מאמר שיטה

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של

30.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51058

⸱

20 בינואר 2014

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University Medical Center

במאמר זה

סיכום

שיטות לבידוד והכנת דגימות דרוזופילה אשכים (לחיות וקבוע) להדמיה על ידי שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מתוארים במסמך זה.

תקציר

תסיסנית היא מערכת מודל רבת עוצמה שכבר בשימוש נרחב על מנת להבהיר מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים. לדוגמא, מחקרים של שתי נשים וקווים נבט זכר של דרוזופילה תרמו רב להבנה הנוכחית של מיוזה כמו גם ביולוגיה של תאי גזע. פרוטוקולים מצוינים זמינים בספרות לבידוד וההדמיה של השחלות ואשכים דרוזופילה 3-12. בזאת, שיטות לנתיחה והכנת האשכים דרוזופילה ניתוח מיקרוסקופי מתוארות בהפגנת וידאו נלווית. פרוטוקול לבידוד אשכים מהבטן של זכרים בוגרים והכנת שקופיות של רקמת חיה לניתוח על ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד, כמו גם פרוטוקול לתיקון וimmunostaining אשכים לניתוח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי מוצגים. ניתן ליישם את הטכניקות הללו באפיון של מוטציות דרוזופילה כי תערוכת דefects בתאי זרע, כמו גם בהדמיה של מגויר subcellular של חלבונים.

מבוא

האשכים דרוזופילה הם מערכת מודל אידיאלית לחקר תהליכים ביולוגיים רבים, כולל רגולציה של תאי גזע, מיוזה, ופיתוח זרע 13-18. Spermatocytes וצירי meiotic שלהם הם גדולים, ולכן נוחים לניתוח ציטולוגית, ומחסומי מחזור התא רגועים במהלך spermatogenesis להקל על המחקר של מוטציות בגנים מחזור התא. ניתן להבחין בסוגים שונים של תאים בהתקדמות הורה לאורכו של האשכים, ושיבוש כלשהו בתאי זרע יכול להוביל לשינויים בהסדר הכולל הזה. תכונות אלה בשילוב עם כלים גנטיים דרוזופילה הקלו ניתוח מוטאציות של תאי הזרע 21-23.

השלבים של spermatogenesis דרוזופילה כבר מוגדרים היטב. תאים בתאי מין שמתפתחים באופן סינכרוני בתוך ציסטות התקדמות רציפות בשלבים של תאי זרע לאורכו של האשך. במהלך בוה המיטוטי וחטיבות meiotic של תאי נבט הזכר, cytokinesis מתרחש באופן חלקי כך שתאי הבת להישאר מחוברים על ידי גשרי cytoplasmic המכונים תעלות טבעת (איור 1). קצה הקודקוד של האשך מכיל אוכלוסייה של תאי גזע בתאי מין שמעוררת תאי spermatogonial, אשר עוברים ארבע חטיבות המיטוטי עם cytokinesis שלם כדי לייצר ציסטות 16 תאים של spermatocytes העיקרי. לאחר שלב S premeiotic, spermatocytes העיקרי להיכנס G2, תקופת צמיחה ממושכת של ~ 90 שעות שבמהלכו עליות נפח סלולארי ~ פי 25. התקדמות דרכי מיוזה ומיוזה השנייה תוצאות בהיווצרות ציסטות 32 תא של spermatocytes המשני וציסטות 64 תא של spermatids הפלואידים, בהתאמה. Spermatids לא בשלה, העגול עובר שיפוץ נרחב סלולארי כדי ליצור זרע בוגרים. תאים שלאחר meiotic, בפרט הצרורות של מתארך וspermatids הבוגר, תופסים הרבה הנפח של האשך.

Tהוא הובלה מוצלחת של זרע פונקציונלי לזבובים נשיים דורשת תיאום בין החלקים השונים של מערכת הרבייה הגברית, שמורכבת מכמה מבני זיווג (האשכים, שלפוחית ​​זרע ובלוטות עזר) ותעלת שופכה אחד (איור 2). זרע מיוצר בתוך האשכים ומאוחסן בתוך שלפוחית ​​הזרע עד הזדווגות 24. בלוטות האבזר מכילות תאי הפרשה המייצרים את נוזל זרע. הזרע נודד משלפוחית ​​הזרע מעורבב עם נוזל זרע בתוך צינור השופכה, אשר מחובר לשתי שלפוחית ​​הזרע ובלוטות האבזר. תערובת זו של זרע ונוזל זרע נשאבת סופו של דבר מחוץ לזכר לתוך הנרתיק של הנקבה לעוף בנורת השפיכה ממוקמת בקצה האחורי של 25 בטן הגברית. חלבונים בתוך נוזל הזרע הם חיוניים לאחסון ממושך של זרע בתוך איברים מתמחים המכונים spermathecae בנציגמערכת roductive של נקבות דרוזופילה 26.

שיטות מצוינות לבידודה של אשכים דרוזופילה ויזואליזציה של תאים בשלבים שונים של תאי זרע זמינות בספרות המדעית 3-12. אנחנו בזאת להוסיף לגוף זה של ידע על ידי הצגת דוגמאות של פרוטוקולים אלה עם הפגנת וידאו נלווית. הפרוטוקול להכנת דגימות אשכים חיים למיקרוסקופ שלב בניגוד מבוסס על שיטה שתוארה לעיל 27. הפרוטוקול לקיבעון פורמלדהיד וimmunostaining של אשכים מבוססים גם על שיטה שתוארה לעיל 28. הגישות המתוארות כאן נעשו שימוש במחקרים רבים של תאי זרע דרוזופילה (לדוגמא, על מנת להעריך את התפקידים של dynein, מנוע microtubule מינוס מכוון סופו של דבר בתאי זרע דרוזופילה).

בנוסף לפרוטוקולים הבסיסיים, הצעות ניתנות לvaryinגרם לנתיחה על מנת להעשיר לspermatogonia, spermatocytes, או זרע בוגרים. שיטות שונות לעיבוד האשכים כך שציסטות או יישארו ללא שינוי או הם שיבשו במידת הצורך מתוארים. יתרון בשימוש באשכי דרוזופילה כמערכת מודל הוא כי בהשוואה לביציות דרוזופילה ועוברים, נוגדנים וצבעים יכולים בקלות לחדור לתאים הבאים פיזורם מהאשכים, ושלבי כביסה פחות נדרשים, ולכן ניתן לבצע פרוטוקולים באופן יחסי זמן קצר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. Dissection אשכים

  1. הרדימי זבובים בבקבוק או בקבוקון באמצעות זרם של CO 2 ולהעביר למשטח לטוס.
  2. מיין זבובים תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות מכחול קטן, ולאסוף מספר מתאים (תלוי בניסוי) של הזכרים דרוזופילה של גנוטיפים הרצויים. זכרים צעירים (בן 0-2 ימים) הם אידיאליים לבחינת תאים בשלבים המוקדמים של תאי זרע (למשל spermatogonia, spermatocytes, וspermatids פוסט meiotic המוקדם), ואילו גברים מעט מבוגרים (בן 2-5 ימים) הם אידיאליים לבחינת תאים בשלבים הסופיים של תאי זרע (בפרט, להבשיל זרע).
  3. שימוש במלקחיים כדי להסיר את הכנפיים מלטוס (כדי למנוע מהזבובים צפים בנוזל בזמן נתיחה).
  4. להוסיף ~ 500 מיליליטר של פוספט שנאגרו מלוח (130 mM NaCl, 7 מ"מ Na 2 HPO 4, 3 מ"מ לאא 2 PO 4; PBS) בירידה לצלחת לנתיחה מצופה סיליקון עלרקע שחור. תמיסות מימיות אחרות שימשו בהצלחה לאשכים לנתיחה 3.
  5. נקודת המלקחיים לכיוון הקדמי של הזבוב, לתפוס אותו על ידי בית החזה, ולטבול אותו בטיפת PBS. במהלך הצגה מבעד למיקרוסקופ לנתח, להשתמש בזוג נוסף של מלקחיים לתפוס ולמשוך את אברי המין החיצוניים (מבנה בצבע חום כהה הממוקם בקצה האחורי של בטן הגחון) בדיעבד עד שהוא מתנתק מהבטן. ברוב המקרים, האשכים, שלפוחית ​​זרע ובלוטת אבזר יוסרו מהבטן יחד עם אברי המין החיצוניים, אם לא, להכניס זוג אחד של מלקחיים לתוך הבטן ולהקניט את האשכים.
  6. אשכים נפרדים מבלוטת אבזר ואברי מין חיצוני באמצעות שני זוגות מלקחיים בירידת PBS (איור 2). אשכים wild-type בקלות להבחין בין רקמות שכנות הלבנות לפי צבעם הצהוב. פנה מייד לצעד 2.
  7. כדי לבודד אשכים מזכרי pharate (i .. הדואר הסגור בתוך המקרה גלמי), צריך קודם לבצע צעד נוסף שכרוך בהסרה לטוס מהמקרה גלמי; שלב זה כבר תואר בעבר במקום אחר ביום 31. להמשיך עם נתיחה כלאשכים למבוגרים מתחילים בצעד 1.2.
  8. כדי לבודד אשכים מזכרי זחל, לבצע שינוי של פרוטוקול לבידוד השחלות זחל דרוזופילה 32. בקצרה, זחלי זכר ניתן להבחין בין זחלים נשיים על ידי הנוכחות של זוג המבנים גדולים, ברורים, סגלגלים (אשכים זחל) משובצים בשליש האחורי של השומן בגוף. כדי לבודד אשכים זחל, באופן חלקי לפשוט את העור לפתוח את זחל הזכר לבודד את האשכים ושומן הגוף סביב מהבטן כפי שתואר עבור הבידוד של השחלות זחל. פנה מייד לשלב 2 של הפרוטוקול המתואר במסמך זה; האשכים יכולים להיות מאוחר יותר הוסרו מהגוף השומן רק לפני ההרכבה (שלבים 2.3 או 3.14) כפי שתואר לשחלות 32.

ss = "jove_title"> 2. לדוגמא הכנה והדמית חיה

  1. השתמש זוג מלקחיים למקום בעדינות 2-3 זוגות של אשכים בירידה של 4-5 מיליליטר של PBS על להחליק את מכסה זכוכית מרובע. שים לב שהיחס בין מספר אשכים לPBS עוצמת שמע עשוי צריך להיות מותאם: יותר מדי נוזלים ימנעו תאים מלהתפשט כראוי כאשר נמעכו, ואילו נוזל מעט מדי יגרום לתאים להתפוצץ כאשר מעוך. אופציונאלי: כיסוי siliconized שימוש מחליק כדי למזער את ההיצמדות של רקמות כדי לכסות להחליק בשלב 3.2.
  2. השתמש זוג המלקחיים לקרוע פתוח כל אשך בעמדה מתאימה כדי למקסם את נוכחותם של סוגי התאים הרצויים בתאי מין בהכנה (שים לב שהתוכן של האשך תהיה בעיקר יציאה מהאזור הקרוע לשקופית במעיכה צעד.) כדי להעשיר לspermatogonia וspermatocytes, לקרוע לפתוח את האשך סמוך לקצה הקודקוד שלה (ברמה 1, איור 2). כדי להעשיר לspermatocytes וspermatids, דמעה לפתוח את האשך בקופהition מעט בסיס לרמת 1 (רמה 2, איור 2). כדי להעשיר את תאים בתאי מין בוגרים יותר, קורע את האשך קרוב יותר למקום שבי העקמומיות מתחילה (רמה 3, תרשים 2B).
  3. מניח בעדינות שקופית מיקרוסקופ זכוכית על להחליק את המכסה למחוץ את האשכים; לא להפעיל לחץ באופן ידני כמו המשקל של להחליק את המכסה בלבד מספיק כדי להשיג מדגם מעוך כמו שצריך. נסה להימנע מלכידת בועות אוויר. אופציונאלי: מיקרוסקופ השתמש פולי-L-ליזין מצופה מחליק לקדם היצמדות של רקמות כדי להחליק בשלב 3.2.
  4. להשתמש בתכשיר באופן מיידי (באופן אידיאלי בתוך 15 דקות של הכנה) להתבונן תאי חיים על ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד; לזבובים מהונדסים עם ביטוי של חלבונים מתויגים fluorescently באשכים, ניתן לבדוק תאי חיים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשלב זה. לחלופין, להמשיך עם קיבעון ומכתים נוגדן (פרוטוקול 3).
  5. בעדינות פתיל את נוזלי עודפים מתחת coverslip באמצעות ניקוי wipe לאפשר השטחת ההכנה עד תאי הנבט הם בבירור בפוקוס.

3. פורמלדהיד קיבוע ונוגדן מכתים

  1. הצמד להקפיא כל שקופית המכילה אשכים מעוכים (מפרוטוקול 2) באמצעות מלקחי מתכת כדי לטבול אותו בקצרה בחנקן נוזלי (עד חנקן נוזלי מפסיק מבעבע).
  2. הסר את תלוש לכסות באופן מיידי באמצעות סכין גילוח.
  3. השתמש במלקחי מתכת כדי להעביר שקופיות למדף זכוכית שקופית prechilled מלא באתנול 95% קרים כקרח (הכיתה spectrophotometric, נטול מתנול). חנות ב -20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  4. השתמש במלקחי מתכת כדי להעביר שקופיות למתלת שקופיות זכוכית מלאות בפורמלין 4% ב-PBS בתוספת 0.1% טריטון X-100 (PBS-T). לאחסן בטמפרטורת חדר למשך 7 דקות.
  5. השתמש במלקחי מתכת כדי להעביר שקופיות למתלת שקופיות זכוכית מלאות PBS. לשטוף שקופיות PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. חזור על 1x. לבצע את כל שוטף על ידי השלכת פתרון במעמד שקופיות זכוכית ( כלומר. על ידי שפיכתו החוצה) והחלפה עם פתרון טרי.
  6. מחק את PBS ולטבול את השקופיות ב-PBS-T ל30 דקות בטמפרטורת חדר כדי permeabilize קרום תא.
  7. לשטוף שקופיות PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. חזור על 2x.
  8. חסימת צעד (לא חובה): לטבול את השקופיות ב PBS בתוספת BSA 1% ל45 דקות בטמפרטורת חדר.
  9. השתמש בעט מחסום הידרופובי לצייר עיגול בשקופית סביב רקמה מעוכה (נראית בקלות בעין) על מנת להגביל את פתרונות הנוגדנים (הוסיפו בצעדי 3.9 ו3.11). הרקמות צריכה להישמר לחה בכל העת בעת ביצוע immunostaining.
  10. הוספת 30-40 מיליליטר של נוגדן ראשוני (בדילול מלא PBS-T, 1:400 ל1:50, בהתאם לנוגדנים) לרקמה בתוך המעגל. אם החסימה בוצעה, לדלל נוגדן ראשוני ב-PBS-T בתוספת BSA 1%. נוגדן אנטי גמא טובולין (לצביעת centrosomes באיור 4) היה מדולל 1:100. דגירה בתא לח, כהה (קופסא פלסטיק סגורה לדוגמא.במגבות לחות נייר) עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ° C.
  11. לשטוף שקופיות PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר 3x. אם החסימה בוצעה, לשטוף פעמים PBS-T ופעם אחת ב-PBS (5 דקות בטמפרטורת חדר כל אחד).
  12. הוספת 30-40 מיליליטר של נוגדן fluorophore מצומדות המשני (בדילול 1:400 ב-PBS) לרקמות דגירה בחושך במשך 1-2 שעות בטמפרטורת חדר.
  13. לשטוף שקופיות PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. חזור על 2x.
  14. הוספת 30-40 מיליליטר של תמיסת DAPI (0.2 מ"ג / מיליליטר PBS) לרקמה בתוך המעגל.
  15. מניח בעדינות להחליק את מכסה זכוכית על הרקמות, לטפל כדי למנוע לכידת בועות אוויר. אם בועות האוויר אמורות להופיע, לנוע בזהירות סביב להחליק את המכסה מבלי להרוס את הקישואים עד שהבועות לברוח מן הצדדים של להחליק את המכסה.
  16. השתמש ניקוי לנגב למחוק DAPI העודף מהקצוות של השקופיות.
  17. לאטום להחליק את המכסה לשקופית באמצעות לק ברור.
  18. להשתמש בתכשיר זהבתוך 3-4 שעות הבאות כדי להציג תאי immunostained על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עבור אחסון לטווח ארוך של שקופיות (עד לפחות כמה שבועות), יש להשתמש באמצעי תקשורת קשה הר מבוסס גליצרול עם DAPI, ושקופיות חנות ב -20 ˚ C.
  19. לחלופין, לתקן את הדגימות במתנול במקום פורמלדהיד (תלוי באנטיגן). לאחר שסיים את הפרוטוקול כולו דרך שלב 3.2, לטבול את השקופיות של אשכים מעוכים במתנול 10 דקות ב -20 מעלות צלזיוס ולהמשיך בשלב 3.5 ואילך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

דוגמא של זוג גזור כהלכה של איברי הרבייה של גבר דרוזופילה מוצגת באיור 2 א. אשכים הוסרו מהבטן של זבוב זכר הבוגר מצורפים בדרך כלל לצינור השופכה (חום, איור 2 א ') וזוג בלוטות אבזר (הירוק, איור 2 א') באמצעות זוג שלפוחית ​​זרע (הכחול, איור 2 א ') . כדי להפריד את האשכים מרוב הרקמות הנלוות סומטיים, צינור השופכה ואת בלוטות האבזר צריך להיות מנותק וזנוח כזה שרק זוג האשכים ושלפוחיות הזרע יישארו (2...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

למרות שהאשכים של זבובים פראי מסוג ניתן לזהות בקלות בשל צבעם הצהוב (בניגוד לרקמות שכנות הלבנות), האשכים של זבובים שעברו מוטציה לבנים הם לבנים ולכן לעתים ניתן להתבלבל עם הבטן. זנים מהונדסים ביותר, אשר בדרך כלל ברקע לבן, יש גם אשכים לבנים בגלל גן המיני לבן שנמצא בP-אלמנטים אינו מקדם הצטברות הפיגמנט באשכים. כאשר לא ניתן להבחין אשכים דרוזופילה לפי צבע, תכונות קלות לזיהוי אחרים כוללות דפוס שלהם הספירלה והתרחשות בזוגות 12. שים לב שח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

המחברים מבקשים להודות למייקל אנדרסון להקמה במעבדה לי שיטות המקובלות אלה לחקר תאי זרע עם ייעוץ מקצועי מקארן חאלס. ה 'עוד וי' אקיאמה-Oda סיפקו בנדיבות γ-טובולין-GFP לטוס מניות. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R01 לLAL (GM074044).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
SylgardWorld Precision InstrumentsSYLG184אלסטומר סיליקון דו-חלקי להכנת צלחת דיסקציה מצופה סיליקון מצלחת פטרי קימקס
עט PAP פישרסיינטיפיקNC9888126טד פלה #22309
מגן ציפורניים שקוףWet n Wild7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent עם DAPILife TechnologiesP36931
נוגדן נגד גמא-טובולין לעכבר (שיבוט GTU-88)Sigma-AldrichT6557
Cy3-AffiniPure עז אנטי-עכבר IgG Jackson ImmunoResearch115-165-003
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
אתנולפישר סיינטיפיקAC61511-0040
מתנולפישר סיינטיפיקA412-4
16% פורמלדהידתרמו פישר סיינטיפיק28908
סיגמקוטסיגמא-אולדריץ'SL2השתמש בהתאם להוראות היצרן לסיליקון תלושי כיסוי
DAPISigma-AldrichD-95420.5 מ"ג/מ"ל ב-75% אתנול; אחסן ב-20 מעלות; C
NaClמוצרי מחקר אינטרנשיונל קורפS23020
Na2HPO4Sigma-AldrichS9763
NaH2PO4Sigma-AldrichS0751
מגבי משימות עדינים KimwipesFisher ScientificS47299
BSAResearch Products International Corp.A30075בדרגת ביולוגיה מולקולרית
, מכסה בורגמדעי מיקרוסקופ אלקטרונים70315
שקופיות מיקרוסקופ חלביות בודדותקורנינג2948-75X25
שקופיות מיקרוסקופ מצופה פולי-L-ליזין Polysciences, Inc.22247-1אופציונלי (להחלפת שקופיות מיקרוסקופ לא מטופלות)
זכוכית כיסוי מרובעקורנינג2865-22
סכיני גילוחפישר סיינטיפיק12-640
צלחת פטרי קימקספישר סיינטיפיקS31473קימבל #23060 10015 מלקחיים EMD
דומונט52100-51Sדפוס 5 סטריאוסקופ
INOX Stemi 2000-CSCarl Zeiss
Eclipse 80iNikon
Plan-Fluor 40X אובייקטיביNikon
AxiophotCarl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X אובייקטיביCarl Zeiss
צנצנת מכתים מזכוכית קופלין

מקורות

  1. McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries. Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).
  2. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
  3. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 87-109 (2000).
  4. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).
  5. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).
  6. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Preparation of live testis squashes in Drosophila. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).
  7. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Formaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).
  8. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).
  9. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. F-actin staining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).
  10. Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).
  11. Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell. Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).
  12. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster Testes. J. Vis. Exp. (2641), (2011).
  13. de Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
  14. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).
  15. Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. Cytokinesis in Drosophila male meiosis. Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).
  16. Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology. Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).
  17. McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. Meiosis in male Drosophila. Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).
  18. Zoller, R., Schulz, C. The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes. Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).
  19. Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).
  20. Rebollo, E., Gonzalez, C. Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes. EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).
  21. Castrillon, D. H., et al. Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis. Genetics. 135, 489-505 (1993).
  22. Giansanti, M. G., et al. Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males. Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).
  23. Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 207-216 (2004).
  24. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
  25. Wolfner, M. F. Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products. Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).
  26. Tram, U., Wolfner, M. F. Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster. Genetics. 153, 837-844 (1999).
  27. Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene. Cell. 21, 445-451 (1980).
  28. Gunsalus, K. C., et al. Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis. J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).
  29. Anderson, M. A., et al. Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis. Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).
  30. Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis. Development. 139, 2945-2954 (2012).
  31. Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila. Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).
  32. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J. Vis. Exp. (10), (2011).
  33. Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster. Genet. Res. 54, 205-212 (1989).
  34. Liebrich, W. The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study. Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).
  35. Wong, R., et al. PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes. Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).
  36. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  37. White-Cooper, H. Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).
  38. Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biol. 2, (2004).
  39. Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).
  40. Sheng, X. R., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
  41. Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).
  42. Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes. Development. 138, 3835-3845 (2011).
  43. Wang, Z., Mann, R. S. Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis. Development. 130, 2853-2865 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים