בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

Summary

ניתן לבודד קרדיומיוציטים בודדים מעכברים פראיים ועכברים מוטנטיים מהלב על מנת לחקור את ההתכווצות שלהם ואת מעברי הסידן שלהם. זה מאפשר לאפיין את התרומה של תפקוד לקוי של התאים לתפקוד לקוי של הלב מכל סיבה שהיא.

Abstract

קרדיומיוציטים, תא סוס העבודה של הלב, מכילים אלמנטים ציטו-שלד והתכווצות מאורגנים להפליא המייצרים את כוח ההתכווצות המשמש לשאיבת דם. קרדיומיוציטים בודדים בודדו לראשונה לפני למעלה מ-40 שנה על מנת לחקור טוב יותר את הפיזיולוגיה והמבנה של שריר הלב. הטכניקות השתפרו במהירות וכוללות עיכול אנזימטי באמצעות זלוף כלילי. לאחרונה, ניתוח ההתכווצות ושטף הסידן של מיוציטים מבודדים סיפק כלי חיוני בניתוח תאי ותת-תאי של אי ספיקת לב. אקו לב וא.ק.ג מספקים מידע על הלב ברמת האיבר בלבד. קיימות מערכות תרבית תאים קרדיומיוציטים, אך לתאים חסרים מבנים חיוניים מבחינה פיזיולוגית כגון סרקומרים מאורגנים וצינוריות T הנדרשות לתפקוד מיוציטים בתוך הלב. בפרוטוקול המוצג כאן, קרדיומיוציטים מבודדים באמצעות זלוף לנגנדורף. הלב מוסר מהעכבר, מורכב דרך אבי העורקים לצינורית, מועשר באנזימי עיכול, והתאים מוכנסים לריכוזי סידן הולכים וגדלים. תוכנת זיהוי קצה וסרקומר משמשת לניתוח התכווצות, וצבע פלואורסצנטי קושר סידן משמש להמחשת מעברי סידן של קרדיומיוציטים בקצב חשמלי; הבנה הולכת וגוברת של התפקיד ששינויים תאיים ממלאים בתפקוד לקוי של הלב. באופן מסורתי משתמשים במערכת זו לבדיקת השפעות תרופות על קרדיומיוציטים, אנו משתמשים במערכת זו כדי להשוות מיוציטים מעכברי WT ועכברים עם מוטציה הגורמת לקרדיומיופתיה מורחבת. פרוטוקול זה ייחודי בהשוואה של תאים חיים מעכברים עם תפקוד לב ידוע וגנטיקה ידועה. מצבי ניסוי רבים משווים באופן מהימן, כולל מניפולציה גנטית או סביבתית, זיהום, טיפול תרופתי ועוד. מעבר לנתונים פיזיולוגיים, קרדיומיוציטים מבודדים מקובעים ונצבעים בקלות עבור אלמנטים ציטו-שלד. בידוד קרדיומיוציטים באמצעות זלוף הוא שיטה רב-תכליתית ביותר, שימושית בחקר שינויים תאיים הנלווים או מובילים לאי ספיקת לב במגוון מצבי ניסוי.

Introduction

קרדיומיוציטים מספקים את כוח ההתכווצות ללב. כל מיוציט מכיל אלמנטים ציטוסקלטליים והתכווצות מאורגנים החיוניים להתכווצות. הלב מכיל לא רק קרדיומיוציטים אלא גם פיברובלסטים, רקמת חיבור ומיוציטים שעברו שינוי כגון סיבי פורקיניה. ניתן לראות שינויים בכל אחד מסוגי התאים הללו או בכולם, באי ספיקת לב, מה שמקשה על קביעת הגורם האולטימטיבי לתפקוד לקוי של הלב. לירידה בהתכווצות החדרים של לב כושל קדמו דרגות שונות של הצטברות רקמה סיבית והיפרטרופיה ותפקוד לקוי של הקרדיומיוציטים¹. הפרעות קצב יכולות להיגרם על ידי תפקוד לקוי בתאים המוליכים², פיברוזיס המפריע להולכת הלב³, או שינויים בביטוי תעלות יונים בקרדיומיוציטים^1,4. ואכן, בעיות אלה מתקיימות לעתים ק....

Protocol

להבטיח שכל ההליכים כרוכים בבעלי חיים מאושרים על ידי השימוש בבעלי החיים המתאימים וטיפול גוף.

.1 הכינו חוצצי המלאי מראש

1. הכן מניית 2 L Ca ^{2 +} של Tyrode החופשי (טבלת 1). התאם את רמת החומציות ל7.4 עם NaOH.
2. הכן מניית 2 L 1.2 של מ"מ Ca ^{2 +} Tyrode (טבלת 2). התאם את רמת החומציות ל7.4 עם NaOH.

.2 ביום של ....

Results

ברגע שההתכווצות והעתקים חולפים נאספות (איור 2), הנתונים מנותחים בקלות עם התוכנה המתאימה. המעקב כל, או החלקים מן יכול להיות בממוצע (איור 3). התכווצות יכולה להיות מנותחת במגוון של דרכים. לתפקוד הסיסטולי, אחד יכול להעריך את סדר הגודל של התכווצות עם קיצור חלקי, או במהירות של התכווצות עם זמן להגיע לשיא קיצור, ומהירות התכווצות. פונקציה הדיאסטולי ניתן לנתח באופן דומה עם זמן לקיצור 50% ומהירות הרפיה. עבור ארעיים סידן, ניתן להשוות נתונים דומים הכוללים בסיס.......

Discussion

בידוד של שריר לב באיכות דורש רמה מסוימת של תרגול ואופטימיזציה. פרוטוקול זה מכיל שלבים עיקריים שיכול להשפיע על התוצאה של העיכול באופן משמעותי. אלה יש לשקול בזהירות בעת ביצוע ופתרון הבעיות בפרוטוקול. הזמן מהסרת הלב לcannulation וזלוף צריך להיות ממוזער, באופן אידיאלי פחות מחמש דקות. שטיפת הלב מייד במאגר זלוף קר כקרח לאחר הסרת מהעכבר ולנתח וcannulating הלב במאגר קר כקרח גם תגדיל את הסיכויים של מערכת עיכול איכות. Cannulation עצמו הוא שלב קריטי. הקצה של הצינורית יש להציב מתחת לענפים הרא.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	RPI	S23020
KCl	Sigma	P-3911
MgCl2	Sigma	M-8266
HEPES	EM Science	S320
NaH2PO4	Sigma	S5011
CaCl2· 2H2O	Fisher	C79
D-(+)-גלוקוז	Sigma	G7528
2,3-בוטנדיון-מונוקסים (BDM)	Sigma	B-0753
טאורין	Sigma	T-0625
אלבומין סרום בקר (BSA)	Sigma	A-7030
קולגנאז B	Roche Diagnostics	1-088-823
קולגנאז D	Roche Diagnostics	1-088-882
פרוטאז XIV	Sigma	P-5147
Heparin	APP Pharmaceuticals, LLC	401586D
איזופלואורן	באטלר שיין	11695-6776-2
Fura-2 AM	Teflabs	103
DMSO –	סיגמא	276855
מערכת קוצב תאים וניתוח פלואורסצנטי IonOptix
250 μ m מסנן רשת ניילון	Sefar America	Lab Pak 03-250/50
23 G מתאם Luer-stub	Becton Dickinson	1482619E
PE-50 צינורות	Becton Dickinson	427410