פלסטיות עצבית היא תכונה מוכרת יותר ויותר, אבל הבינה מספיק של מערכת העיכול (GI). כאן, בדוגמא של הפרעות לבלב אנושיות, אנו מציגים assay neuroplasticity במבחנה לחקר פלסטיות עצבית במערכת העיכול ברמה שני מורפולוגיים ופונקציונלית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
Neuroplasticity הוא תכונה טבועה בעצבוב המערכת ומערכת עיכול (GI) העצבים enteric תחת מצבים פתולוגיים. עם זאת, תפקיד pathophysiological של neuroplasticity בהפרעות במערכת העיכול נותר עלום. מודלים ניסיוניים חדשניים המאפשרים סימולציה ואפנון של neuroplasticity GI עשויים לאפשר הערכה משופרת של התרומה של neuroplasticity במחלות במערכת העיכול מסוימים, כגון סרטן לבלב (PCA) ודלקת לבלב כרוני (CP). כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסימולציה של neuroplasticity לבלב תחת במבחנה תנאי שימוש בגרעיני יילוד הגבי חולדה שורש (DRG) ומקלעת myenteric הנוירונים (MP). גישה הכפולה נוירון זה מאפשר לא רק ניטור של שני neuroplasticity האיברים פנימיים וחיצוניים, אלא גם מהווה כלי רב ערך כדי להעריך עצבי ומורפולוגיה ואלקטרופיזיולוגיה גליה. יתר על כן, היא מאפשרת אפנון תפקודי של תוכן microenvironmental סיפק ללימוד Impacלא על neuroplasticity. ברגע שהוקם, assay neuroplasticity הנוכחי נושא את הפוטנציאל להיות ישים לחקר neuroplasticity בכל איבר במערכת העיכול.
מבוא
שינויים במורפולוגיה במערכת העיכול (GI) עצב וצפיפות תפסו את תשומת הלב של גסטרואנטרולוגים ופתולוגים במשך זמן רב, אבל הרלוונטיות שלהם להפתופיזיולוגיה של מחלות במערכת העיכול אינן ידועות 1-3. ואכן, כמה הפרעות במערכת העיכול נפוצות מאוד כגון דלקת קיבה, ושט ריפלוקס, דלקת המעי הגס, דלקת, ודלקת תוספתן קשורות עם צפיפות עצבוב מוגברת באזורי רקמה דלקתיים 1. עם זאת, לא שמו לב אמיתי עד כה שילם למנגנונים והמשמעות של neuroplasticity במערכת העיכול. האם עצבים במערכת העיכול מורפולוגית שינו שונים מעצבים במערכת העיכול נורמלים, כלומר המצב הנורמלי של מערכת העצבים enteric, במונחים של תפקידם? מהן ההשלכות של תוכן נוירופפטידים / הנוירוטרנסמיטר שינו בעצבי enteric פלסטיק? האם neuroplasticity ההיקפי תמיד כרוך איתות שינתה למערכת העצבים המרכזית? ואיפה התחזיות של extri פלסטיק המרכזיותמסלולים עצביים במערכת העיכול NSIC? סדרה ארוכה של שאלות מפתח כגון בקלות יכולה להיות שנוצרה כשמסתכלת על המחסור בידע שלנו על ההיבטים הפונקציונליים של neuroplasticity במערכת העיכול.
המחקר של neuroplasticity GI ברמה תפקודית דורש מודלים ניסיוניים בתוקף, לשחזור ועדיין ישימים בקלות. בעידן של הגדלת פופולריות וקבלה של מודלים מהונדסים גנטי מותנים עכבר (GECoMM), כגון בהגדרות vivo לשאת את הפוטנציאל להבהיר היבטים ידועים קודם לכן של neuroplasticity GI בצורה מציאותית 1. עם זאת, העיצוב והייצור של GECoMM נשאר יקרים, עתיר עבודה, ובמיוחד בזמן אכילה. יתר על כן, הם דורשים בחירה מראש של היעד להיות מווסת על תנאי בעכבר עבר שינוי הגנטי (ביטוי יתר למשל מהונדס של גורם גדילה העצבי / NGF בתאי האפיתל enteric). לפיכך, עבור desIGN של GECoMM מוצלח, חוקרים צריכים כמה אינדיקטורים (למשל נתוני ניסוי קודמים) של יעד כדאי, כלומר, שהמולקולה של עניין (כאן NGF) יכולה לפחות להיות צפויה להפעיל לכמה תופעות רלוונטיות מבחינה ביולוגית על עצבים במערכת העיכול.
בקלות ניתן לגזור אינדיקטורים כגון מנאותים במודלים של מבחנה שבה תת תא מבודד מmicroenvironment המורכב של מערכת vivo בניתן cocultured סלקטיבי באופן heterotypic 4-7. האפנון של מטרות מולקולריות בהגדרת תרבות heterotypic כזה הוא בממוצע מבחינה טכנית מסורבל פחות, מהיר יותר, ולכן יכול לסייע בprefiltering מטרות כדאיות עבור אימות במחקרי vivo.
לאחרונה, הצגנו במבחנה assay neuroplasticity שנועד לדמות את הצפיפות המוגברת עצבית והיפרטרופיה של ne intrapancreaticrves בסרטן לבלב אנושי (PCA) ודלקת לבלב כרוני רקמות (CP). הנה, הנוירונים הנגזרים מגרעיני יילוד הגבי חולדה שורש (DRG) או מקלעת myenteric (MP) נחשפו לתמציות רקמה מPCA כריתה בניתוח או CP דגימות רקמות והשוואה לאלה בתרבית בלבלב אנושי נורמלי (NP) תמציות רקמה 5. במקום תמציות רקמה, אפשר גם להשתמש supernatants שורת התאים לחקור את ההשפעה של סוגי תאים שנבחרו על neuroplasticity. בשילוב עם מדידת morphometric סטנדרטית, assay neuroplasticity הציג מאפשר הערכה תקפה ושחזור של פלסטיות עצבית בתגובה לmicroenvironments לבלב שונה. במיוחד, היא מאפשרת הסימולציה של 1) neuroplasticity מורפולוגי, כלומר השינויים בתולדת neurite, הסתעפות דפוס וגודל עצבי, ו2) neuroplasticity הפונקציונלי, כלומר שינויים ברגישות של תאי עצב היקפיים. יתר על כן, לא רק פריפריה (כלומר Enteric), אלא גם מרכזי (כגון: DRG או בעמוד השדרה צו שני) יכולים להיכלל הנוירונים בassay ההווה כדי לבחון את התגובה מורפולוגיים ופונקציונלית שלהם לתכני רקמות במערכת העיכול שונים. בוידאו של מורה בהווה, אנחנו מדגימים את הפרוטוקול הטכני לביצוע assay זה ולדון ביתרונות והחסרונות שלה. יתר על כן, אנו מפנים את תשומת לב לתחולתו של הרעיון הבסיסי של assay זה ללימוד neuroplasticity בכל איבר במערכת העיכול.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הליכי הניסוי בבעלי החיים בפרוטוקול לעקוב אחר הנחיות הטיפול בבעלי החיים של Technische Universität München, גרמניה.
1. מדיה / חלץ ההכנה
- המגון רקמה
האיכות של הומוגניזציה הרקמה היא קריטית לאיתור הבא של שינויי neuroplastic בנוירונים בתרבית. הנה, homogenizer מומלץ המאפשר ניתוק רקמות ללא עלייה משמעותית בטמפרטורת הרקמות.- העברת 5 מ"מ x 5 מ"מ x 5 מ"מ קוביות של רקמת לבלב ישירות מ-80 מעלות צלזיוס לחנקן נוזלי ומקום בשלב מוצק בhomogenator הרקמות. Homogenator האידיאלי יהיה לנתק את הרקמה מספיק מהר, מבלי שמאפשרים לו defreeze.
- מייד לאחר ניתוק, resuspend homogenate המוצק, כמו האבקה ב300-500 μl של פוספט שנאגרו מלוח 0.1x (PBS). הנה, לא להשתמש בכל מאגר תמוגה (כגון ריפה) שכן דבר עלול lyse הנוירונים.
- צנטריפוגה homogenates לפחות 15 דקות במהירות מקסימלית של צנטריפוגות הספסל (למשל 21,130 XG). לאסוף את supernatant ברור המייצג את תמצית הרקמות.
- supernatants שורת התאים
- בואו התאים של עניין להגיע לפחות 70-80 מפגש% במדיום גידול רגיל.
- בדרך כלל, תקשורת אלה מכיל מרכיבי סרום ויכולה להפעיל את השפעה בלתי נשלטת על צמיחה עצבית. לכן, לאחר שהגיע לצפיפות התאים הרצוי, לשטוף התאים שלך לפחות 3x עם הכיתה תרבית תאי PBS ולמקם אותם במדיום סרום ללא (SFM) עד 48 שעה.
הערה: הנה, קח בחשבון שחלק מתאים (כמו תאי stellate לבלב) ייתכן שיהיו צורך בסרום בתקשורת הצמיחה שלהם על מנת לשמור על המצב הרגיל שלהם ומבנה. במקרים כאלה, לבצע דילולים סידוריים סרום במדיום של התא של עניין כדי למצוא התוכן הנמוך ביותר אפשרי הסרום הדרוש לfunctio תא ללא פגעn. - למדוד את ריכוז החלבון של homogenate הרקמה או supernatants תא באמצעות assay החלבון ברדפורד. בעוד ערכים אלה משתנים בהתאם לסוג הרקמות ותאים, לתמציות רקמת לבלב, הייתי מצפה טווח ריכוז בין 5-12 מיקרוגרם / μl, ולsupernatants שורת תאים בין 3-8 מיקרוגרם / μl.
2. תמציות Aliquot וSupernatants הסלולרי
בהתאם לריכוז לשימוש בassay, הריכוז הסופי של התמצית או supernatant במדיום העצבי צריך להיות 100 מיקרוגרם / מיליליטר 5,8.
הערה: לקבלת assay עם הנוירונים גדל ב500 בינוני μl בבאר כל צלחת 24 גם, צריך 50 מיקרוגרם של חלבון מתמצית או supernatant לכל טוב. בריכוז תמצית אופייני של כ 10 מיקרוגרם / μl, אחד היה צריך 5 μl של התמצית / supernatant לכל אחד. בכל settinגרם שבוצע כשלושה עותקים, זה היה מתאימות ל15 μl של התמצית / supernatant. לסוגים שונים של רקמות או תאים, לבצע דילולים סדרתי של התמצית הסופית או ריכוז supernatant ולהשוות את השפעות נוירוטרופי שנצפו בין ריכוזי התמצית / supernatant השונים.
3. בידוד של נוירונים
ברגע שאוסף התמצית / supernatant הוא סיים, להמשיך עם בידוד של נוירונים.
- לנוירונים DRG, לאסוף את צוואר הרחם להמותני DRG של חולדות שזה עתה נולדו בין יום לידה (P) 2-12 לאחר (איור 1 א) עריפת הראש ונתיחת stereomicroscopic של DRG. על מנת לקבל נוירונים DRG מספיק לצלחת 24 גם, לאסוף את כל צוואר הרחם להמותני DRG של עכברוש יילוד אחד (שווה 52 DRG) לכל צלחת.
- גזור מהפריפריה (עצבי) ותחזיות מרכזיות (שורשים) של DRG באמצעות microscissors.
עוזב את התחזיות במקום פוגע בטחינה דקה ומגביר tהוא זיהום סיכון של תרבות על ידי fibroblasts.
- גזור מהפריפריה (עצבי) ותחזיות מרכזיות (שורשים) של DRG באמצעות microscissors.
- לנוירונים מגה פיקסל, לחתוך את לפדר מהמעי הדק וידני ולפשוט בזהירות את שכבת seromuscular של המעי דק (לפרוטוקול מפורט על בידוד MP, עיין שפר et al. 9, איור 1). לחבר פרלמנט, לאסוף מקלעת משתי חולדות ל24 גם צלחת.
הערה: נסה להיות עדין ככל האפשר על מנת למנוע קרעים בשכבת seromuscular שכן הם פוגעים הפרדה המוצלחת שלה מהמעי הדק. - לאסוף את DRG ושכבת seromuscular במדיום חיוני מינימאלי קר כקרח (MEM) מסופק עם גנטמיצין (20mg במדיום 500ml) וmetronidazol (2.5 מ"ג ב500 בינוני מיליליטר).
- בעקבות אוסף של DRG, דגירתם בתמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) מסופקת עם סוג collagenase השני של 20-30 דקות. לבידוד MP, דגירה בסוג collagenase בין 1-3 HR, בהתאם לגילושל בעל החיים (איור 1 ג).
- לחבר פרלמנט, לאסוף את חלקי MP דמוי רשת תחת סטראו ולהעביר לממ קר כקרח.
- אז triturate DRG ו MP באמצעות מזרקים עם ירידה בקוטר.
הערה: טחינה דקה מוגזמת יכולה להרוס את תאי העצב, אבל פחות תאי גליה. - פעם אחת הבינוני מכיל DRG או MP הפכה מעונן, צנטריפוגה את ההשעיה ב93.9 XG במשך 5 דקות, להשליך בינוני ו resuspend במדיום Neurobasal (בתוספת 100 U / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, L-גלוטמין 0.5mm ו -2% ב-27).
- לספור את המספר הכולל של תאים (כלומר תאי עצב וגליה) באמצעות hemocytometer.
שים לב: מספר התאים הדרושים תלוי בפרמטר המדידה. לכימות של צפיפות neurite, צריך תרבויות צפופות יותר ולכן מספר גדול יותר של תאים מאשר למדידת תולדת neurite, גודל perikaryonalוהסתעפות דפוס של נוירונים בודדים. עבור מדידות צפיפות neurite, השתמש למשל 10,000 תאים (תא עצב + גליה) / טוב או 1,500 תאי עצב / כן. לmorphometry על נוירונים בודדים, trypsination קצר (באורך דקה-1) של תאים וזריעה של 2,500 תאים / טוב או 400 נוירונים / גם מומלץ. התשואה האופיינית לתאים המתקבלים מעכברוש אחד לא בסביבה 300,000-500,000 תאים. - זרעי התאים ביום 13 בcoverslips מ"מ אשר היו מצופים בלילה שלפני ולמעלה בארות עם מדיום Neurobasal (בתוספת 100 U / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, 0.5 מ"מ L-גלוטמין ו -2% ב-27) (איור 1D).
הערה: השימוש בפולי-D-ליזין (40 מ"ג / מ 2) או ornithine-ומכסה מחליק (1 מ"ג / מיליליטר כל אחד) מצופה מצופה laminin. תאים לצרף לפולי-D-ליזין מאוד מהר, ובכך הופכים אותו מתאים לניסויים שבהם יש צורך בתאים רבים (מדידות צפיפות neurite כלומר). קובץ מצורף לlaminin הוא בחלק כללימה חלש יותר, אבל laminin הוא אמרגן חזק של תולדת neurite. לכן, מדידות על הסתעפות עצבית ואורך neurite, מעדיף ornithine / laminin ציפוי. - אפשר התאים לצרף לבארות לילה. ביום למחרת, להכין את מדיה בתוספת התמצית (בריכוז התמצית / supernatant סופי של 100 מיקרוגרם / מיליליטר).
- לשאוב את מדיום הזריעה, ולבצע שטיפה אופציונלית, מאוד עדינה עם PBS, ולאחר מכן פיפטה התמצית / מדיה בתוספת supernatant (איור 1E) באיטיות.
- בואו התאים לגדול במשך 48 שעות. לשאוב את התקשורת ולתקן paraformaldehyde 4% לimmunostaining (איור 1F).
- לבצע מכתים כפול immunofluorescence באמצעות נוירון ספציפי (למשל בטא III-טובולין) וגליה ספציפית (לדוגמא: גליה fibriallary חלבון חומצי / GFAP) סמנים (איור 1G).
- לmorphometry, השתמש מיקרוסקופ אור הפוכה מצוידת במצלמת CCD בwi שילובה תוכנה אוטומטית המאפשרת מדידה של צפיפות neurite (ראה טבלה).
- צפיפות neurite של תרבויות עצביות נמדדת על 4-5 photomicrographs הנציג ב200x הגדלה מ4 אזורים שונים של הצמיחה הצפופה ביותר על כל coverslip ידי שכיסה 50 מיקרומטר x 50 רשת מיקרומטר וסופר את צפיפות סיבים לכל מ"ר שנמדדה בסיבים מצטלבים. התוצאה neurite, אומר מספר סניפים לכל נוירון, אורך הסניף הממוצע וגודל perikaryonal ניתן למדוד מ30 נוירונים בודדים שנבחרו באקראי מכל coverslip על ידי סימון neurites וperikarya (איור 1H).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
neuroplasticity מורפולוגיים
בטווח הגילים שצוין של חולדות שזה עתה נולדו (P2-12) וצפיפות הזריעה, הנוירונים MP וDRG כבר לבנות רשתות עצביות צפופות לאחר 48 שעה (איור 2 א). השוואה של צפיפות neurite בין הנוירונים טיפחו בPCA, CP, ותמציות NP מגלה צפיפות גדולה יותר neurite של נוירונים DRG בPCA או תמציות CP מאשר בתמציות NP (איור 2 א) 5. אנחנו בעיקר מעדיפים נוירונים MP עב...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול הנוכחי נועד כדי להמחיש את המתודולוגיה מאחורי assay neuroplasticity הלבלב במבחנה אשר פותח לאחרונה על ידי הקבוצה שלנו כדי ללמוד את המכניזם של neuroplasticity בPCA וCP 5. הפרוטוקול כרוך בהליך של שלושה ימים אשר יכול בקלות להיות מיושם ברגע שהשחקן צבר מספיק ניסיון בבידוד והתרבות של נוירונים DRG וחבר הפרלמנט. יתר על כן, הוא מייצג כלי רב ערך ללימוד התגובה הקשורה של enteric וגליה קשור-DRG לרכיבי microenvironmental לבלב.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש המחברים אין אינטרסים מתחרים ואין גילויים פיננסיים.
תודות
כל המחברים תרמו להקמת והאימות של assay הציג ולטיוטה של כתב היד.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פולי-D-ליזין הידרוברומיד | סיגמא-אולדריץ' | P1149 | |
| אורניתין/למינין | סיגמא-אולדריץ' | P2533/L4544 | |
| 13 מ"מ כיסויים | Merck | לשימוש בצלחות 24 בארות | |
| Dismembranator S | Sartorius | ||
| Anti-Beta-III-tubulin נוגדן | Millipore | MAB1637 | 1:200 ריכוז |
| נוגדן נגד GFAP | DAKO | M0761 | ריכוז 1:400 |
| מאגר RIPA + מעכב | כל ספק | ||
| מדיום נוירובזאלי | Gibco / מדעי החיים | 21103-049 | |
| תוסף B-27 | Gibco / מדעי החיים | 17504044 | ידוע כי האיכות של B-27 תלויה במספר האצווה |
| גנטמיצין/מטרונידזול | כל ספק | ||
| מדיום חיוני מינימלי | Gibco / מדעי החיים | 31095-029 | |
| Hank' s תמיסת מלח מאוזנת (HBSS) | Gibco/Life Sciences | 24020133 | משפר את פעילות הקולגנאז כאשר הוא מכיל Ca/Mg |
| קולגנאז מסוג II | וורת'ינגטון ביוכימי | CLS-2 | השג מנות עם פעילות של לפחות 200 יחידות / מ"ג |
| טריפסין-EDTA 0.25% | ג'יבקו/מדעי החיים | 25200056 | |
| 4% פרפורמלדהיד | כל ספק | ||
| אנליSIS docu תוכנה | אולימפוס |
מקורות
- Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity. Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).
- Vasina, V., et al. Enteric neuroplasticity evoked by inflammation. Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).
- Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation. Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).
- Demir, I. E., et al. Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).
- Demir, I. E., et al. The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity. Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).
- Schafer, K. H., Mestres, P. The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally. Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).
- Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system. Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).
- Liebl, F., et al. The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer. Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).
- Schäfer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract. Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).
- Ceyhan, G. O., et al. Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).
- Demir, I. E., et al. Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).
- Joseph, N. M., et al. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
