו4) הסכום של הודעה המלטת זמן. המחקרים שלנו הראו כי את התשואה הגבוהה ביותר מתקבלת כאשר הסכרים מופרדים מצאצאיהם לפחות 2 שעות, ולפחות 45 דקות לשעה היא להפריש לכל עכבר לחליבה. כרכי חלב מרביים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עכבר

ישנם מספר גורמים לקחת בחשבון בעת ​​איסוף חלב מעכבר, כולל 1) כמות הזמן להפריש עבור אוסף, 2) במינון של אוקסיטוצין מנוהל, 3) כמה גורי הסכר הוא כיום סיעוד ו4) הסכום זמן שחלף מאז המלטה בזמן איסוף המידע. שימוש במחקרים קודמים כקווים מנחים, יצאנו כדי לייעל את התנאים לתנובת החלב.

מחקר קודם שנעשה באופן ישיר יש קורלציה תנובת החלב עם ג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

ניסויים אלה מומנו על ידי #RAI093634A המענקים של ה-NIH. אנו מביעים הכרת תודה עצומה לג'ני פאוורס, DVM, PhD, על עזרתה בחליבת מונטג'אק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומרים—
קטמין עכבר (KetaVed 100 מ"ג/מ"ל) (מינון: 80-100 מ"ג/ק"ג)MWI/Vedco011075
קסילזין (100 מ"ג/מ"ל) (מינון: 5-10 מ"ג/ק"ג)MWI/VedcoNADA 139236
סיכה לעינייםMWI/Apexa701013
אוקסיטוצין (2 יחב"ל/ק"ג)VetOne501013
חומרים— Muntjac
Midazolam (1-2 מ"ג/ק"ג)Amerisource Bergen Drug Corp924326אופציונלי: חוקר יכול להשתמש במידזולם בפני עצמו או בשילוב BAM כחומר הרדמה
בוטואורפנול טרטרט (טורבוגסי) (0.45 מ"ג/ק"ג)פורט דודג' בריאות בעלי חייםNADA 135-780
אזאפרון טרטרט (0.25 מ"ג/ק"ג)ZooPharm
Medetomadine HCl (0.07 מ"ג/ק"ג)ZooPharm
אנטיפמזול הידרוכלוריד (אנטיסדאן) (מינון: 0.25 מ"ג/ק"ג)Orion CorporationNADA 141-033
אוקסיטוצין (10 יחב"ל/ק"ג)VetOne501013
ציוד— עכבר
P-200 פיפטמןגילסוןF123601
200 μ l קצות פיפטהLight LabsB-2004-SH
מזרקים 1 מ"לMWI005427
מחטי 27 גרםMWI002031
ציוד— Muntjac
15 מ"ל צינורות חרוטייםVWR21008-918
22 גרם מחטיםMWI873
3 מ"ל מזרקי נעילת לוארMWI001377
חומר

מקורות

  1. Dueling, S. Muntiacus reevesi. Animal Diversity Web. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Muntiacus_reevesi (2004).
  2. Pei, K., Taber, R., O'Gara, B., Wang, Y. Breeding cycle of the Formosan Reeves muntjac (Muntiacus reevesi micrurus) in northern Taiwan, Republic of China. Mammalia. 59 (2), 223-228 (1995).
  3. Browning, S. R. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J. Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
  4. Van de perre, P. Transfer of antibody via mother's milk. Vaccine. 21 (24), 3374-3376 (2003).
  5. Maden, C. Genetically modified mice produce human milk protein. BioNews. , (2009).
  6. Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
  7. Depeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
  8. Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: effects of litter size and lactation. 84 (1), 127-133 (1986).
  9. Hedrich, H. J., Bullock, G. R. The laboratory mouse. , 735-736 (2004).
  10. Nishimori, K., Young, L. J., Guo, Q., Wang, Z., Insel, T. R., Matzuk, M. M. Oxytocin is required for nursing but is not essential for parturition or reproductive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (21), 11699-11704 (1996).
  11. Miller, B. F., Osborn, D. A., Lance, W. R., Howze, M. M., Warren, R. J., Miller, K. V. Butorphanol-azaperone-medetomidine for immobilization of captive white-tailed deer. 45 (2), 457-467 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

P 200

מאמרים קשורים