הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד ואפיון של חלבונים דוברי Fc אנושיים כימריים באמצעות חלבון ספיחה ממברנה וזרימת עבודה יעילה

6.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51023

⸱

8 בינואר 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Ohio University, 2Biomedical Engineering Program, Russ College of Engineering and Technology, Ohio University, 3Department of Dermatology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

במאמר זה

סיכום

בהשוואה לכרומטוגרפיה מסורתית של זיקה באמצעות חלבון עמודים עמוסי חרוזים A, חלבון ספיחה קרום A יכולה להאיץ באופן משמעותי בידוד בקנה מידה מעבדתי של נוגדנים וחלבונים אחרים המבטאים שברי Fc. שיטות ניתוח וכימות מתאימות יכולות להאיץ עוד יותר את עיבוד החלבון, ולאפשר השלמת בידוד/אפיון ביום עבודה אחד, במקום 20+ שעות עבודה.

תקציר

סולם מעבדה לטיהור בקנה מידה תעשייתי של biomolecules מתרבות התא supernatants ופתרונות תאים lysed ניתן להשיג באמצעות כרומטוגרפיה זיקה. בעוד כרומטוגרפיה זיקה באמצעות חלבון נקבובי חרוזי agarose ארוזים בעמודים היא ללא ספק השיטה הנפוצה ביותר של בידוד בקנה מידה מעבדה של נוגדנים וחלבונים רקומביננטיים המבטאים שברי Fc של IgG, זה יכול להיות תהליך זמן רב ויקר. מגבלות זמן ופיננסים מרתיעות במיוחד במעבדות מדע בסיסיות קטנות שחייבות לשחזר מאות מיקרוגרם לכמויות מיליגרם של חלבון מפתרונות מדוללים, אך חסרות גישה למערכות אספקת נוזלים בלחץ גבוה ו/או כוח אדם עם מומחיות בביו-ספרות. יתר על כן, כימות ואפיון המוצר עשוי גם להאריך יתר על המידה את זמן העיבוד על פני מספר ימי עבודה ולנפח הוצאות (חומרים מתכלים, שכר וכו '). לכן, פרוטוקול מהיר, זול, אך יעיל נדרש לבידוד בקנה מידה מעבדה ואפיון של נוגדנים וחלבונים אחרים בעלי שבר FC. למטרה זו, פיתחנו פרוטוקול שניתן להשלים על ידי צוות טכני בעל ניסיון מוגבל בפחות מ 9 שעות (בערך יום עבודה אחד) ובמהירות של 4 שעות, בניגוד לשיטות מסורתיות הדורשות 20 + שעות עבודה. רוב הציוד הנדרש זמין בקלות במעבדות הנדסה ביו-רפואית סטנדרטיות, ביוכימיה ו(ביו), וכל ריאגנטים זמינים מסחרית. כדי להדגים פרוטוקול זה, מוצגות תוצאות מייצגות שבהן כימרי מורין galectin-1 התמזגו Fc האנושי (Gal-1hFc) מתרבות התא supernatant היה מבודד באמצעות חלבון ספיחה קרום A. גל-1hFc מטוהרת כובתה באמצעות הליך ניתוח כתמים מערבי מזורז והתאפיינה באמצעות ציטומטריית זרימה. ניתן לשנות את זרימת העבודה היעילה עבור חלבונים אחרים המבטאים Fc, כגון נוגדנים, ו/או לשנות אותה כך שישלבו שיטות כימות ואפיון חלופיות.

מבוא

בידוד של נוגדנים וחלבונים רקומביננטיים המבטאים שברי אימונוגלובולין G (IgG) Fc מתרבות התאים supernatants ופתרונות תאים מדוללים lysed ניתן להשיג באמצעות חלבון כרומטוגרפיה זיקה. במעבדות ובתעשייה בסיסיות של מדע והנדסה, עמודים עמוסים בחלבון נקבובי A מצופה agarose, זכוכית, או חרוזים פולימריים משמשים בדרך כלל עבור כרומטוגרפיה זיקה, למרות עלויות כספיות גבוהות וזמני עיבוד ארוכים1-3. זה מוערך היטב כי כרומטוגרפיה זיקה מייצגת את ההוצאה הגדולה ביותר ועיבוד צוואר בקבוק הן במעבדה והן בהגדרות תעשייתיות2,4. כתוצאה מכך, שיפורים רבים פותחו כדי להקטין את עלות זמן העיבוד מבלי להקריב את התאוששות המוצר הכוללת מרכבת התהליך1,2,5-7. מבטיח במיוחד לבידוד של נוגדנים וחלבונים אחרים מבטא Fc הוא כרומטוגרפיה זיקה באמצעות חלבון ספיחה קרום2,5,7-10. בעוד לכידת Fc ב chromatography עמודה הוא דיפוזיה מוגבלת(כלומר Fc-expressing חלבון חייב להתפזר לתוך ובאמצעות נקבוביות פנימיות כדי להגיע לרוב החלבון A) עם ירידה בלחץ גבוה על פני העמודה, הסעת המונים ספיחה ממברנה מונעת על ידי הסעה בתפזורת, וכתוצאה מכך הימנעות מגבלות דיפוזיה8,9,11,12. בנוסף, ירידה בלחץ על פני ספיחה ממברנה נמוכה, ובכך מאפשר קצב זרימת זלוף מהיר יותר לעומת עמודים ארוזים חרוזים8,9,11,12. לכן, עבור בידוד בקנה מידה מעבדה, כרומטוגרפיה קרום צפוי להפחית את זמן הבידוד על ידי מספר שעות ולהגדיל את לכידת המוצר לעומת כרומטוגרפיה עמודה. יתר על כן, מודלים מתמטיים עבור ספיחה IgG ספיחה ממברנה הוצעו8,9,11,12, ובכך מאפשר למשתמשי קצה לחזות ביצועים במעבדה.

צוואר בקבוק נוסף במעבדות מדע והנדסה בסיסיות הוא אפיון החלבון המבטא Fc. עם זאת, בחירת שיטות מתאימות להשלמת מבחני אפיון, כגון כתמים מערביים, יכולה להפחית מאוד את הזמן המושקע בבדיקות מוצרים. לדוגמה, העברה חלקית במערכת חיץ רציפה יכולה להשיג העברה אלקטרופורטית של חלבונים מג'ל SDS-PAGE לקרום פוליוויניל דיפלוורידין (PVDF) תוך דקות ספורות, לעומת העברה של שעה-שעתיים במיכל (רטוב) במערכת חיץ רציפה13.

פרוטוקול מהיר, זול ויעיל לבידוד ואפיון של חלבון היתוך כימרי המבטא שבר FC של IgG אנושי מתואר בזאת. רוב הציוד זמין בקלות במעבדות הנדסה ביו-רפואית בסיסיות סטנדרטיות, ביולוגיה, כימיה ו(ביו), וכל ריאגנטים זמינים מסחרית. למרות שתוצאות מייצגות נוצרו מבידוד ואפיון של חלבון היתוך כימרי של Murine galectin-1/Human Fc (Gal-1hFc), ניתן להחיל את הפרוטוקול היעיל על בידוד של מולקולות אחרות בעלות שבר Fc, כגון נוגדנים, שברי Fc עצמם, או חלבוני היתוך Fc אחרים. השיפורים שלנו הפחיתו באופן דרמטי את זמן העיבוד (עד 4 שעות אך בדרך כלל ~ 9 שעות, לעומת 20 + שעות עבודה) תוך השגת התאוששות מוצר דומה או משופרת בהשוואה לשיטות סטנדרטיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. אמת את הזיקה לחלבון A

  1. ודאו שהחלבון המבטא Fc (חלבון היתוך רקומביננטי או נוגדן IgG, עד כה המכונה "חלבון") יש זיקה מקובלת לחלבון A14-17 לפני השימוש בחלבון ספיחה קרום A, ולבדוק את נוכחות החלבון בתמיסת המלאי (למשל, תרבות התא supernatant הובהר על ידי צנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 5 דקות כדי גלולה תאים מושעים). השתמש ציטומטריה זרימה, סופג המערבי, ELISA, וכו '. כדי לזהות תפקוד חלבון ו/או נוכחות של Fc, בהתבסס על העדפת המעבדה. באופן אידיאלי, לכמת את החלבון בתרבית התא supernatant (שלב 6) כדי למנוע חריגה חלבון קיבולת ספיחה קרום. המשך אם מתגלה חלבון.

2. הכן חלבון ספיחה קרום ותרבות תאים Supernatant

  1. בצע את הוראות היצרן להכנת ספיחה ממברנה. לעולם אל תיתן לאוויר להיכנס לספינת הממברנה. כל הפתרונות perfused דרך ספיחה ממברנה צריך להיות בטמפרטורת החדר מסונן מראש באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. מלא מזרק 10 מ"ל עם 0.22 מיקרומטר מסונן פוספט של פוספט אגירה מלוחים (DPBS) או מאגר של בועות אוויר בחירה ופריקה. לעיין DPBS כדי להסיר את פתרון האחסון כדי לייצב את ספיחה קרום מיד לפני השימוש.
  2. לסנן את תרבות התא supernatant מיד לפני זלוף דרך ספיחה קרום, באמצעות יחידת סינון סטרילי 0.22 מיקרומטר מונחה ואקום.

3. לטעון את החלבון ספיחה קרום

  1. לשאוף את תרבות התא supernatant לתוך מזרק לואר לוק (30 מ"ל או יותר), ולפרוק כל בועות אוויר.
  2. אספו חומרים וציוד כפי שמוצג באיור 1. חבר את המזרק למפרצון של ספיחה ממברנה. חבר צינורות גמישים לשקע ספיחה ממברנה. אם תרצה, למקם מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר בין המזרק לבין ספיחה קרום. השתמש בקבוק או בקבוק כדי לתפוס זרימה דרך (הידוע גם בשם סינון), מן הספייחה.
  3. הגדר את משאבת המזרק לקצב הזרימה הנפחי הרצוי, אך אל תחרוג מקצב הזרימה המומלץ של היצרן (למשל 10מ"ל לדקה). לחלחל את תרבות התא supernatant דרך ספיחה קרום, איסוף זרימה דרך בכומתה או מיכל אחר. טען מחדש את המזרק עם supernatants צורך.
  4. אם תרצה, בדוק את הזרימה דרך נוכחות של חלבון באמצעות cytometry זרימה, סופג מערבי, ELISA, וכו '. בהתבסס על העדפת המעבדה. זה בדרך כלל מיותר כדי reperfuse את הזרימה דרך.

4. חלבון אלוט מסופג הממברנה

  1. לשטוף את ספיחה ממברנה עם 10 מיליליטר DPBS כדי להסיר כל חלבון שאינו מאוגד.
  2. חלבון אלוט מספח הממברנה בקצב הזרימה הרצוי (למשל 1מ"ל /min) באמצעות 10-15 מ"ל של מאגר אלוטיון(למשל מאגר אלוציה מבוסס אמין (pH 2.8)). לתפוס eluate בצינור המכיל חיץ נטרול(למשל 1 M Tris (pH 9.4)) ב 10% של נפח elution (1.0-1.5 מ"ל).
  3. לחלופין, חלבון elute במרווחים מיליליטר אחד לתוך צינורות המכילים 100 μl של חיץ נטרול, באמצעות נפח כולל של 10-15 מיליליטר מאגר elution. השתמש בשיטת האפיון המועדפת כדי לבדוק כל שבר לנוכחות של חלבון.
  4. לחדש את ספיחה קרום על פי הוראות היצרן. לחלחל 10 מיליליטר של 0.22 מיקרומטר מסונן DPBS או מאגר של בחירה, אז 10 מיליליטר של 0.22 מיקרומטר מסונן 50 מ"מ NaOH ב 1 N NaCl, ולבסוף 10 מיליליטר של 0.22 מיקרומטר מסונן DPBS. מלאו את ספיחה הממברנה ב-20% אתנול ב-DPBS לאחסון ארוך טווח ב-4 מעלות צלזיוס.

5. לרכז ולדיאליז את החלבון

  1. להפקיד את כל eluate (או שברי elution המכיל חלבון כפי שנקבע בשלב 4.3) ביחידת 10 kDa משקל מולקולרי מנותק צנטריפוגלי מסנן. בצע את הוראות היצרן לצנטריפוגה.
  2. דיאליזה retentate ביחידת דיאליזה נפח קטן (10 kDa משקל מולקולרי מנותק) נגד המאגר של בחירה, בעקבות הוראות היצרן. ייתכן שיהיה צורך להוסיף מאגר לחומר דיאליזה אם משקעים בחלבון הם דאגה. אם תרצה, ניתן יהיה לשמור בקירור את החומר המחודד עד שניתן יהיה לבצע את שלב 6, אך אחסון לטווח ארוך ללא חומרים משמרים אינו מומלץ.

6. לכמת ולאפיין מוצר מטוהר בהליך בלום מערבי מזורז

  1. פתור חלבונים מטוהרים ותקני Fc על הג'ל המועדף על ידי SDS-PAGE, בתנאים מפחיתים או לא מרוקנים לפיהצורך 18-20. השתמש ג'ל מיני ולא midi ג'ל כדי למזער את זמן הריצה.
    1. אם עדיין לא ידוע, קבעו את טווח הסטנדרטים של Fc מעל איזה אות פס משתנה באופן ליניארי ביחס לכמות הטעונים (למשל 0.1-1 מ"ג). השתמש באותו ג'ל, תנאי ריצה, תנאי העברה, ריאגנטים שישמשו לכימות ואפיון חלבון מטוהר.
    2. טען כמויות מדגם מרובות של חלבון מטוהר, כולל דגימות מדוללות עם DPBS, כדי להבטיח כי אותות רצועת חלבון מטוהרים נמצאים בטווח האותות הליניארי של תקני Fc בניתוח תמונה.
  2. להעביר חלבונים מהג'ל לקרום פלואוריד פוליווינילידן (PVDF) במערכת חיץ רציפה באמצעות בלוטר חצי13, בעקבות הוראות יצרן הבלוטר. זמן ההעברה הוא בדרך כלל 5-10 דקות. אם תרצה, קומאסי כתם את הג'ל לאחר ההעברה כדי לאמת את יעילות ההעברה21.
  3. בצע immunoblotting עם אנטי Fc או אנטי IgG מצומד אלקליין phosphatase (AP) או חמצן צנון סוס (HRP), בהתבסס על העדפת המעבדה, באמצעות מערכת לגילוי חלבון בסיוע ואקום. זמן חיסון הוא בדרך כלל פחות משעה.
  4. לפתח immunoblot באמצעות המצע ואת השיטה של בחירה(למשל מצע AP ו chemiluminescence משופרת).
  5. לכמת חלבון מטוהר על ידי ניתוח תמונה. בצע רגרסיה ליניארית באותות הלהקה מהסטנדרטים של Fc. אם R2>0.90, השתמש במשוואה עבור הקו כדי לחשב כמות חלבון מאותות הרצועה שלו. תסביר דילול לדוגמה במידת הצורך. מאז כימות החלבון מבוצע על בסיס Fc, להתאים את הערך עבור הבדלי משקל מולקולרי בין החלבון Fc. אם R2<0.90, לחזור על שלב 6 בשלמותו.
  6. לאמת חלבון באמצעות מבחנים פונקציונליים או שיטות כדי לזהות Fc באמצעות cytometry זרימה, סופג מערבי, ELISA, וכו '. בהתבסס על העדפת המעבדה.
  7. לדלל חלבון לריכוז הרצוי ו/או להוסיף חומרים משמרים או מייצבים רצויים לתמיסת החלבון המטוהר לפני ההזנה לאחסון ארוך טווח, קפוא או אחר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפרוטוקול היעיל לבידוד ואפיון חלבוני Fc-expressing משמש באופן שגרתי לעיבוד גלקטין-1 של מורין כימרי מותך ל- Fc האנושי (Gal-1hFc) מתרבות תאים מדוללת. תרשים הזרימה באיור 2 מדגים את זרימת העבודה והזמן עבור כל שלב בפרוטוקול. עבור אצווה טיפוסית של 300 מ"ל של supernatant, זמן העיבוד הכולל הוא כ 9 שעות כאשר הבדיקה cytometry זרימה אופציונלית של שברי elution מבוצעת. אם כל ניתוח cytometry זרימה מושמט, בשל חוסר סיטומטר זרימה או העדפת מעבדה בודדת, זמן העיבוד הכולל יכול להיות קצר כמו 4 שעות. באופן כללי, זמן העיבוד תלו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר בזאת פותח כדי לבודד במהירות ולאפיין חלבון היתוך כימרי המבטא Fc אנושי (Gal-1hFc), מבלי להתפשר באופן משמעותי על התאוששות המוצר או עלות ניפוח. המרכיבים העיקריים של זרימת העבודה היעילה הם חלבון ספיחה ממברנה לבידוד, והעברה חלקית ואימונובליקה בסיוע ואקום לאפיון על ידי סופג מערבי.

הירידה הדרמטית בזמן העיבוד לבידוד ואפיון של Gal-1hFc מ-300 מ"ל של סופרנאטנט של תרבות התאים (כ-9 שעות בפרוטוקול היעיל בהשוואה ל-20+ שעות בפרוטוקול מסורתי) מיוחסת במידה רבה לשילוב רכיבי המפתח הנ"ל, במיוחד ספי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מבקשים להודות למר לואיס פ. דלגאדיו (המחלקה להנדסה כימית וביומולקולרית, אוניברסיטת אוהיו), למר מתיו ויליאמס (המחלקה להנדסה כימית וביומולקולרית, אוניברסיטת אוהיו), ולד"ר פיליברטו סדנו-לורן (בית החולים בריגהם ונשים ובית הספר לרפואה של הרווארד) על סיוע טכני מומחה. המחברים גם מבקשים להודות חורף 2011 CHE 404/BME 504 וסתיו 2012 CHE 4830/BME 5830 סטודנטים (המחלקה להנדסה כימית וביומולקולרית ותכנית הנדסה ביו רפואית, אוניברסיטת אוהיו) עבור ייעוץ טכני ודיון. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (NSF) מענק מכשור מחקר גדול CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), מענק מחקר קרן דרמטולוגיה A050422 (SRB), המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענק NCI 1R15CA161 830-01 (MMB), NIH קירששטיין-NRSA פוסט דוקטורט מלגת F32CA144219-01A1 (SRB), NIH / NCI R01CA173610 (CJD), ו NIH NCCAM מענק R01AT004628 (CJD).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סופח ממברנה של חלבון A (חלבון Sartobind A 2 מ"ל) Sartorius-Stedim93PRAP06HB-12--A
מסנן Amicon Ultra צנטריפוגלי, 10 kDa, 4 מ"לMilliporeUFC801008השתמש בנפח 15 מ"ל במידת הצורך
יחידת מסנן ואקום סטרילית, 0.22 ומיקרו; מ', 500 מ"לMilliporeSCGPU05RE
10 מ"ל מזרקים עם קצות Luer LockBD301604
30 מ"ל עם קצות Luer LockBD309650
צינורות מעבדה טיגון (1/16 אינץ' x 1/8 אינץ' x 50 רגל)Cole ParmerWU-95903-16
Slide-A-Lyzer MINI מכשירי דיאליזה (10K MWCO)Thermo Scientific69576
Snap i.d. מגש איסוף נוגדניםEMD MilliporeWBAVDABTR
Snap i.d. מחזיק כתם באר יחידEMD MilliporeWBAVDBH01
מאגר אלוטיוןThermo Scientific21004
Tris, טהור במיוחדFisher Scientific819623
נתרן כלוריפישר סיינטיפיק7647-14-5
Tween 20Fisher ScientificBP337-100
DPBSThermo ScientificSH30028.02
DPBS עם Ca2+/Mg2+Life Technologies14080-055
BSASigmaA9647
מעבדות מחקר בתילאנושיP80-104
אנטי-אנושי Fc-APCג'קסון Immunoresearch109136170
Anti-Human Fc-APBio-Rad170-5018
מצע פוספטאז אלקלייןPromegaS3841
צינורות ציטומטריית זרימה (5 מ"ל פוליסטירן או פוליפרופילן)352054
מכשיר הרווארד55-2226משאבה פריסטלטית מקובלת גם
ג'ל חלבון מערכת אלקטרופורזהBio-Rad Laboratories552BR094876כל מערכת אלקטרופורזה של ג'ל מקובלת, אך מערכות מיני ג'ל פועלות במהירות המהירה ביותר
Semidry BlotterBio-Rad Laboratories690BR006163כל מערכת העברה מקובלת, אך מערכות העברה דיסקופורטיות מבצעות העברה אלקטרופורטית המהירה ביותר
SNAP i.d. מערכת זיהוי חלבון בסיוע ואקוםEMD MilliporeWBAVDBASEדגם משודרג החליף את הכלי הספציפי הזה, אבל שניהם אמורים לעבוד באותה מידה
משאבת מזרק BD

מקורות

  1. Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).
  2. Gottschalk, U. Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly. Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).
  3. Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2, 480-499 (2010).
  4. Low, D., O'Leary, R., Pujar, N. S. Future of antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).
  5. Boi, C. Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).
  6. Cuatrecasas, P. Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads. J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).
  7. Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).
  8. Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies. Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).
  9. Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography. J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).
  10. Thommes, J., Etzel, M. Alternatives to chromatographic separations. Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).
  11. Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Modelling and simulation of affinity membrane adsorption. J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).
  12. van Beijeren, P., et al. Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing. Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).
  13. Lauriere, M. A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page. Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).
  14. Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O'Kennedy, R. Purification of antibodies using affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).
  15. Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins. FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).
  16. Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein a chromatography for antibody purification. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).
  17. Kronvall, G. A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g. J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).
  18. Cedeno-Laurent, F., et al. Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation. J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).
  19. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  20. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
  21. Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
  22. Cedeno-Laurent, F., et al. Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity. J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), (2009).
  25. Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), (2010).
  26. Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).
  27. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
  28. Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. J. Vis. Exp. (50), (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Western Blotting
בידוד ואפיון של חלבונים דוברי Fc אנושיים כימריים באמצעות חלבון ספיחה ממברנה וזרימת עבודה יעילה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.