מאמר שיטה

הנדסת רקמות: בנייה תאית 3D פיגום למשלוח גיליונות סלולריים שכבות

DOI:

10.3791/51044

⸱

3 באוקטובר 2014

 ,  , 
1School of Engineering, University of California, Merced

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ליצירת מבנים מאורגנים מאוד של רקמה מורכבת, יש להרכיב מספר חומרים וסוגי תאים לכדי קומפוזיט משולב. עיצוב קומבינטורי זה משלב יריעות תאים שכבתיות ספציפיות לאיבר עם שני חומרים נפרדים שמקורם ביולוגית המכילים בסיס מטריצה סיבי חזק, ותאי אנדותל לשיפור היווצרות כלי דם חדשים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמות רבות, כגון לב האדם הבוגר, אינן מסוגלות להתחדש כראוי לאחר נזק. 2,3 אסטרטגיות בהנדסת רקמות להציע חידושים על מנת לסייע לגוף בהתאוששות ותיקון. לדוגמא, גישות TE ייתכן שתוכלנה להחליש לב שיפוץ לאחר אוטם שריר הלב (MI) ואולי להגדיל את סך תפקוד לב לרמתו ערב MI הנורמלי ליד. 4 כמו בכל רקמה פונקציונלית, התחדשות מוצלחת של רקמת לב כרוכה באספקה ​​הנאותה של סוגי תאים מרובים עם רמזים סביבתיים העדפת אינטגרציה והישרדות של שתל תא / רקמה המושתלת. רקמות מהונדסות צריכים להתייחס פרמטרים רבים, כולל: אותות מסיסים, אינטראקציות תא אל התא, וחומרי מטריצה ​​הוערכו ככלי רכב משלוח, ההשפעות שלהם על הישרדות תא, חוזק חומרים, וסיוע של ארגון תא אל רקמות. מחקרי העסקת ההזרקה הישירה של תאי שתל רק להתעלם היסודות החיוניים האלה. 2,5,6עיצוב רקמת שילוב מרכיבים אלו טרם פיתח. כאן, אנו מציגים דוגמא לעיצובים משולבים באמצעות שכבות של יריעות תא בדוגמת עם שני סוגים שונים של חומרים המופקים ביולוגיים המכילים את סוג תא איבר המטרה ותאי האנדותל לשיפור היווצרות כלי דם חדש ב" הרקמה ". למרות שהמחקרים האלה מתמקדים בדור של כמו לב רקמות, עיצוב רקמה זו יכול להיות מיושם על איברים רבים אחרים מאשר לב עם שינויים בעיצוב וחומר מינימאליים, והוא אמור להיות מוצר מהמדף לטיפולי משובי. הפרוטוקול מכיל חמישה שלבים מפורטים. טמפרטורת פולי הרגישים (-isopropylacrylamide N) (pNIPAAM) משמשת למאכלי תרבית רקמת מעיל. לאחר מכן, תאי רקמה ספציפית בתרבית על פני השטח של לוחות מצופים / משטחי micropattern כדי ליצור גיליונות תא עם הידבקויות לרוחב חזקות. שלישית, מטריצת בסיס נוצרה לרקמה על ידי שילוב של מטריצה ​​נקבובית עם permissi neovascularve הידרוג ותאי האנדותל. לבסוף, גיליונות התא הם הרימו ממנות pNIPAAM המצופים והועברו למרכיב הבסיס, מה שהופך את המבנה השלם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הזרקת תאים ו/או חומרים בודדים בלבד הראתה הצלחה משתנה במערכות איברים אחרות והצלחה מוגבלת בהתחדשות הלב. 5,7-12 נכון לעכשיו, תאים שמקורם בתאי גזע מועברים לרקמות פגועות במגוון שיטות אספקה כולל: הזרקת תאים ישירה לרקמה וזלוף לאספקת הדם. 13-17 אחרים השתילו תאים לבד, חומרים לבד ו/או בשילוב עם נשאי חומרים כדי לסייע בחידוש איברים פגומים. 18-21 עיצוב זה משלב אסטרטגיות מרובות המספקות חוזק חומר, דפוס בחומרים מרובים וסוגי תאים מרובים.

באופן ספציפי, המטריצה הסיבית הבסיסית מספקת את הכוח הפיזי הבסיסי למבנה, מה שהופך אותו למתאים לתפירה לתוך המטופל, במידת הצורך. החללים החללים במטריצת הבסיס מלאים בתאי אנדותל בהידרוג'ל מתירני ניאו-וסקולרי22 לביסוס מהיר של כלי הדם של המבנה המושתל. מרוכב זה משולב לאחר מכן עם יריעות תאים מעוצבות מראש המאפשרות תקשורת משופרת בין תאים, מחקה יותר את הרקמה הטבעית. 1,23-25 תהליך הייצור הכולל של התיקון הסלולרי השכבתי מתואר על ידי תרשים הזרימה באיור 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

.1 יצירה של צלחות מצופות pNIPAAM

  1. ממיסים את g 2.6 של pNIPAAM ב2 מ"ל של פתרון הקסאן / 40% 60 טולואן%.
  2. מחממים את התערובת ל60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עוררו, עד pNIPAAM נמס.
  3. לחתוך נייר סינון לתוך מעגל 60 מ"מ קוטר ונייר מקום במשפך בוכנר.
  4. סנן את הפתרון דרך המשפך בוכנר לתוך כוס הזכוכית שקל מראש (לא להשתמש בפלסטיק, כהקסאן ימס פלסטיק).
  5. מניחים את הכוס והתוכן לתוך ואקום פעמון O (24 psi) / N (16 hr). הערה: עד השאריות הוא הגיב עם איזופרופיל זה יהיה לחמצן כדי לוודא זה לא בא במגע עם חמצן.
  6. לשקול את הכוס להקים את המשקל של pNIPAAM.
  7. להוסיף באלכוהול רפואי לpNIPAAM, יצירת 50/50 w / w פתרון.
  8. מניחים 2 מ"ל של הפתרון על פני השטח של צלחת תרבית הרקמה, ומעיל למשך 5 דקות תחת אור UV.
  9. לשטוף את הצלחת עם 2 מ"ל של PBS החם פעמייםלפני השימוש בתרבית תאים.

.2 יצירת גיליונות סלולריים

הערה: גיליונות תא של תאים ראשוניים לאיבר המטרה יכולים להיות שנוצרו באמצעות מספר השיטות שונות, או על ידי ציפוי משטחי תרבית רקמה עם פולימר תרמו מגיב כפי שמתואר כאן. צלחות תרמו רגיש טרום מצופים מוצעות גם על ידי מספר הספקים.

הערה: פרוטוקול זה מיועד לתרבות באמצעות צלחת 35 מ"מ. בקצרה, תאים מודגרת ראשון על 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימאלית של 24 שעות בנקודת המפגש ליצור חיבורי רוחב בין תאים סמוכים. לשחרר גיליונות תא, צלחות חשופים לטמפרטורות מתחת 32 ° C. גיליון התא הוא הועבר לאחר מכן למטריצה ​​הסיבית הבסיס החזק המכילה הידרוג'ל מתירנית neovascular עם תאי האנדותל של כלי דם.

  1. לבודד את אוכלוסיית התאים. הערה: שיטה זו תלויה בנהלי גזירת פרט ואת הסוג של תאים. mu החלק אב העורקים עכברושתאי scle (RASMC) משמשים בדוגמא זו. אלה הם תאי שריר חלק עיקריים מבודדים מאב העורקים בבטן של חולדה.
  2. שוטף את התאים עם 2 מ"ל של PBS החם.
  3. הוסף 3 מ"ל של טריפסין (או ביקוע / פתרון disassociating אחר) לתאים למשך 5 דקות.
  4. לעכב טריפסין על ידי התוספת של 3 מ"ל של התקשורת והתרבות, או פתרון חיץ פוספט (PBS) המכיל 10% בסרום שור עוברי (FBS).
  5. לאסוף את התאים בצינור חרוטי ולספור aliquot.
  6. ספין התאים ב 1,000 סל"ד (228 XG) במשך 5 דקות.
  7. לשאוב supernatant ו resuspend התאים בתקשורת הצמיחה שלהם (בינוני תרבות SmGM2 בתוספת ערכת כדור משמש לRASMC).
  8. הנח את המדיה המכילה את התאים על צלחת 35 מ"מ תרמו רגישה - צלחת מצופה pNIPAAM בריכוז שישיג 100 מפגש%. הערה: לקבלת RASMCs המספר שנקבע להיות 100,000 תאים / 2 סנטימטר. עם זאת, כתוצאה מאובדן של תאים במהלך החולף, 120% מva ש משמש lue.
  9. מקום לתוך חממה על 37 מעלות CO / N. שים לב: חשוב לשמור על התאים ב37 ° C כדי לשמור על הידבקות התא לצלחת.

.3 הכנה של מטריקס המכונן

הערה: מטריצות סיבי 3D שונים ניתן להשתמש כדי שכבת מטריצה ​​סיבית חזקה בין סדיני תא העדינים. כמה דוגמאות כוללות: gelfoam, bioglass, חומרי acellularized טבעיים 26 או nanospun חומרי 27,28 המטריצה ​​חזירי שתן בשלפוחית ​​השתן (UBM) משמשת במחקרים אלה סופקה בנדיבות ממשתף הפעולה שלנו, ד"ר Badylak 29.

  1. לפני שימוש, לקבוע מאפייני מטריצה ​​כולל חוסר התוכן סלולארי אם נעשה שימוש במטריצה ​​decellularized, 27,28 כדאיות ספציפית תא, וחלל הריק. 22
  2. חותך את המטריצה ​​מעוקרת מראש לגודל וצורה רצויים. הערה: כאן, ניקוב חורים משמש לחיתוך עיגול בקוטר 4 מ"מ.
ve_title "> 4. תאי האנדותל זריעה לNeovascular מתירנית Hydrogel

הערה: ניתן להשיג תאי האנדותל ממגוון רחב של מקורות, כולל בידול מתאי גזע או אב. כאן, HUVECs משמש.

  1. השתמש בכל זמן כמו בפעם cross-linking הידרוג'ל יתר (הפיברין, ג'ל קולגן) הוא קצר מספיק כדי לאפשר לתאים להישאר בת קיימא. שים לב: כאן, ג'ל hyaluronan (HA) המבוסס צולב עם גשר דיסולפיד משמש.
  2. הכן את הידרוג'ל HA בהתאם לפרוטוקול החברה.
  3. לאסוף את תאי האנדותל ולפזר לפתרון תא בודד באמצעות טריפסין 1x. הערה: Accutase או תא דיסוציאציה הצפת יכול לשמש גם לפיזור תא בודד.
  4. לבטל את אנזים טריפסין על ידי שימוש בכמות שווה של מעכבי טריפסין הסויה (אם זה חשוב כי תאים אינם באים במגע עם סרום) או 10 FBS% PBS, איסוף הפתרון / צינור חרוטי תאים לתוך 15 מ"ל.
  5. Count התאים, ולחשב את הנפח הדרוש לממדי התיקון (לכמת בעבר). הערה: לקבלת תיקון 4 מ"מ, המשמשים כאן 2 מיליון תאי האנדותל.
  6. חלץ 2 מיליון תאים, ומקום לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל חדש.
  7. ספין ב( 228 XG) במשך 5 דקות.
  8. לשאוב supernatant, עוזב את התאים כגלולה בצינור חרוטי.
  9. מערבבים את החומרים נוזליים HA וטין ב1: מנת 1. לאחר מכן להוסיף 80% מהנפח הכולל לתוך צינור חרוטי המכיל גלולה.
  10. Resuspend תאי אנדותל ב1: 1 HA / התערובת לטין
  11. מניחים את התאים התלויים בתערובת HA / לטין לתוך המטריצה ​​הסיבית הבסיס מהשלב 2.
  12. הוספת 1/5 (20 אחוזים) מכלל הנפח הרצוי של צולב מקשר
  13. דגירה של השעה 1 ב37 מעלות צלזיוס.

.5 בידוד של גיליונות סלולריים

  1. הסר את הצלחות שטופלו pNIPAAM 35 מ"מ המכילות את התאים מן החממה והמקום במכסת מנוע תרבית תאים בRT.
  2. במהירות לשאוב את התקשורת מהתאים, ולהוסיף 2 מ"ל של 6% ג'לטין הרגיל שחומם ל37 מעלות צלזיוס.
  3. בעוד ג'לטין הוא עדיין חם, מניח את סריג המתכת לתוך ג'לטין, והשקיע אותה מתחת לפני השטח של ג'לטין הרגיל (סרט 1).
  4. מניחים את הצלחת כולה על גבי קרח למשך 5 עד 7 דקות, המאפשר את הג'לטין להקשיח.
  5. לאחר 7 דקות, להשתמש במרית כדי להפריד בזהירות את קצות ג'לטין מהצד השני של הצלחת, ולאחר מכן להשתמש במלקחיים כדי להרים את סריג המתכת מהערת הצלחת: ג'לטין 6%, וגיליון התא צריך להרים עם הסריג.
  6. הזז את גיליון התא לצלחת ומניח על גבי שילוב מטריצה-הידרוג'ל הבסיס סיבי, הגדרת הרשת בראש המבנה בזהירות. הערה: צד הפסגה של גיליון התא עדיין יהיה במיקום העליון.
  7. הוסף 2 מ"ל של תקשורת החמה (37 מעלות צלזיוס).
  8. דגירה O / N המאפשר הגיליון של תאים לדבוק פני השטח הידרוג'ל.
  9. הסר tהוא סריג מתכת לאחר הפתרון מחמם (כ 1 שעה), או ביום שלמחרת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרשים הזרימה (איור 1) מראה את השיטה הכוללת של מה שהופך את התיקון רב שכבתי. גיליונות תא מנותקים מהצלחת טופלה pNIPAAM על ידי הטלת הטמפרטורה מתחת 32 ° C. אז גיליון התא ממוקם בחלקו העליון של הידרוג'ל הצולב המכיל את תאי האנדותל זורעים לתוך המטריצה ​​הבסיסית סיבית (איור 1). גם הצלחות תרמו רגיש pretreated יכולות לשמש ליצירת גיליונות התא. משטחי טופולוגי מיוחדים המשמשים לדפוס באופן ספציפי (כלומר, ליישר) התאים 30.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השלבים הקריטיים בפרוטוקול כוללים: ציפוי משטחי צלחת עם פולימר thermoresponsive ומניפולציה של גיליונות התא לאחר קירור הצלחות. מכיוון שתאים שונים להציג תכונות פיזיות שונות, כמו adhesivity, זמן ההרמה צריך להיות מותאם לכל סוג תא אחר. המרכיב השני, ורוב מאתגר באופן משמעותי של פרוטוקול זה, מתמקד במניפולציה של גיליון התא, היבט קריטי של שיטות להרכבת רקמה. שכבת התא בודדת בגיליון התא היא די שבירה ויכולה לקרוע בקלות אם מניפולציות עם מלקחיים. יתר על כן, כאשר גיליונות התא אינם מוחזקים במקום, הם ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין לנו מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי פרס הפקולטה החדשה II מהמכון לרפואה רגנרטיבית בקליפורניה (CIRM; RN2-00921-1), פרס המחקר הלאומי במימון ה-NIH (F32-HL104924) ומענק הכשרה של CIRM (TG21163). החומרים סופקו על ידי: Glycosan Biosystems Inc / BioTime וד"ר סטיבן בדילאק (אוניברסיטת פיטסבורג)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים
>Calcein-AMInvitrogenC3099גשש תאים / צבע חי
Lysotracker אדוםInvitrogenL7528גשש תאים
ניטרלי אדוםסיגמאN7005צבע תא גלוי
pNIPAAMסיגמא אולדריץ'412780250פולי (N-isopropylacrylamide)
טולואןסיגמא אולדריץ'244511-1L
הקסאןסיגמא אולדריץ'296090-1L
RAOSMCלונזהR-ASM-580חולדה תאי שריר חלק אבי העורקים
SmGM2LonzaCC-4149תקשורת שריר חלק
HUVECInvitrogenC-003-5Cתאי אנדותל ורידים אנושיים
HyStemGlycosan / Biotime
איזופרופיל אלכוהולVWR InternationalBDH1133-4LP
TrypsinCorning Cellgro25-053-C1
PBSGibco14287-072
FBSGibco16140-071
<חזק>ציוד ספציפי
נייר סינוןAhlstrom 6310-0900 
משפך בוכנר סיגמא אולדריץ' Z247308 
לוחות UpCell Nunc 2014-11 
אור UVחברת Jelight מנקה UVO דגם מס '42

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ohashi, K., Okano, T. Functional tissue engineering of the liver and islets. Anat Rec (Hoboken). 297, 73-82 (2014).
  2. Chen, Q. Z., Harding, S. E., Ali, N. N., Lyon, A. R., Boccaccini, A. R. Biomaterials in cardiac tissue engineering: Ten years of research survey. Mat Sci Eng R. 59, 1-37 (2008).
  3. Jakob, P., Landmesser, U. Current status of cell-based therapy for heart failure. Curr Heart Fail Rep. 10, 165-176 (2013).
  4. Tongers, J., Losordo, D. W., Landmesser, U. Stem and progenitor cell-based therapy in ischaemic heart disease: promise, uncertainties, and challenges. Eur Heart J. 32, 1197-1206 (2011).
  5. Etzion, S., et al. Influence of embryonic cardiomyocyte transplantation on the progression of heart failure in a rat model of extensive myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 33, 1321-1330 (2001).
  6. Masuda, S., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering for heart tissue repair. Adv Drug Deliv Rev. 60, 277-285 (2008).
  7. Koh, G. Y., Soonpaa, M. H., Klug, M. G., Field, L. J. Strategies for myocardial repair. J Interv Cardiol. 8, 387-393 (1995).
  8. Li, R. K., et al. Construction of a bioengineered cardiac graft. J Thorac Cardiovasc Surg. 119, 368-375 (2000).
  9. Muller-Ehmsen, J., et al. Rebuilding a damaged heart: long-term survival of transplanted neonatal rat cardiomyocytes after myocardial infarction and effect on cardiac function. Circulation. , 105-1720 (2002).
  10. Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murry, C. E. Survival, integration, and differentiation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts. Circulation. , 100-193 (1999).
  11. Roell, W., et al. Cellular cardiomyoplasty improves survival after myocardial injury. Circulation. 105, 2435-2441 (2002).
  12. Soonpaa, M. H., et al. Potential approaches for myocardial regeneration. Ann N Y Acad Sci. 752, 446-454 (1995).
  13. Akins, R. E. Can tissue engineering mend broken hearts. Circ Res. 90, 120-122 (2002).
  14. Goodell, M. A., et al. Stem cell plasticity in muscle and bone marrow. Ann N Y Acad Sci. 938, 208-218 (2001).
  15. Menasche, P., et al. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet. 357, 279-280 (2001).
  16. Murry, C. E., Wiseman, R. W., Schwartz, S. M., Hauschka, S. D. Skeletal myoblast transplantation for repair of myocardial necrosis. J Clin Invest. 98, 2512-2523 (1172).
  17. Orlic, D., et al. Transplanted adult bone marrow cells repair myocardial infarcts in mice. Ann N Y Acad Sci. 938, 221-229 (2001).
  18. Elia, R., et al. Silk-hyaluronan-based composite hydrogels: a novel, securable vehicle for drug delivery. J Biomater Appl. 27, 749-762 (2013).
  19. Kai, D., et al. Stem cell-loaded nanofibrous patch promotes the regeneration of infarcted myocardium with functional improvement in rat model. Acta Biomater. , (2014).
  20. Hong, H. J., et al. Tracheal reconstruction using chondrocytes seeded on a poly(l-lactic-co-glycolic acid)-fibrin/hyaluronan. J Biomed Mater Res A. , (2014).
  21. Serpooshan, V., et al. The effect of bioengineered acellular collagen patch on cardiac remodeling and ventricular function post myocardial infarction. Biomaterials. 34, 9048-9055 (2013).
  22. Turner, W. S., et al. Cardiac tissue development for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial and cardiac cells in natural matrices. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 2060-2072 (2012).
  23. Sato, M., Yamato, M., Hamahashi, K., Okano, T., Mochida, J. Articular cartilage regeneration using cell sheet technology. Anat Rec (Hoboken). 297, 36-43 (2014).
  24. Sawa, Y., Miyagawa, S. Present and future perspectives on cell sheet-based myocardial regeneration therapy. Biomed Res Int. 2013, 583912(2013).
  25. Demirbag, B., Huri, P. Y., Kose, G. T., Buyuksungur, A., Hasirci, V. Advanced cell therapies with and without scaffolds. Biotechnol J. 6, 1437-1453 (2011).
  26. Song, J. J., Ott, H. C. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds. Trends Mol Med. 17, 424-432 (2011).
  27. Badylak, S. F., et al. The use of extracellular matrix as an inductive scaffold for the partial replacement of functional myocardium. Cell Transplant. 15, Suppl 1. S29-S40 (2006).
  28. Wang, Y., et al. Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds. Hepatology. 53, 293-305 (2011).
  29. Gilbert, T. W., et al. Collagen fiber alignment and biaxial mechanical behavior of porcine urinary bladder derived extracellular matrix. Biomaterials. 29, 4775-4782 (2008).
  30. Luna, J. I., et al. Multiscale biomimetic topography for the alignment of neonatal and embryonic stem cell-derived heart cells. Tissue Eng Part C Methods. 17, 579-588 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Tissue EngineeringCell SheetspNIPAAM CoatingFibrous Matrix HydrogelEndothelial CellsRat Aortic Smooth Muscle CellsLight MicroscopyCell Sheet TransferHydrogel CrosslinkingThermo Sensitive Polymer

מאמרים קשורים