מכתים שלילי אופטימלי: פרוטוקול תפוקה גבוהה לבחינת מבנה חלבון קטן וסימטרי על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים

Summary

יותר ממחצית מחלבונים הם חלבונים קטנים (מסה מולקולרית <200 KDA) שקוראים תיגר על שתי הדמיה מיקרוסקופ אלקטרונים ושחזורים תלת ממדים. מכתים שלילי אופטימלי הוא פרוטוקול תפוקה גבוהה חזקה ולהשיג ניגודיות גבוהה ויחסית ברזולוציה גבוהה (~ 1 ננומטר) תמונות של חלבונים סימטריים קטנים או מתחמים בתנאים פיסיולוגיים שונים.

Abstract

קביעה מבנית של חלבונים היא לא אתגר עבור חלבונים עם המונים מולקולריים בין 40-200 kDa. בהתחשב בכך שיותר ממחצית מחלבונים הטבעיים יש מסה מולקולרית בין 40-200 kDa ^1,2, יש צורך בשיטה חזקה ותפוקה גבוהה עם יכולת רזולוציה ננומטר. מכתים שלילי (NS) במיקרוסקופ אלקטרונים (EM) הוא גישה קלה, מהירה, ואיכותית אשר לעתים קרובות נעשתה שימוש במעבדות מחקר לבחינת אינטראקציות מבנה חלבון וחלבונים. לרוע המזל, פרוטוקולי NS קונבנציונליים לעתים קרובות ליצור חפצים מבניים בחלבונים, במיוחד עם יפופרוטאינים שבדרך כלל יוצרים הצגת חפצי rouleaux. על ידי שימוש בתמונות של ליפופרוטאין ממיקרוסקופ אלקטרוני cryo- (cryo-EM) כסטנדרט, הפרמטרים העיקריים בתנאי הכנת דגימת NS הוקרנו לאחרונה ודווחו כפרוטוקול מותאם NS (OpNS), פרוטוקול NS קונבנציונלי שונה ^3. חפצים כמו rouleaux יכול להיות מוגבל במידה רבה על ידי OpNS, בנוסף מספק ניגודיות גבוהה יחד עם רזולוציה גבוהה באופן סביר (ליד ננומטר 1) תמונות של חלבונים קטנים ולא סימטריים. תמונות ברזולוציה גבוהה וניגודיות גבוהה אלה הן גם נוחים לחלבון בודד (אובייקט בודד, לא ממוצע) שחזור 3D, כגון נוגדני kDa 160, באמצעות השיטה של טומוגרפיה של אלקטרון ^4,5. יתר על כן, OpNS יכול להיות כלי תפוקה גבוהה לבחון מאות דגימות של חלבונים קטנים. לדוגמא, המנגנון שפורסם בעבר של 53 חלבון העברת אסתר cholesteryl kDa (CETP) מעורב ההקרנה והדמיה של מאות דגימות ^6. בהתחשב cryo-EM רק לעתים נדירות בהצלחה חלבוני תמונות פחות מ -200 kDa טרם לפרסם כל מחקר שכלל הקרנה מעל מאה תנאי מדגם, זה הוגן לקרוא לOpNS שיטת תפוקה גבוהה ללימוד חלבונים קטנים. אני מקווה שהפרוטוקול OpNS מוצג כאן יכול להיות כלי שימושי לדחוף את הגבולות של EM ולהאיץ מחקרי EM לתוך מבנה חלבון קטן, דינמיקה ומנגנונים.

Introduction

הבנת תפקוד חלבון דורשת ידע במבנה חלבון. נחישות מבנית מהווה אתגר עבור חלבוני המונים שמולקולריים נמצאים ב40-200 kDa. קריסטלוגרפיה רנטגן מוגבלת על ידי התגבשות חלבון; תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה (NMR) מוגבלת להמונים מולקולריים פחות מ -40 KDA, בעוד מיקרוסקופ אלקטרוני cryo- (cryo-EM) יש קושי בשתי רכישת התמונה ושחזורים תלת ממדים (3D) של חלבונים קטנים, שהמונים מולקולריים פחות מ -200 kDa. יש לציין, יש להם יותר מ -50 חלבונים% מסה מולקולרית בטווח של 40-200 kDa ^1,2, כשיטות הנוכחיות מאתגרים בלימוד חלבונים בגודל זה, יש צורך בשיטה חדשה.

למרות שרוב מיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים (TEMs) מסוגלים רזולוציה אטומית, כלומר, טוב יותר מרזולוציה של 3 א ', השיג אפילו מבנה רזולוציה ננומטר ליד מדגימות ביולוגיות הוא לא challenגינג ^7. נזקי קרינה, ניגודיות נמוכה, סטיות מבניות, כמו גם חפצים כגון התייבשות כל לעכב הדמיה TEM ברזולוציה גבוהה ^3,8.

בין גישות TEM שונות, cryo-EM הוא שיטת קצה מתקדמת וחיתוך כדי להשיג מבנים ברזולוציה אטומיים של מקרומולקולות הגדולה סימטרית מאוד, בתנאים פיסיולוגיים ליד ^9-12. מדגם cryo-EM הוא הבזק מוכן הקפאת פתרון המדגם, הטבעת מקרומולקולות בקרח זגוגי, אשר צילם לאחר מכן בקירור כגון טמפרטורות חנקן או הליום נוזלי ^13. Cryo-EM יש יתרון בדגימות שאינם מהוות חפצים וכמעט ילידים במבנה ^8-12. Cryo-EM עושה לי החסרונות שלה: i) התקנים נוספים נדרשים להיות מותקנים או נרכשו לשדרג מכשיר TEM סטנדרטי ליכולת cryo-EM. התקנים כוללים: אנטי contaminator, cryo-מחזיק, תוכנת מצב במינון נמוך וSensi במינון נמוךמצלמה המופרזת CCD, למרות שהמחירים של מכשירים אלה נמוכים בהרבה מהמחיר של מכשיר TEM עצמו; ii) פעולת cryo-EM זקוק לזמן ארוך יותר מפעולת NS. בחינת דגימת cryo-EM לעתים קרובות דורשת זמן רב יותר כדי להכין את הדגימות והפעלת מכשיר TEM מזה של NS כי cryo-EM דורש טיפול בקשיים נוספים, ביניהם: פעולה נוזלית בטמפרטורת חנקן, טעינת מדגם, להיסחף הדמיה, טמפרטורה הדרגתיים, במינון נמוך פעולת מודל, מדגם רגישויות קרינה ומגבלות מינון. צעדים נוספים אלה יהיו להאט את המהירות של רכישת מידע שימושי בהשוואה לרכישת נתונים NS, אם כי בהחלט ניתן להשיג כמה תמונות cryo-EM בשעה 1 או פחות מומחי cryo-EM עם המכשיר מוכן עם שיפוע טמפרטורה מאוזן על ידי; iii) משתמשים דורשים הכשרה נוספת, כגון טיפול בחנקן נוזלי, הקפאת רשתות cryo-EM, פעולה במינון נמוך, מדידת מינון, טיפול בגבייה, נסחף וידע בproc ההדמיהEssing; iv חוסר) של הדמיה לשחזור לאותו cryo-הדגימה במהלך פגישות TEM שונות. דגימות Cryo-EM נפגמים בקלות זיהום קרח במהלך טעינה ופריקה דגימה מ / אל מכשיר TEM. נזק זה הוא בעיקר דאגה כאשר הדגימות קשות להיות מבודד / מטוהר ^14; v) חלבונים קטנים (<200 kDa מסה מולקולרית) מאתגרים להיות צילם בגלל ניגודיות נמוכה; vi) ניגודיות הנמוכה ורעש גבוה של תמונות cryo-EM מפחית את הערך חוצה קשר בין תמונות, ולכן, הפחתת דיוק הכולל בקביעת אוריינטציות חלבון, תצורות וסיווגים, במיוחד עבור חלבונים שהן מבחינה מבנית גמישים ובאופן טבעי להשתנות בפתרון ^4,5.

מכתים שלילי (NS) הוא שיטה יחסית "עתיקה" והיסטורית שכל מעבדה, עם כל סוג EM, יכולה לנצל כדי לבחון את מבנה חלבון. ברנר והורן פיתחו o התפיסה ראשונהf מכתים שלילי לפני מחצית המאה לבחינת וירוסים ^15. NS נעשה באמצעות ציפוי הדגימה עם מלחי מתכות כבדות טעונים. מושג זה מגיע במקור ממיקרוסקופ אור ואת הפרקטיקה של הטבעת חיידקים לפתרון כתם מתן חשכה סביב הדגימות, המאפשר לעומת תמונה גבוהה יותר בעת הצגת התמונה השלילית ^16. מאז יש לי היונים של מתכות הכבדות יכולת גדולה יותר לפיזור אלקטרונים בהשוואה לאטומים פחות צפופים בחלבונים ^17-20, וכתם ציפוי מתכת כבדה מאפשר הגבלת מינון גבוהה יותר עם ​​ניגודיות משופרת. דגימת NS יכולה לספק תמונות בחדות גבוהה ⁸ לקביעת אורינטצית חלקיקים קלה יותר ושחזור 3D מאשר תמונות מcryo-EM.

NS המסורתי, למרבה הצער, יכול לייצר חפצים הנגרמים על ידי אינטראקציות כתם חלבון, כגון צבירה כללית, ניתוק מולקולרי, השטחה ולערום ^8,21,22. להגנה של מחזור שומנים הקשוריםתוספות, כגון יפופרוטאינים ^16,23-30, תוצאות חפץ נפוץ בחלקיקים שנערמים וארוזים יחד לתוך rouleaux (איור 1) ^31-36. מחקרי ליפופרוטאין רבים, כגון ג'ל אלקטרופורזה nondenaturing polyacrylamide שיפוע, cryo-EM לומד ^13,29,37-40, ספקטרומטריית מסת ^39,41, ונתונים עקיפה X-ray זווית קטנים ⁴² כל החלקיקים ליפופרוטאין המופע הם חלקיקים בודדים במקום שנערמו באופן טבעי יחד יוצר rouleaux ^{21,29,30,35,42-45.} התצפית של היווצרות rouleaux ידי NS הקונבנציונלי נגרמה ככל הנראה על ידי אינטראקציות דינמיות בין ליפופרוטאינים מורכבים מapolipoproteins (apo) ופוספוליפידים שהן מבחינה מבנית גמישים בפתרון ^{13,29,30,46-49} ורגישות לפרוטוקול NS הסטנדרטי. לזהות חפץ זה, מדגם אפוליפופרוטאין E4 (apoE4) palmitoyl-oleoylphosphatidylcholine (POPC) ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) שימש כמדגם בדיקה וcryo-תמונות EM לסטנדרטיים חפץ חופשי ^29, הקרנת דגימות NS הוכנו תחת שורה של תנאים. על ידי השוואת הגדלים של חלקיקים וצורות המתקבלים מNS וcryo-EM, הסוג המסוים של מגיב מכתים וריכוז מלח נמצאו שני פרמטרים מרכזיים שגורמים לתופעות rouleaux הידועות. לפיכך, פרוטוקול מכתים שלילי מוטב (OpNS) דווח.

על ידי OpNS, תופעת rouleaux הידועה של apoE4 HDL חוסלה על ידי OpNS (איור 2 א). ניתוח סטטיסטי הראה תשואות OpNS תמונות דומות מאוד (סטייה פחות מ -5%) בגודל ובצורה בהשוואה לאלה מcryo-EM, אולם הניגוד חוסל. האימותים של OpNS בוצעו על ידי בחינת ביטול חפץ rouleaux של כמעט כל מעמדות או subclasses של דגימות ליפופרוטאין ^{6,29,30,50,51,} כוללים ננומטר apoA-אני 7.8 (איור 2), 8.4 ננומטר (איור 2 ג) , ד 9.6 ננומטרiscoidal מחדש HDL (rHDL) (איור 2 ד), 9.3 הכדורי rHDL (איור 2E) ננומטר, HDL האנושי פלזמה (איור 2F), apoA-I חופשי שומנים (איור 2G), HDL פלזמה (איור 2H), ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL ) (איור ט 2), ליפופרוטאין בצפיפות ביניים (IDL) (איור 'י 2), ליפופרוטאין בצפיפות נמוך מאוד (VLDL) (איור 2K), ויפוזום POPC (איור 2L) ^30. אימותים נוספות בוצעו על ידי ההדמיה חלבונים קטנים וסימטריים, הכוללים חלבון 53 kDa העברת אסתר cholesteryl (CETP) (איור 3 א - ג) ^6,29, ונוגדן IgG kDa גמיש מאוד 160 (איור 4 א 'וב') ^{4,5,29 , 52} ושני חלבונים, מבני ידועים, GroEL ופרוטאזום (איור 2M וN). לצורך באימות נוספת מגolleagues, אנחנו פתוחים לכל בדיקות עיוורים בשיטת OpNS זה.

OpNS כפרוטוקול תפוקה גבוהה גם נעשה שימוש כדי ללמוד מנגנון חלבון באמצעות בחינת מאות דגימות של חלבונים קטנים, כגון CETP שמחייבים חלבונים שונים תחת תנאי סדרה (כולל CETP אינטראקציה ל4 סוגים של ליפופרוטאין, HDL recombined, הפלזמה HDL, LDL וVLDL, עם / בלי 2 נוגדנים, H300 וN13, תחת פעמים 9 דגירה, כוללים 3 דקות, 20 דקות, 1 שעה, 2 שעות, 4 שעות, 8 שעות, 24 שעות, 48 שעות ו72 שעה, מתחת לגיל 4 יחסים טוחנות, כלומר, 1: 0.5, 1: 1, 1: 2, 1: 4, ו -3 דילולים, כלומר, 0.1 מ"ג / מ"ל, 0.001 מ"ג / מ"ל, בתוספת דגימות בקרה נוספת 0.01 מ"ג / מ"ל ו, כוללים CETP לבד, LDL לבד, וVLDL לבד, עם בדיקות משולשים של ניסויים לעיל על ידי אנשים שונים) ^6,29. OpNS תמונות של CETP סופקו תמונות עם ניגודיות גבוהות עם פרטים מבניים בסדר סביר; ומאפשרים לנו לשחזר את מפת צפיפות 3D של 53 kDa SMA בהצלחהחלבון ll CETP (איור 3D - F) על ידי שחזור חלקיק יחיד. יתר על כן, תמונות OpNS ניגודיות הגבוהה מספקות לנו אות מספיק מחלבון בודד (איור 4 א - ג), אשר אפשר לנו להשיג את החלטת ביניים ש( ~ 1.5 ננומטר) של יחיד (אובייקט אחד, לא ממוצע) מבנה IgG נוגדן 3D באמצעות שיטת טומוגרפיה של האלקטרון בודד חלקיקים (IPET) (איור 4E - J) ^5. התיאור מפורט של אסטרטגית IPET שיקום, מתודולוגיה, תהליכי צעד אחר צעד וניתוח וריאציה מבניים שדווח בעבר ^4. סרט על נהלי שחזור נוגדן IPET, כוללים תמונות גולמי ותוצאות ביניים, מפת צפיפות 3D ועגינה מבנית היה זמין גם לציבור על ידי שהועלה ליוטיוב ^5. השוואה של 3D השחזורים מחלקיקי נוגדן בודדים שונים יכולה לחשוף את הדינמיקה של החלבונים וגשינויי onformational במהלך תגובות כימיות ^4,5.

בהתחשב בכך שמעל 50% מחלבונים יש מסה מולקולרית הנעה 40-200 kDa ^1,2, ההצלחה בהדמית החלבונים הקטנים האלה מעידה כי שיטת OpNS היא כלי שימושי כדי לדחוף את גבול EM הקונבנציונלי כלפי קביעות מבניות קטנות וסימטריות ותגליות מנגנון . לפיכך, הפרוטוקול מפורט מסופק כלהלן.

Protocol

.1 הכנת הפתרון מכתים שלילי טרי על 1% (w / v)

1. שים אבקת 1 מ"ג Uranyl Formate (UF) לבקבוק זכוכית המכיל 100 מ"ל מים deionized בחדר או בתיבה כהה.
2. מערבבים את O הפתרון / N ב RT בחדר / קופסא חשוכה. לעטוף את בקבוק הפתרון עם נייר אלומיניום כדי למנוע אור מלהכות את הפתרון.
3. סנן את הפתרון בעדינות דרך 0.2 מיקרומטר מסנן (גודל נקבובית) רכוב על מזרק 5 מ"ל. הפתרון המסונן נאסף לכמה צינורות פלקון מכוסים בנייר אלומיניום. מזרק המסנן גם חייב להיות עטוף בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור.
4. סנן את הפתרון שוב דרך 0.02 מסנן מיקרומטר (גודל נקבובית) רכוב על מזרק 1 מ"ל. הפתרון המסונן נאסף וaliquot לתוך 2 מ"ל בקבוקונים. המזרקים והבקבוקונים להיות מכוסים ברדיד אלומיניום לפני השימוש.
5. להקפיא את בקבוקוני aliquot באמצעות מלקחיים ארוכים טיפלו הצללה הבקבוקונים לתוך מיכל חנקן מלא בנוזל באופן מיידילאחר הפתרון היה מסונן.
6. העבר את המבחנות הקפואות ל-80 ° C מקפיא לאחסון ושימוש עתידי.

2 הכנת Workstation מכתים שלילי והדגירה Workstation

1. להפשיר בקבוקון של 1% פתרון UF באמבט מים שנקבע ב RT. ודא שנייר האלומיניום נשאר כרוך סביב הבקבוקון כדי למנוע חשיפה לאור.
2. סנן את הפתרון לאחר שזה מופשר לחלוטין על ידי שימוש בנייר אלומיניום עטוף מזרק 1 מ"ל רכוב עם מסנן 0.02 מיקרומטר. לאסוף את הפתרון המסונן לתוך רדיד אלומיניום חדש עטוף בקבוקון, והניח אותה על הקרח בתוך קרח תיבת כובע מכוסה מחכה לשימוש.
3. הפוך צלחות פתרון על ידי אצבע דוחפת גיליון Parafilm הארוך ~ 8 אינץ על פני השטח של צלחת התגבשות חלבון ריקה. זה יהיה ליצור שורות של צלחות עגולות בקוטר של מ"מ ~ 5. הפוך 6 צלחות בכל מקום שורת צלחות Parafilm על משטח של קרח שטוח בתוך קרח להכילמכסה אה, כתחנת עבודה צביעה.
4. פיפטה ~ 35 μl deionized מים על כל אחת משלוש צלחות שנותרו בכל שורה, ופיפטה ~ μl 35 מסונן פתרון UF על שלוש צלחות הנכונות בכל שורה. כסה תחנת העבודה הצביעה עם מכסה כדי למנוע חשיפה לאור לפני צביעת חלבונים.
5. הכן תחנת דגירה רשת EM על ידי מילוי באמצע הדרך תיבה ריקה עם קרח, ודבקת בסמוך לקולב שיכול להיות מותקן על בסיס תמיכה. הנח את פינצטה המדגם בקולב, שבו הטיפים 'פינצטה נמצאים בקרבת מקום משטח הקרח. מחצית לכסות הטיפים 'פינצטה על ידי גובה מס השפתיים תיבה. תיבת קרח אידיאלית לעשות תחנת דגירה היא באמצעות מיכל טיפים pipet ריק.

.3 OpNS מבצע

1. זוהר פריקה פחמן הסרט הדק מצופה 300 רשתות EM נחושת רשת עבור 10 שניות.
2. להרים רשת עם פינצטה ולהתחבר פינצטה לקולב על ידי שמירה על הרשת באינץ 45 ° הטיה ו1 לעיל הקרחפני השטח בתוך תחנת הדגירה.
3. לדלל את מדגם החלבון עם בופר פוספט של Dulbecco (DBPS) בריכוז חלבון סופי של ~ 0.01 ל~ 0.005 מ"ג / מ"ל. ההפקדה ~ 4 μl דילול מדגם מייד לאחר הדילול בצד פחמן של רשת EM. (ניתן לשינוי DPBS לחיץ אחר אם החלבון הוא רגיש לDPBS)
4. דגירה המדגם ברשתות EM ל~ 1 דקות בתוך תחנת הדגירה.
5. הסר את הפתרון העודף באמצעות נגיעה בקצה הרשת עם נייר סינון במהירות.
6. גע ברשת במהירות לירידה הראשונה (~ 35 μl) של פני מים טהורות על גבי גיליון Parafilm מייד אחרי הפתרון העודף הוסר על רשת EM. ולאחר מכן להסיר את עודפי המים מייד עם נייר סינון.
7. חזור על שלב 3.6 לעוד שתי פעמים על ידי שטיפת רשת EM בשתי טיפות מים שנותרו על Parafilm (שלב 3.6 ו3.7 ניתן לדלג אם המדגם הוא מאוד רגיש למים).
8. לצוף GRI EMd מייד על פני השטח של הטיפה הראשונה של זכות פתרון UF אחרי המים העודפים על רשת EM הוסר. ואז דגירה של 10 שניות. הקפד לסיים את הליכי שטיפת מים בתוך 3 שניות לפני צף הרשת על פני השטח של פתרון UF. זמן כביסה קצר יותר, באיכות טובה יותר תהיה.
9. נקה את פינצטה על ידי חדירת הטיפים לנייר סינון ל~ 2 - 3 פעמים.
10. הסר את הפתרון העודף על הרשת באמצעות יצירת קשר עם קצה הרשת עם נייר הסינון, ולאחר מכן לצוף הרשת על הירידה השנייה של UF.
11. המשך מעל צעד 3.10 על הטיפה השנייה.
12. לצוף הרשת על הטיפה השלישית של פתרון UF ולכסות את תחנת הצביעה ל~ 1 דקות.
13. שלב אופציונאלי: לשטוף את הרשת במהירות בחלק עליון של מים כפי שמתואר ב3.6. צעד נוסף זה יועיל דגימות המכילות מעל חלקיקים טעונים חופשיים זהב או רקע כתם.
14. הסר את הפתרון העודף על ידי נגיעה בנייר הסינון לthכל ישבן דואר רשת (מול צד פחמן). ייבש את הרשת הקיימת, בזרם עדין של גז חנקן ב RT מייד אחרי התבוננות פתרון קליטה לנייר הסינון.
15. מניחים את הרשת על גבי גיליון נייר סינון בתוך צלחת פטרי, ולכסות את הצלחת באופן חלקי עם כובע להתייבש במשך דקות לפחות 30 תחת RT. עבור חלק מדגימות, למקם את הרשת בC חממת 40 ° אפייה לשעה.
16. אחסן את הרשת לתוך תיבת רשת EM לEM עתיד בחינה.

.4 EM בחינה

1. יישר TEM כראוי לפני בדיקת EM של החלבונים הקטנים על הרשת.
   1. בדוק את הרזולוציה של Thon-הטבעת גלויה הגבוהה ביותר שהיא כוח הספקטרום של סרט פחמן אמורפי כדי לקבוע אם TEM כבר מיושר כהלכה. מאז TEM משותף למשתמשים רבים ושונים, TEM לעתים קרובות אינו מכוון כראוי.
   2. לבדוק היטב את כוח הספקטרום באזור סרט פחמן של הדגימה כדי להתאים את conditio היישורn של המכונה. Thon-הטבעות הגלויות הגבוהות ביותר הן טובות יותר מאשר ברזולוציה ממוקדת.
      הערה: כדוגמא ליישור נכון של TEM נימה LaB6 פעל תחת מתח גבוה 120 ק, ניתן דמיינו יותר מ -20 Thon-טבעות, שבו, ברזולוציה המקבילה יכול להיות טובה יותר מאשר 5.0 א. זה Thon-טבעת הושגה על ידי העברה פורייה של סרט פחמן אמורפי צילם תחת defocus של ~ 1.6 מיקרומטר ומינון של 20.4 אלקטרוני / A2 (איור 5).
      הערה: תצפית של רזולוציה הגבוהה Thon-הטבעת היא תנאי הכרחי, אך לא תנאי מספיק ליישור נכון. למעשה, כדי להשיג תמונות ברזולוציה גבוהות, הרבה פרמטרים אחרים חשובים אף הם, כגון איכות דגימה, נזקי קרינה, טעינה ונסחף, כמו גם את שיעור מינון התאורה.
2. להביא defocus חזרה לכמעט Scherzer מוקד להדמית החלבונים הקטנים באזור באופן אידיאלי מוכתם.
3. חיפוש לאזור "מעונן" להדדואר. אזור מוכתם באופן אידיאלי ממוקם בדרך כלל בסמוך לקצה של אזור כתם עבה, שנראה כמו אזור "מעונן" ברשת מאז העובי של הכתם הוא בדרך כלל לא מתחלק באופן שווה על הרשת מצופה פחמן (איור 6). בדרך כלל בהגדלה נמוכה (<100x) הייתה לעזור למצוא האזורים המעוננים הללו הראשונים לפני התקרבות להדמיה.

Results

המימושים של OpNS כוללים בדיקות המבניות וצורניות של מיני ליפופרוטאין שונים כגון: HDL המתהווה רקומביננטי (rHDL), HDL רקומביננטי הכדורי, HDL פלזמה, LDL, IDL וVLDL (איור 2) ^30; כמו גם חלבונים קטנים כמו 53 kDa CETP (בין החלבונים הקטנים ביותר צילמו בהצלחה באמצעות EM) (איור 3) ⁶ ונוגדנים IgG 160kDa (אחד מהחלבונים הדינמיים והטרוגנית ביותר) (איור 4) ^4,5,29,52 , אפילו 28 kDa אפוליפופרוטאין החופשי השומנים-1 (איור 2L), וGroEL והפרוטאזומים (איור 2M וN).

דוגמאות נוספות לOpNS כשיטת תפוקה גבוהה בוחנות אינטראקציות בין חלבונים לחשיפת מנגנוני החלבון, כגון 53 kDa CETP. כפי שתואר במבוא, איך CETP אינטראקציה עם subclasses שונה של ליפופרוטאין היתה investigaטד באמצעות בחינה יותר מ -400 דגימות EM ⁶ עד כמה שאנחנו יודעים, לא היה שום מקרה כזה של מחקר cryo-EM שכרוך הקרנה כמעט מאה תנאים שונים.

OpNS יכול להרחיב גבולות EM ללמוד מבנה 3D החלבון קטן וסימטרי ואף להרחיב כדי להשיג מבנה 3D יוצר חלבון אחד ויחיד (ללא ממוצע). לדוגמא, נוגדן IgG הוא 160 מולקולת kDa עם מבנה גמיש מאוד, שבו שחזור 3D בהחלטת ביניים שקורא תיגר שיש להשיג. שיטת OpNS שימשה לתמונת נוגדן IgG בודד מסדרה של זוויות הטיה (איור 4E וH). תמונות ברזולוציה גבוהה באופן סביר וחלבון גבוה בניגוד מOpNS אפשר לשיקום המוצלח של חלבון בודד על ידי טומוגרפיה של אלקטרון חלקיק הבודד (IPET) (איור 4E - J) ^4,5. בשחזור IPET 3D ^{(איור 4F וG) 4. באותה הגישה, מורכב נוגדני פפטיד יחיד שוחזר, ופפטיד מושרה השינוי הפנימי תחום קונפורמציה של חלקיק נוגדן בודד התגלה (איור 4I וJ, רזולוציה ~ 16.6 א) 4,5. השוואת 3D השחזורים מחלקיקים בודדים שונים, הניתוח המבני עשוי לאפשר לנו לגלות תנודות תרמודינמיים חלבון, ואפילו "snap-ירייה" שלבי ביניים של תגובה כימית 4,5,29,53,54.}

לסיכום, החלבונים עם מסה מולקולרית בין 40 kDa - 200 kDa הם מאתגרים עבור בדיקות תקן EM מבניות ושחזורים. בהתחשב בכך שיותר מ -50%של חלבוני מסה מולקולרית הנעה 40-200 kDa ^1,2, אנו מדווחים שיטת OpNS ככלי תפוקה גבוהה חזקה ולדחוף את גבול EM הקונבנציונלי כלפי קביעות מבניות קטנות וסימטריות ואפילו מחקרים מכניסטית.

איור 1 חפץ רולו של ליפופרוטאין בא"מ הקונבנציונלי מכתים שלילי (NS). micrographs אלקטרונים (מעל פנלים) וחלקיקים שנבחרו (להלן פנלים) להראות ליפופרוטאינים שונים עם rouleaux לאחר NS עם חומצת phosphotungstic (PTA) תחת הליך תמהיל סטנדרטי. () מחדש HDL (rHDL) עם ApoE4, (ב) apoA-I-מכילים 9.6 ננומטר דמוי דיסקוס rHDL, (C) apoB מכיל LDL פלזמה, (ד ') ליפוזומים POPC שאינו מכיל אפוליפופרוטאין. בארים: 50 ננומטר. גודל חלון: וC, 20 nמ '; B, 30 ננומטר. כתב העת של מחקר ליפידים בתחילה פרסמה את העבודה הזאת ^29,30. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור מבנה 2 חלבון על ידי צביעה שלילית מותאמת micrographs (OpNS) EM אלקטרונים להראות ליפופרוטאינים שונים ויפוזומים בלי חפץ rouleaux ידי OpNS () apoE4 המכיל rHDL;.. 7.8 ננומטר rHDL (B); 8.4 ננומטר rHDL (C); ( D) 9.6 ננומטר rHDL; (E) 9.3 rHDL הכדורי ננומטר, (F) פלזמה אנושית α-HDL; (G) פלזמה HDL; (LDL מפלזמה האנושי H); (IDL פלזמה האנושי I); (VLDL פלזמה האנושי J); (L) שומנים חופשיים apoA-I. אימות נוספות נעשתה באמצעות GroEL (M) ודגימות (N) פרוטאזום. Micrographs (פנלים למעלה) וחלקיקים שנבחרו (להלן לוחות). בארים: 50 ננומטר. גודל חלון: - D, 20 ננומטר; E ו F, 25 ננומטר; G, 20 ננומטר; H, 25 ננומטר; אני, 50 ננומטר; J ו K, 100 ננומטר; L, 80 ננומטר., מלבד apoA-I שומנים חופשיים, GroEL והפרוטאזום, מחקר זה פורסם במקור בכתב העת ליפידים ^29,30 מחקר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3 micrographs האלקטרונים OpNS של CETP. (א) מיקרוסקופ סקירה עם (עיגולים מקווקוים) CETP חלקיקי בננה בצורה. (B) Windoweד בחר חלקיקי גלם. שלוש תמונות חלקיקים (C) יחידים CETP הגלם מראים בבירור טיפ גדול יותר, כבד יותר וגדול יותר כדורי כוללים (פנל מהשמאל) האחר קטן יותר, קל יותר וקצה צר, מבט מלמעלה מראה אזורי מסוף דומים עם פחות עקמומיות כוללת (באמצע תצוגת פנל), וסופו של דבר את הציר של CETP (פנל מימין) הארוך (ד ') יצירת ערמת המבנה הגבישי (PDB:. 2OBD) על גבי תמונות חלקיקים אלה גלם CETP, תואמת היטב בשני גודל הצורה והתחום המבני המראה את הכיוון יכול להיות כמעט מוגדר ישירות גם ללא סיוע של מחשב (המקביל לפנלים (C)). (ה) הפניה ממוצעי כיתת 2D חופשיים (תהליך מלכתחילה כדי לחשב את הדמיון (חישוב מתאם צולב) של חלקיקים בכיוון באופן אקראי אלה, החלקיקים שיש גבוה דמיון זה לזה קובצו, מיושר ולאחר מכן בממוצע כדי להפחית את רעשי רקע ומשופר con תמונת החלקיקיםTrast. ממוצעי כיתת 2D החופשי ההתייחסות מחושבים על ידי תוכנת refine2D.py בחבילת אימאן, שבו, אין כל מודל ראשוני אנושי שנעשה היה מעורב בממוצע בכיתה זו. ממוצעי כיתת ההתייחסות יכולים לשמש כשיטת עצמאית כדי לאמת את שחזור 3D משחזור חלקיק יחיד). () ממוצעי F התייחסות נבחרת חופשיים 2D כיתה להראות קצה הדיסטלי גדול יותר בהשוואה לאחרים. (G) מבנה הגבישי גבי (PDB :) השוואת 2OBD לממוצעים חופשיים ההתייחסות, תמונות הכיסוי להראות תוצאות מושלמת ליד בין גביש מבנה וממוצע כיתתי ללא התייחסות בשתי צורת המבנה וגודל תחום (פנל נמוך) (מפת צפיפות 3D של CETP בF). רזולוציה של 13 Å שוחזרה מ8879 חלקיקים צילמו על ידי OpNS ושיטת שחזור אחיד חלקיקים (פנל עליון) והחרוש הגוף עגן לשחזור אחיד חלקיקים זאת על ידי המבנה הגבישי (פנל נמוך). Detמידע מציק של שחזור החלקיק הבודד, כוללים עיבוד מקדים תמונה, מודל ראשוני, נהלי עידון, הפצת זווית ומתאם פורייה Shell (FSC) פורסם בסעיף השיטה ומידע התומך של הנייר המקורי השוואה סופית של שחזור חלקיק בודד ((H) מעל פנל) והשוואה נוספת PDB בכושר (פנל תחתון) ^6. בארים:, 50 ננומטר; B - D, 10 ננומטר; F, 3 ננומטר. חלק מנתונים אלה פורסמו בעבר בביולוגיה Nature Chemical ^6. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4 תמונות OpNS ושחזורים של חלקיקי נוגדן IgG 1 האדם. (א) במהלךתצוגה של תמונות IgG1 נוגדן OpNS אנושיות. חלקיקים שמוצגים בעיגולים לבנים באופן ברור להציג את החלקיקים עם 3 תחומי משנה. (ב) נבחרים תמונות גולמי ברזולוציה גבוהה של חמישה חלקיקים בודדים unconjugated נוגדן ו( C) התמונות מופחתות הרעש המקבילה שלהם על ידי הפחתה ידנית רעש שמסביב קצה חלקיקי גלם (ללא מגע כלשהו צפיפות בתוך החלקיקים) כדי לחזות בקלות. (המבנה הגבישי (1IGT כניסת PDB) של נוגדן IgG1 שהיה מכוון לצפייה באופן דומה לתמונות EM D). השוואה של התמונות המקבילות תערוכות תכונות רבות משותפות בין תמונת EM והמבנה הגבישי, הכוללים עמדות וצורות תחום. (E) הליך צעד לצעד של שיקום מלכתחילה 3D מנוגדני IgG1 המופע יחיד (לא ממוצע, אובייקט אחד בודד) באמצעות טומוגרפיה של האלקטרון בודד חלקיקי שיטה (IPET). (F) שחזור 3D הסופי של siחלקיקי נוגדני ngle ברזולוציה של 14.1 Å הראו שלושה תחומים סופגנייה בצורה להרכיב בצורה "Y". (G) עגינת המבנים גבישיים תחומים שלכל אחד מן מקביל צפיפות תחום מפות בהתאמה, וחוזרים באופן ידני את הלולאות בין תחומים. (H) הליך צעד לצעד של שחזור 3D ממכלול אחד IgG-peptide (לא ממוצע, אובייקט אחד בודד) על ידי IPET. (I) שחזור 3D הסופי של מתחם פפטיד IgG הוצג ברזולוציה של 16.6 Å הראה שלושה מוט תחומים צורה להרכיב בצורה "Y" (J) בהתאמה, עגינת המבנה הגבישי של כל תחומי נוגדן IgG (כניסת PDB: 1IGT). לכל צפיפויות צורת מוט הראו התאמה גרועה עם מבנים גבישיים תחום, המצביעה על שינוי קונפורמציה תחום פנימי לאחר נטיית פפטיד. הנוהל מפורט, ניתוח ברזולוציה וסטטיסטיקה תוארו במאמר המקורי 4 ומדעי דוחות ^5. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ספקטרום כוח .5 איור של סרט פחמן אמורפי צילם תחת 1.6 מיקרומטר defocus ידי Zeiss Libra 120 LaB6 TEM. הדמיה ברזולוציה גבוהה דורשת ראיות מספיקות כדי להראות שיש EM יכולת יישור ורזולוציה גבוהה המתאימה. הניתוח של ספקטרום ההספק של אזור פחמן הסמוך על הרשת הוא שיטה יעילה כדי לבדוק את מצב לכידות קרן לפני רכישת נתונים. העברה פורייה של התמונה של אזור פחמן אמורפי להראות פונקצית העברת ניגוד המכשיר קשורה (C TF), מה שנקרא Thon-טבעות. יישור ולכידות נכונים יכולים לבוא לידי ביטוי במספר Thon-טבעות גלויות והרזולוציה הגבוהה ביותר של טבעות Thon גלויות תחת מצב defocus גבוה יחסית. כדוגמא למצב יישור נכון ליד של TEM ₆ נימה מעבדה מצוידת, יותר מ ~ 20 טבעות Thon (~ 5 א) יכולות להיות שנוצרו מסרט פחמן הם צילמו ב1.6 מיקרומטר defocus באמצעות מינון 20.4 דואר ^- / ^2. טבעות Thon השיגו מTEM נמוך בסוף יש לי דומה לזה שמן TEM-high-end, כגון TEM אקדח פליטת שדה (FEG) משופר פעל תחת מצב יישור נכון. עבודה זו פורסמה בתחילה במדעי דוחות ^5. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"Width =" 6highres.jpg 500 "/>
איור 6 micrographs דוגמא לאזורים "אידיאליים" להדמית OpNS. שלוש דגימות חלבון, () GroEL (B) פרוטאזום (C) על בסיס כדורי HDL, שימש כדוגמאות כדי להדגים את OpNS האידיאלי להדמיה. מאז כתמים מופצים בצורה לא אחידה בדגימה, נמוכה הגדלה של מדגם מופיעה בדרך כלל "מעונן" (הפנל השמאלי ביותר). האזורים אידיאליים להדמיה בדרך כלל ממוקמים בגבולות של "עננים" אלה. דוגמא של צעד אחר הצעד זום-באזור אחד "מעונן" כתם (פנל באמצע משמאל) מראה את התמונות להגדלה חזקת הצגה עם רזולוציה גבוהה ותמונות עם ניגודיות גבוהות של חלקיקים (פנל באמצע מימין). תמונות נבחרות של חלקיקים להראות את פרטי המבנה של חלבונים (הפנל הימני ביותר). בארים:. 30nm אנא לחץ כאן כדי להציג גדולגרסת R של נתון זה.

איור 7 תרשים סכמטי של נהלי OpNS. תחנת דגירה רשת EM, תחנה פשוטה כדי לדגור פתרון המדגם על הרשת זוהרת משוחררת (). (ב) תחנת עבודה הכתמה, שנועד לשמור על טיפות מים כביסה, וטיפי כתם מעל מיטת קרח, תוך מזעור חשיפת כתם לאור. סקירה כללית של הליך מכתים (C), הממחיש: כיוון סופג, שטיפת המים 3x, חשיפת כתם 3x UF, דגירה הכתמה עם רשת מדגם הפוכה על טיפות כתם, ומדגם ישבן סופי סופג כדי להבטיח שכבה דקה של מדגם פתרון כתם לפני ייבוש על ידי חנקן אוויר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של ההוא דמות.

איור 8 גבוהה - תמונות ברזולוציה של החלבון הקטן 53kDa CETP חשפו משיטת OpNS שונה, cryo-חיובי מכתימה (cryo-PS) חמש לבחור ברזולוציה גבוהה ובצורה מעגלית תמונות רכות רעולי פנים גלם של חלקיקי CETP (עם ניגודיות הפוכה). וצורת חלקיקים רעול פנים חלקיקי גלם (רעש מופחת באופן ידני המקיפים קצוות "תמונות חלקיקי גלם, אך מבלי לשנות את כל צפיפות בתוך החלקיקים) כדי לחזות בקלות. כל אטום והשוואה מבנה הגבישי סרט לרעול פן חלקיקי גלם מיושרים לאורינטציות דומות של כל חלקיק לתמונות EM. הפרטים ברזולוציה הגבוהה של האזורים בתמונת הגלם להציג דמיון מסוים עם המבנה הגבישי, ואילו ניתן לפתור לא כל תכונות המבנה הגבישי מהנתונים גולמיים. Remarka בליי, תמונות גלם אלו מראות דמיון בשני המסוף מסתיים יש חורים עגולים קטנים בסביבה ראו בתמונות רעש מופחתים באופן ידני (משולש); יתר על כן, הגדילים באזורי C-מסוף בתוך תמונות חלקיקים משלימים מבנה הגבישי β-sheets (חיצים) ולבסוף, לולאות בולטות באזור CETP C-המסוף הן דומות במבנה הגבישי (יהלומים). () חמש בחרו ברזולוציה גבוהה ובצורה מעגלית תמונות רכות רעול פנים גלם של חלקיקי CETP (עם ניגודיות הפוכה). (B) נמוך לעבור סינון ל10A. לעבור נמוך גבוהה סינון ל20A (C). (D) רעולות פן תמונות באופן ידני מופחתות רעש. (E) השוואת Crystal מבנה במבנה סרט. השוואת מבנה (F) קריסטל ידי כל ייצוג אטום. בר: 5nm. חלק מעבודה זו פורסם בביולוגיה Nature Chemical ^6.כחוש "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 9 micrographs אלקטרונים של יפוזומים מראים היווצרות רולו על ידי פרוטוקול קונבנציונלי NS (כתם PTA) תחת שונה מליחות. () מליחות גבוהה (~ 0.5 MNaCl). (B) מליחות רגילה (~ 0.25 M NaCl). (C) מליחות נמוכה (~ 0.1 M NaCl). (ד) מים טהורים. Micrographs (מעל פנל) וחלקיקים לבחור חלונות (מתחת ללוח) מוצגים. בארים: 100 ננומטר. גודל חלון: 80 ננומטר. כתב העת של מחקר ליפידים פרסם את העבודה הזאת ³⁰ במקור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

בהשוואה לטכניקות NS קונבנציונליות, OpNS יכול למנוע חפצי rouleaux (איור 1 ו -9), המספקים רזולוציה גבוהה אמינה וסבירה (~ 1nm) פרטים מבניים של חלבונים קטנים (איור 2). בהשוואה לcryo-EM, OpNS מספק שיטת תפוקה גבוהה ויכול לבחון מגוון רחב של חלבונים ואינטראקציות בין חלבונים ^6. עם זאת, OpNS עדיין יש חסרונות שלה. בהשוואה לNS הקונבנציונלי, OpNS כרוך: i) צעדים מסובכים יותר בהכנת דגימה; ii) באמצעות חומר רדיואקטיבי, UF; iii) שמירה על הכתם טרי בשל העוצמה קצרה יותר של כתם UF בגלל הרגישות לאור שלה; iv) כדי למנוע משקעים פתרון UF חייב להיות מאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס ודורש הפשרה לפני השימוש; v) ולבסוף כל UF יש לטפל בם כפסולת מסוכנת. בהשוואה לcryo-EM, OpNS מספק תמונות ברזולוציה נמוכות יחסית ואין ערובה לכל חפץ שעדיין לא גילהבעתיד.

השפעות פרוצדורליים פעולת NS על היווצרות rouleaux ליפופרוטאין

פרוטוקולי NS להכנת חלבונים לבדיקה ^16,29-36,55 ניתן לסווג לשלוש קבוצות עיקריות של שיטות ^50: ערבוב ^55, טיפה אחר טיפה ^16, ונהלי כביסה ^29. i) פרוטוקול הערבוב דורש הערבוב הראשוני של מדגם הכתם וחלבון ביחס ספציפי, ולאחר מכן להחיל את הפתרון המעורב על גבי סרט פחמן מצופה ברשת, סוף סוף הסרת פתרון עודף עם נייר סינון לפני ייבוש באוויר לבדיקת EM ^55. ii) פרוטוקול טיפה אחר טיפה כרוך החלת (~ 4 μl) ירידת מדגם ישירות לרשת EM המצופה בכפיפות לתת פחמן לדקות ~ 1, לאחר מכן הסרת פתרון מדגם עודף לפני יישום ירידה (~ 4 μl) של כתם פתרון באותו הצד של רשת. לאחר דקות ~ 1 של דגירה, להסיר את excesכתם של באמצעות מגע עם נייר סינון נקי, לבסוף הגשה לייבוש אוויר ^16,56-58. iii) פרוטוקול הכביסה (איור 7) שדורש מדגם יישום פתרון לרשת EM המצופה בפחמן 1 דקות, ואז לשטוף עם מים ללא יונים שלוש פעמים מייד אחרי הסרת הפתרון העודף בכל פעם על ידי נייר סינון ^3,29,30. OpNS פרוטוקול היה שונה מהליך זה כביסה.

סוגי כתם NS והשפעות על היווצרות rouleaux ליפופרוטאין

בNS, פיזור אלקטרונים חזק יותר בשל כתמי מתכת כבדים מספק ניגוד מהחלבונים ^17-20,59. דגימות NS יכולות לסבול בנוסף מינוני קרינה גבוהים יותר, ולשפר את תכונות חלבון על ידי ניגוד שלילי חדה ^8,9,60. כתמים של מתכות כבדות יכולים להיות מסווגים כ: אניוני, כוללים חומצת phosphotungstic (PTA) ^16, tungstate methylamine ¹⁴ וtungstate סיליקון ^61; וקטיוןic, כגון אצטט Uranyl (UA) ^62, UF ^3,29,30, וחנק Uranyl (האו"ם) ^63. אחד כתמי NS אניוני שהוא נפוץ ביותר הוא הורים ^33,64-67. ועד ההורים הוא חומצת heteropoly, המשמשת בדרך כלל סביב pH 7.0-7.5. גם ועד הורים יכולים לשמש לצביעה חיובית ^3,16,68. המטענים השליליים של הורים עשויים לתווך אינטראקציות אלקטרוסטטיות עם שומנים בלתי רוויים מטען חשמלי חיובי קבוצות ראש, כמו POPC, על שני המשטחים ליפופרוטאין ויפוזום. ועד ההורים עלולים לגרום להיווצרות rouleaux באמצעות אינטראקציה זו ^29,30 אפילו תחת ^29,30 הרגיל מליחות חיץ (איור 1). כתמי uranyl, כגון UA, UF והאו"ם הם בחירות חלופיות לכתמי קטיוני כבדים מתכות וUA בפרט משמשים לעתים קרובות לNS של מגוון רחב של דגימות ביולוגיות ^62,69,70. ניסויים מצאו UF לא גורם rouleaux של ליפופרוטאין המכיל שומני חומצת שומן בלתי רוויים, כגון POPC. עם זאת, UF עדיין עשוי לגרום לרולהיווצרות aux על ליפופרוטאין המכיל שומנים רוויים חומצות שומן, כגון phosphatidylcholine dimyristoyl (DMPC) ו1-hexadecanoyl-2-octadecanoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (PSPC). המנגנון מפורט של אינטראקציה זו אינו ידוע. UA / UF / האו"ם יכול כל העבודה בערכי pH נמוכים יותר הנע 3.5-4.6. ערכי pH נמוכים יותר כגון אולי לא מתאים למקרומולקולות ביולוגיות מסוימות, כי הם רגישים לpH ^14,71. מעניין, UA / UF יכול לתקן את מבנה חלבון בתוך כמה אלפיות דרך מנגנון לא ידוע ^72. בניגוד להורים, UA / UF הוא יותר דומה למלח מאשר חומצה.

UF דיווחים יכול לספק תוצאות טובות יותר מאשר UA ^73, שבו, יש לי כתמי UF והאו"ם גדלי גרגר קטנים יותר מUA (UF: 0.3 ננומטר, האו"ם: ~ 0.5 ננומטר) ^3,74. דוגמא מעניינת, פרטים כמו מבנה משניים של חלבון קטן (53 kDa CETP) ניתן דמיין ישירות מmicrographs הגלם כאשר UF שימש כמגיב שלילי כתם על ידי הבאמוקדם יותר דיווח cryo-חיובי מכתים (cryo-PS) שיטה (איור 8) ^6. בcryo-PS, המדגם המוכתם היה הבזק הוקפא על ידי ביצוע הליך הכנת מדגם cryo-EM במקום הליך ייבוש בפרוטוקול OpNS, שעלול לגרום לקריסה המבנית המשנית. Cryo-PS הוא שיטה לניגודיות גבוהה והדמיה ברזולוציה גבוהה של חלבונים קטנים ^75. מאחר שתמונות cryo-PS שהתהפכו ניגוד בהשוואה לאלה מפרוטוקול cryo-NS דיווח ^22, אבל יש לי ניגוד תמונה עקבי לאלה מתמונות cryo-EM קונבנציונליים, ולכן זה נקרא שיטת cryo-PS. תמונות cryo-PS מראות שמגיב מכתים, formate Uranyl, חודר את פני השטח המולקולריים, קורא תיגר על ההשקפה המקובלת שמכתים יכול לדמיין רק את מבנה פני השטח החיצוני. המנגנון של איך formate Uranyl חודר את פני השטח המולקולריים אינו ידוע. אפשרות אחת היא שקטיון Uranyl נקשר קבוצות carboxyl החלבון זמינות, ובכךמסביב קרח זגוגי הוא של צפיפות נמוכה מההכתמה של החלבון וקבוצות Uranyl, ובכך פועלים ככתם חיובי. שיטת cryo-PS היא דומה לשיטת החלפת isomorphous (MIR) מרובה, שהייתה גישה מקובלת כדי לפתור את הבעיה השלב בקריסטלוגרפיה רנטגן ^76-78. במיר, דגימות קריסטל הם ספוגים עם פתרון אטום כבד, כוללים אורניום, כדי לקבל צורה דומה בצורתה לצורה המקורית שלו. התוספת של אטום הכבד לפעמים אינה משפיעה על ממדי תא היווצרות גבישים או יחידה אך מספקת מידע נוסף של קביעת מבנה גביש ^76-78. על ידי נהנה מהתבואה הקטנה של UF, cryo-PS יכול לספק ניגודיות גבוהה ותמונה ברזולוציה גבוהה של חלבון יחיד, וזה חשוב ללימודי מבנה חלבון, במיוחד כאשר בהתחשב בכך שכמעט כל החלבונים באופן טבעי דינמיים והטרוגנית בפתרון. לאימות של שיטת cryo-PS זה, אנחנו פותחים לכל מבחן עיוור משדה EM. p>

השפעות ריכוז מלח על היווצרות rouleaux ביפופרוטאינים

באמצעות מגיב מכתים שלילי עד הורים מסורתיים, היווצרות rouleaux נצפה היא סביר יותר שקשורות לאינטראקציות שומנים במקום אינטראקציה חלבון. ההדמיה הדגימות של שלפוחית ​​יפוזום POPC הוכנה תחת מליחות ניכרת (0.5 M NaCl), מליחות מתונה (0.25 M NaCl), יחסית מליחות חלשה (0.1M NaCl), ומים טהורים (איור 9), micrographs האלקטרונים להראות היווצרות rouleaux הייתה בקורלציה לריכוז מלח (איור 9 א - ד). באמצעות מגיב מכתים שלילי כUF, לא rouleaux נצפה במדגם POPC שלפוחית ​​יפוזום ³⁰ (איור 2L), המצביעה על הליך הכביסה כדי להפחית את ריכוז מלח ממש לפני הצביעה היא הכרחית במהירות, אך לא באופן עצמאי צעד מספיק למניעת rouleaux בPOPC קשור דגימות.

"Jove_content"> חלבון קטן ההדמיה TEM דורש מצב פוקוס קרוב Scherzer.

ההדמיה TEM המוצלחת של חלבונים קטנים ברזולוציה גבוהה יותר דורשת שני תנאים קריטיים, יישור קורה תקין ומצב רכישת התמקדות כמעט Scherzer. i) יישור קורה נכון יכול להישפט דרך מספר הצלצולים הגלויים Thon (ספקטרום כוח) על ההעברה פורייה של תמונת סרט פחמן שנרכשה במסגרת defocus הגבוה יחסית. טוב יותר את מצב היישור של הקורה, ניתן דמיינו יותר טבעות Thon ותמונה הניתנת למדידה .. ii) רכישה תחת התמקדות כמעט Scherzer היא עוד מצב קריטי. אסטרטגיה סטנדרטית מסורתית הדמיה דגימות ביולוגיות בדרך כלל מנצלת גבוה defocus (1 - מיקרומטר 2 ואפילו יותר), שיכול לשפר את הדגימה הביולוגית לעומת תמונת ^79. אסטרטגיה זו היא משמעותית שונה מהאסטרטגיה הטיפוסית הדמיה מבנה רזולוציה אטומית של חומרים קשים, שלעתים קרובותמנצל מוקד ליד Scherzer (~ 50 ננומטר defocus). למרות, defocus גבוה יותר יכול לחזק את ניגוד מדגם ביולוגי, אותות ברזולוציה גבוהה יחוסלו באופן חלקי. כתוצאה מכך, שיתוף הפעולה של אות ברזולוציה גבוהה יהיה נמוך יותר במצב הדמיה defocus גבוה יותר. הסיבה לכך היא ש, תמונת TEM היא פיתול של מבנה המדגם וCTF המכשיר. CTF הוא עקומת נדנוד נגד התדירות, שבו העקומה לעתים קרובות נעה חציית אפס משרעת בתדר גבוה. בכל פעם כאשר CTF פני אפס, מדגם האות המבנית בתדר הספציפי הזה יבוטל (אפס פעמים כל מספר יהיה אפס). האות בוטלה בתדר זה אף פעם לא יכול להיות התאוששה על ידי כל אלגוריתם תיקון CTF (אפס מחולק באפס יכול להיות כל מספר במקום האות המבנית המקורית אקראי). תחת ההדמיה defocus גבוהה יותר, CTF יהיה להתנדנד הרבה יותר אגרסיווי, וכך CTF חוצה אפס משרעת בתדירות גבוהה יותר, כתוצאה מכך,האותות המבניים במספר רב יותר של תדרים ספציפיים יבוטלו. אותות יותר שבוטלו, התמונה תהיה פחות השותפות לפשע. יש לציין, בשיתוף הפעולה של תמונה לא ניתן לשחזר או לתקן על ידי כל תיקון CTF. עם זאת, מספר תמונות incompleted שנרכשו במסגרת defocuses שונה ניתן להשתמש כדי למלא את הפערים שלהם זה לזה כדי להשיג אות מבנית הושלמה במבנה המדגם באמצעות שיטת מיצוע, שבו ניתן להשיג גם ברזולוציה אטומית ^9-12.

שיטת המיצוע היא גישה רבת עוצמה כדי להשיג את המבנה של חלבונים מסוימים סימטריים מאוד, וחלבונים נוקשה קשורים מבחינה מבנית. עם זאת, זה עדיין נותר מאתגר במחקר המבני של חלבונים קטנים וסימטריים, במיוחד לדינמיקה מבנית וחלבונים גמישים, כגון נוגדנים וHDLs. מיצוע מבוסס על ההנחה שחלקיקי חלבון זהים במבנה ובקונפורמציה אבל different באורינטציות, חלבונים ואולם רבים ידועים לעבור תנודות תרמודינמיים בפתרון. על ידי יישום שיטת המיצוע בלי לדעת בעבר תנודות תנודות תרמודינמיים החלבון, מבנה הממוצע יכול לעתים קרובות לגרום חסר תחומים ^10,80 או וריאציה מקומית ברזולוציה ⁸¹ בשחזורי cryo-EM.

ההצלחה בהשגת שחזור 3D של חלבון קטן, כגון 53 kDa CETP, ומבנה 3D של חלבון בודד, כגון 160 נוגדן kDa IgG1, יתרונות משימוש במצב ההדמיה מוקד הקרוב Scherzer תחת מצב יישור נכון. למרות ניגוד התמונה נראה נמוך בכמעט Scherzer תמונות מוקד, לעומת זאת ניתן לשפר בקלות פשוט על ידי החלת סינון מעביר נמוך כדי להפחית את הרעש בתדר גבוה ברקע. אנו מאמינים, כמעט Scherzer להתמקד תמונות לשאת אותות מבניים המרביים, ויכול להגביר את הדיוק של יישור חלקיקים ולשפר את אפיבקיאות בשחזור 3D חלקיק יחיד ושחזור טומוגרפיה של האלקטרון בודד של חלקיקים.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
כתם: Uranyl Formate	חטיבת האספקה של SPI של Structure Probe, Inc.	מזרק http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml 02545-AA
1 מ"ל NORM-JECT	VWR	89174-491	מסנן
מזרק https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491: 0.2 μ מ	מסנן מזרק https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487 VWR	28145-487
0.02 μ מסנן m (אנוטופ 10)	Whatman	6809-1002	http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx
Dulbecco' s פוספט חוצץ מלח	SIGMA-Aldrich	D8537
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en®ion=US Parafilm: 4 אינץ' x 125 רגל.	VWR	470152-246
https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A רשת TEM מצופה סרט פחמן: 300 רשת	Pacific Grid-Tech	Cu-300CN	http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon
רשת TEM מצופה סרט פחמן: 200 רשת	EMS (מדעי מיקרוסקופיה אלקטרו)	CF200-Cu	http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx
פינצטה: פינצטה Dumont L5	EMS (מדעי מיקרוסקופיה אלקטרו)	72882-D
http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5 Milli-Q Advantage A10 מערכת טיהור מים טהורים	במיוחד EMD Millipore	Milli-Q Advantage A10
http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117 נייר סינון: כיתה 1 מעגלים	Whatman	1001-090	http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx
רדיד			כל סוג
טיפים מסנן: טיפים מסנן אירוסול שמירה נמוכה עבור 10 ומיקרו; L Pipettors	VWR	89174-520	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520
[header]
יחידת פריקת זוהר	Ted Pella	91000
http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm טיפים לסינון: טיפים לסנן אירוסול עם שמירה נמוכה עבור 40µ L פיפטורים	VWR	89174-524
https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524 טיפים לסינון: VWR Signature 200 ומיקרו; L טיפים לפיפט	VWR	37001-528	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528
פיפט	פיפטמן	F161201 F167300	http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx