Method Article

גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על 15 N מטבולית תיוג וכמותי ספקטרומטריית המסה

DOI:

10.3791/51103

⸱

March 13th, 2014

 ,  ,  , 
1Institute of Plant Biology and Biotechnology, University of Münster, 2Department of Plant Biology, Carnegie Institution for Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגישה המתוארת ההשוואתית, כמותית proteomic מטרתה קבלת תובנות לתוך הרכב של מתחמי multiprotein בתנאים שונים ומודגמת על ידי השוואת זנים שונים מבחינה גנטית. ניתוח כמותי כמויות שווה של שברים שונים מצפיפות סוכרוז שיפוע מעורבבות ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הציג מספק כלי לניתוח של מתחמי multiprotein בקרום thylakoid, על ידי גילוי תובנות קומפוזיציה מורכבת בתנאים שונים. בפרוטוקול זה הגישה באה לידי ביטוי על ידי השוואת הרכב של החלבון האחראי מורכב עבור זרימה מחזורית אלקטרונים (CEF) בChlamydomonas reinhardtii, מבודדת מזנים שונים מבחינה גנטית. ההליך כולל בידוד של קרומי thylakoid, ואחרי הפרידה שלהם למתחמי multiprotein ידי צנטריפוגה סוכרוז שיפוע צפיפות, SDS-PAGE, immunodetection וספקטרומטריית השוואתית, כמותית מסה (MS) המבוססת על תיוג ההפרש מטבולים (14 N / 15 N) של זנים נותחו. קרומי thylakoid solubilized דטרגנט נטענים על הדרגות צפיפות סוכרוז בריכוז כלורופיל שווה. לאחר ultracentrifugation, ההדרגות מופרדות לשברים, אשר נותחו על ידי המוני spectrometר"י מבוסס על נפח שווה. גישה זו מאפשרת החקירה של הרכב בתוך השברים השיפוע ויותר מכך כדי לנתח את התנהגות הנדידה של חלבונים שונים, המתמקדת בעיקר על ANR1, CAS, וPGRL1. יתר על כן, שיטה זו באה לידי ביטוי על ידי המאשר את התוצאות עם immunoblotting ובנוסף על ידי תמיכה בממצאים ממחקרים קודמים (זיהוי וההגירה PSI תלוי של חלבונים שתוארו בעבר להיות חלק מCEF-supercomplex כגון PGRL1, FNR, ו cyt ו). יש לציין, גישה זו היא ישימה לטיפול במגוון רחב של שאלות שלפרוטוקול זה יכול להיות מאומץ ודוגמה המשמשת לניתוחים השוואתיים של קומפוזיציה מורכבת multiprotein מבודד מהתנאים סביבתיים שונים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תהליכי פוטוסינתזה בקרומי thylakoid של צמחים ואצות יכולים לתפקד במצב ליניארי והמחזורי. במהלך זרימת אלקטרונים ליניארי photosystem (LEF) אני (PSI), photosystem השנייה (PSII) ו 6 / ו ב ציטוכרום סופו של דבר להעביר אלקטרונים ממים לNADP 1 +, מוביל את הדור של NADPH ו-ATP 2. בניגוד לכך, זרימה מחזורית אלקטרונים (CEF), אשר ידועה להיות מושרה בתנאים סביבתיים מגוונים כמו תנאי מדינה 2 3 ואנאירוביים 4, תוצאות מחדש הירידה של PSI חמצון על ידי הזרקה של אלקטרונים בחזרה לשרשרת העברת האלקטרונים. תהליך זה יכול להתרחש גם בצד של סטרומה ב ציטוכרום המורכב 6 / F <....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Culturing של Chlamydomonas

  1. ג הבא reinhardtii זנים ששימשו במחקר הנוכחי: cc124 WT, cw15-arg7 WT (auxotroph הלקוי וארגינין תא קיר), זן ΔPSI מוטציה 29 ומתח עקום החוצה pgrl1 4.
  2. כל הזנים גדלו בטריס-אצטט פוספט (TAP) בינוני 30, ב ° C25 בעוצמה מתמשכת אור 20-50 μE / מ 2 שניות ורועד ב120 סל"ד. התרבות של ΔPSI צריכה להיות עטופה בנייר אריזה דק לחשיפה לאור של <5 μE / מ 2 שניות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גישת פרוטאומיקה כמותיים הציגה מטרה לאפיין את ההרכב של מתחמי multiprotein בקרומי thylakoid הודגמו על ידי הניתוח ההשוואתי של רכיבי CEF-supercomplex בג שונה מבחינה גנטית reinhardtii זנים. השיטה המתוארת בהצלחה יושמה על ידי Terashima et al. 6 וכוללת את הבידוד של קרומי thylakoid מתרבויות אנאירובי גדל, ואחריו solubilization חומרי ניקוי. בהמשך לכך, דגימות הועמסו על צפיפות סוכרוז שיפוע המבוססת על כמות כלורופיל שווה ומתחמים המופרדים על ידי ultracentrifu.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרי proteomic כמותיים שונים באמצעות תיוג איזוטופ יציב כבר פורסמו בשנים האחרונות. בניסויים אלה בדרך כלל שני מדגמים שונים בהשוואה, מתוכם מדגם אחד מתויג עם איזוטופ יציב. לאחר מכן חלבונים או פפטידים משני המדגמים משולבים ביחס שווה ומעובד יחד נוסף 48. מחקרים כאלה לעתים קרובות מתכוונים להשוות תאים מוגדרים מבודדים סלולריים (למשל כלורופלסטים, מיטוכונדריה, או קרומי thylakoid) נחשפו לתנאי עקה שונים 26,34,49 לחקור למעלה או למטה רגולציה של חלבונים מסוימים. הגיש.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שום אינטרס כלכלי מתחרה.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MH מודה תמיכה מ" דויטשה Forschungsgemeinschaft "(DFG). מחבר תרומות: MH תוכנן מחקר; KT, JS ו MT ביצע מחקר וניתחו את הנתונים; KT וMH כתב העיתון.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>כימיקלים
אצטיתAppliChemA0662http://www.applichem.com/home/
אצטוןAppliChemA2300http://www.applichem.com/home/
אצטוניטריל אופטיגראד fü r LC-MSאלכסוני9340מזיק, עבודה עם כפפות. ראה טקסט הפרוטוקול לאמצעי זהירות נוספים.

https://www.diagonal.de/

אמוניום כלוריד 15Nמעבדות איזוטופ קיימברידג'39466-62-1
http://www.isotope.com/cil/index.cfm אמוניום כלוריד 14NAppliChemA0988http://www.applichem.com/home/
אמוניום מימן פוספט AppliChemA3583http://www.applichem.com/home/
אמוניום גופרתי AppliChemA3598http://www.applichem.com/home/
Coomassie כחול מבריק R-250Fisher Scientific10041653 http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex
n-Dodecyl-β-D-maltosideAppliChemA0819http://www.applichem.com/home/
EDTAAppliChemA2937http://www.applichem.com/home/
חומצה פורמית   AppliChemA3858http://www.applichem.com/home/
HEPESAppliChemA3724http://www.applichem.com/home/
מגנזיום כלורידAppliChemA4425http://www.applichem.com/home/
מתנולAppliChemA2954http://www.applichem.com/home/
חומצה זרחתיתAppliChemA0989http://www.applichem.com/home/
דיפוטסיום מימן פוספט AppliChemA1042http://www.applichem.com/home/
אשלגן דימימן פוספט AppliChemA1043http://www.applichem.com/home/
נתרן הידרוקסידAppliChemA1551http://www.applichem.com/home/
סוכרוזAppliChemA1125http://www.applichem.com/home/
TricineAppliChemA3954http://www.applichem.com/home/
TrisAppliChemA2264http://www.applichem.com/home/
טריפסין (דרגת ריצוף שונה) ומאגר טריפסיןPromegaV5111http://www.promega.de/
<חזק>ציוד
נבולייזר (משבש תאי BioNeb)Glas-Colhttp://www.glascol.com/product/subproduct/id/75
(14 מ"מ x 89 מ"מ) בקמן קולטר331372להכנת שיפועים בסגנון טקהאשי

http://www.beckmancoulter.de/

צינורות צנטריפוגות 25 מ"מ x 89 מ"מ
בקמן קולטר344058להכנת שיפועי בידוד תילקואידים.

http://www.beckmancoulter.de/

Coulter Avanti צנטריפוגה J-20 XPבקמן קולטרhttp://www.beckmancoulter.de/
תא הוצאת תאים פוקס-רוזנטלאלכסוני449/72
https://www.diagonal.de/ הומוגנייזר (פוטר) 50 מ"ל פישרברנד10618242
http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand עלי להומוגניזטורפישרברנד105252220
http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand אולטרה-צנטריפוגה (אופטימה XPN-80 אולטרה-צנטריפוגה)בקמן קולטראתר: http://www.beckmancoulter.de/
<חזק>אחר
נוגדנים Agriserahttp://www.agrisera.com/en/index.html
צינורות צנטריפוגה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Joliot, P., Joliot, A. Cyclic electron flow in C3 plants. Biochim. Biophys. Acta. 1757 (5-6), 362-368 (2006).
  2. Shikanai, T. Cyclic electron transport around photosystem I: genetic approaches. Annu. Rev. Plant Biol. 58, 199-217 (2007).
  3. Finazzi, G., Furia, A., ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiprotein Complex AnalysisSucrose Density GradientQuantitative Mass SpectrometryThylakoid Membrane IsolationMetabolic LabelingSDS PAGEImmunodetectionCyclic Electron FlowChlamydomonas ReinhardtiiProtein Migration Behavior

Related Articles