שיטה משופרת להכנת סוג I קולגן מעור

סיכום

נהלים מסורתיים לבידוד של קולגן סוג מסיס 1 (col1) דורשים על 10 ימים מהתחלה ועד הסוף בגלל incubations חיץ הארוך ומייגע resuspensions של סיבים. כאן, אנו מתארים אמצעים כדי לטהר col1 מביופסיות עורי קטנים בפחות מ 3 שעות.

תקציר

סוג מסיס קולגן 1 (col1) נעשה שימוש נרחב כמצע דבק לתרביות תאים ופיגום סלולארי ליישומי רגנרטיבית. מבחינה קלינית, חלבון זה נמצא בשימוש נרחב עבור ניתוחים קוסמטיים, זריקות עורי, השתלת עצם, וניתוח שחזור. מקורות col1 לנהלים אלה הם בדרך כלל לא אנושיים, דבר המגדיל את הפוטנציאל לדלקת ודחייה, כמו גם העברת מחלות xenobiotic. לאור זאת, בשיטה יעילה ומהיר כדי לטהר col1 מכמויות מוגבלות של רקמות autologously נגזרות תעקוף רבות של בעיות אלה, עם זאת, פרוטוקולי בידוד סטנדרטיים הם ארוכים ולעתים קרובות דורשים כמויות גדולות של collagenous רקמות. הנה, אנחנו מדגימים שיטת חילוץ col1 יעילה המפחיתה את הזמן הדרוש לבודד ולטהר חלבון זה בערך מ 10 ימים פחות מ 3 שעות. אנחנו בחרנו בדרמיס כמקור לרקמות שלנו בגלל זמינותו בהרבה ניתוחים. Tהשיטה שלו משתמשת במאגרי חילוץ מסורתיים בשילוב עם תסיסה חזקה וסינון צנטריפוגלי להשיג מאוד טהור col1, מסיס מכמויות קטנות של גלד. בקצרה, ביופסיות עורי נשטפות ביסודיות ב DH קר כקרח ₂ O לאחר הסרת שומן, רקמת חיבור, ושיער. דגימות העור הופשטו מחלבונים והסוכרים noncollagenous באמצעות נתרן אצטט M 0.5 וhomogenizer ספסל העליון במהירות גבוהה. קולגן ממוצקי שיורי מופק לאחר מכן עם חיץ ציטרט הנתרן 0.075 M באמצעות homogenizer. תמציות אלה הם מטוהרים באמצעות 100,000 מסננים MW חתוכים הצנטריפוגלי שיניבו הכנות col1 באיכות דומה או עדיפה על מוצרים מסחריים או לאלה שהושגו באמצעות נהלים מסורתיים. אנו צופים בשיטה זו תאפשר הניצול של col1 autologously נגזר עבור מספר רב של מחקר ויישומים קליניים.

מבוא

במשך עשרות שנים, חוקרים וספקים מסחריים יש לבודד col1 solubilized ממגוון של מקורות, כולל רקמת עור וגידים באמצעות גרסה כלשהי של פרוטוקול פשוט הפקת חומצה ואחרי נטרול, שתוצאתה resuspension של מטריצה ​​של סיבי col1 מאורגנים שניתן להשתמש בי עבור מספר רב של יישומים ביו ^1-4. אמנם יש דוגמאות רבות של יישומים קליניים לcol1, כמה מהם להעסיק col1 autologously נגזר בגלל הכנה של חלבון זה דורשת עקירות ארוכות לוקחת ימים או שבועות כדי לבצע ^5-7. כתוצאה מכך, חוקרי מחקר ורופאים בדרך כלל להשתמש בתכשירים יקרים, מסחריים של col1 שהוכנו באמצעות רקמות אנושיות כגון חולדה, שור, או גלד חזירי או באמצעות עור הוסר מן הגופות או בעקבות מילת גברים. עבור יישומי משובי, רבים של השתנות אלה תערוכת מוצרים ביחס ליכולת שלהם לצורה מוצקהמטריצות או מבני רקמות מסוגלים לתמוך מצורף תא וצמיחה. כתוצאה מכך, יש צורך מובהק לשיטה סטנדרטית חדשה שנועדה לחלץ במהירות col1 ממקורות רקמות עצמיים נגישים ושפע.

שיטה כזו תחסוך זמן וכסף במסגרת המחקר שבו col1 אפשר להפיק ממודל החיה של עניין ומשמש לבדיקה קליני של רקמות מהונדסות התאספו על פיגומים מבוססי קולגן. במקביל, יש את האפשרות של שימוש במהירות col1 מבודד, autologously נגזר במרפאת יגדיל את הבטיחות הכוללת של חולים שאמורים היה לקבל אלוגנאית או תכשירי xenogeneic. לחולים שקבלו הכנת autogeneic, שיטה יעילה זה תהיה לצמצם במידה ניכרת את המרווח בין אוסף ביופסיה ויישום קולגן. מסיבות אלה, בקשנו לשפר את שיטת בידוד וטיהור col1 הוקמה ארוך באמצעות AG במהירות גבוההitation וצנטריפוגה בגודל הדרה. שיטה זו היא פשוטה לביצוע באמצעות מאגרים סטנדרטיים וציוד שנמצאו במעבדות רבות. על ידי העסקת תסיסה במהירות גבוהה, הפרוטוקול שלנו מקטין את הזמן הדרוש כדי לבודד מסיס col1, עורי מכ 10 ימים פחות מ 3 שעות ^8. חשוב מכך, בשיטה זו ניתן לבצע בקלות בסביבה הקלינית על מנת להכין col1 autologously נגזר לשימוש בחולים בקבוצה אחת של נהלים.

פרוטוקול

להלן נדגים את בידודה של col1 מעור כבש. כפי שנכתב, פרוטוקול זה יכול לשמש גם לבודד בהצלחה col1 מארנב ועור אנושי.

1. היכונו לדוגמא Dermal

1. לאזן את כל חומרים כימיים כדי 4 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
2. יש לשטוף את עורי מדגם (25-50 גר ') ב DH קר כקרח ₂ O והסר את כל צמר, פרווה, או שיער עם קרם מקריח.
3. השתמש בסכין גילוח חד קצה לגרד נקי הדגימה של רקמת שומן וחיבור.
4. יש לשטוף את המדגם בקר כקרח DH ₂ O.
5. פורסים את דגימת העור ל1 סנטימטר x חתיכות 1 סנטימטר בסכין גילוח חד קצה.

2. הסר Noncollagenous solubilized חומר

1. לשקול את 5 גרם של מדגם בצינור חרוטי 50 מיליליטר ולהוסיף 30 מיליליטר של 0.5 נתרן אצטט M קר כקרח.
2. מערבבים צינורות 1 דקות ב6 ההגדרה מ '/ השנייה באמצעות מתאם 50 צינור מיליליטר בhomogenizer ספסל העליון.
3. בטל supernatant וחזור על פעולה עבור סכום כולל של 7 מחזורים לשטוף נתרן אצטט.
4. יש לשטוף את המדגם ב DH קר כקרח ₂ O ולערבב פעם אחת כדי להסיר נתרן אצטט שיורית.
5. השתמש במרית כדי לדחוס את המדגם על הצד של הצינור כדי להסיר נוזל עודף ולאחר מכן להעביר לצינור חרוטי 50 מיליליטר טרי.

3. הקלד אני קולגן הפקה

1. לשטוף את המדגם פעמיים ב 2 מיליליטר / גרם 0.075 M חיץ ציטרט הנתרן 1 דקות ב6 מ '/ השני בhomogenizer ספסל העליון דחיסת המדגם ושלכת supernatant לאחר כל שטיפה.
2. הוספת aliquot 2 מיליליטר / גרם טרי של 0.075 חיץ ציטרט M נתרן לדוגמה.
3. בצע 6 דקות 1 רציפה, 6 מחזורי תמהיל homogenizer ספסל העליון מ '/ שנייה של תסיסה מבלי להסיר את החיץ בין כל מחזור.
4. מעביר את supernatant העבה, ברור לצינור איסוף.
5. הוספת חיץ ציטרט נוסף 1 מיליליטר / גרם 0.075 M נתרן למדגם ולבצע agita homogenizer אחד סופי ספסל העליוןמחזור tion.
6. הוספת supernatant זה סופי לצינור איסוף.
7. צנטריפוגה צינור האיסוף ב3,200 XG 10 דקות ב 4 ° C.
8. מעביר את supernatant לתא העליון של משקל מולקולרי 100,000 נותק מכשיר מסנן צנטריפוגלי.
9. צנטריפוגה ב 3,200 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C.
10. העבר col1 מטוהר מהתא העליון לצינור נקי חרוטי ולאחסן ב 4 ° C.

תוצאות

פרוטוקול בידוד col1 זה דורש כ 2 שעות ו15 דקות כדי להשלים. איור 1 מציג תרשים סכמטי המתאר את השלבים העיקריים בהליך זה. הכנת הדגימה וביצוע 7 המחזורים של הסתה במהירות גבוהה ושטיפות עם נתרן אצטט לוקחת כ 35 דקות (איורים 1 א-C). ביצוע תסיסה אחד ולשטוף מחזור עם DH ₂ O לוקח כ 5 דקות (1D דמויות ו1E). הוספת ציטרט הנתרן והכפפת המדגם לתסיסה אחד ולשטוף מחזור ואחרי 6 מחזורים של תסיסה לוקח כ 45 דקות (1F דמויות ו1G). צנטריפוגה המוצקים ש...

דיון

מרכיב חיוני בשיטה זו הוא יעילה הדחיסה החוזרת של דגימת עורי להסיר את הנוזל עודף. זה קריטי כדי להסיר כמה שיותר נתרן אצטט ככל האפשר בשלב 2.5 ידי דחיסת המדגם. אנו משתמשים במרית כדי לדחוס את העור מפני הצד של הצינור, אך יכולה לשמש גם גזה, אם כי זה יחייב ההסרה של המדגם מהצינור ולהגדיל את הזמן הנדרש לביצוע פעולות אלה. כמו כן, חשוב כדי לדחוס את המדגם בשלב 3.1 כך שהנפח של ציטרט הנתרן הוא מדויק בצעדי חילוץ שלאחר מכן. אי להסיר כראוי נוזל מהמדגם בכל אחד מהשלבים הבאים תהיה השפעה מזיקה על תשואת ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
FastPrep-24 System	MP Biomedicals	116004500
צנטריפוגה	Beckman	J6-MI	רוטור דלי נדנדה כדי להכיל צינורות חרוטיים של 50 מ"ל ב-3,200 x גרם.