ניתן לבודד קרדיומיוציטים בודדים מעכברים פראיים ועכברים מוטנטיים מהלב על מנת לחקור את ההתכווצות שלהם ואת מעברי הסידן שלהם. זה מאפשר לאפיין את התרומה של תפקוד לקוי של התאים לתפקוד לקוי של הלב מכל סיבה שהיא.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
קרדיומיוציטים, תא סוס העבודה של הלב, מכילים אלמנטים ציטו-שלד והתכווצות מאורגנים להפליא המייצרים את כוח ההתכווצות המשמש לשאיבת דם. קרדיומיוציטים בודדים בודדו לראשונה לפני למעלה מ-40 שנה על מנת לחקור טוב יותר את הפיזיולוגיה והמבנה של שריר הלב. הטכניקות השתפרו במהירות וכוללות עיכול אנזימטי באמצעות זלוף כלילי. לאחרונה, ניתוח ההתכווצות ושטף הסידן של מיוציטים מבודדים סיפק כלי חיוני בניתוח תאי ותת-תאי של אי ספיקת לב. אקו לב וא.ק.ג מספקים מידע על הלב ברמת האיבר בלבד. קיימות מערכות תרבית תאים קרדיומיוציטים, אך לתאים חסרים מבנים חיוניים מבחינה פיזיולוגית כגון סרקומרים מאורגנים וצינוריות T הנדרשות לתפקוד מיוציטים בתוך הלב. בפרוטוקול המוצג כאן, קרדיומיוציטים מבודדים באמצעות זלוף לנגנדורף. הלב מוסר מהעכבר, מורכב דרך אבי העורקים לצינורית, מועשר באנזימי עיכול, והתאים מוכנסים לריכוזי סידן הולכים וגדלים. תוכנת זיהוי קצה וסרקומר משמשת לניתוח התכווצות, וצבע פלואורסצנטי קושר סידן משמש להמחשת מעברי סידן של קרדיומיוציטים בקצב חשמלי; הבנה הולכת וגוברת של התפקיד ששינויים תאיים ממלאים בתפקוד לקוי של הלב. באופן מסורתי משתמשים במערכת זו לבדיקת השפעות תרופות על קרדיומיוציטים, אנו משתמשים במערכת זו כדי להשוות מיוציטים מעכברי WT ועכברים עם מוטציה הגורמת לקרדיומיופתיה מורחבת. פרוטוקול זה ייחודי בהשוואה של תאים חיים מעכברים עם תפקוד לב ידוע וגנטיקה ידועה. מצבי ניסוי רבים משווים באופן מהימן, כולל מניפולציה גנטית או סביבתית, זיהום, טיפול תרופתי ועוד. מעבר לנתונים פיזיולוגיים, קרדיומיוציטים מבודדים מקובעים ונצבעים בקלות עבור אלמנטים ציטו-שלד. בידוד קרדיומיוציטים באמצעות זלוף הוא שיטה רב-תכליתית ביותר, שימושית בחקר שינויים תאיים הנלווים או מובילים לאי ספיקת לב במגוון מצבי ניסוי.
מבוא
קרדיומיוציטים מספקים את כוח ההתכווצות ללב. כל מיוציט מכיל אלמנטים ציטוסקלטליים והתכווצות מאורגנים החיוניים להתכווצות. הלב מכיל לא רק קרדיומיוציטים אלא גם פיברובלסטים, רקמת חיבור ומיוציטים שעברו שינוי כגון סיבי פורקיניה. ניתן לראות שינויים בכל אחד מסוגי התאים הללו או בכולם, באי ספיקת לב, מה שמקשה על קביעת הגורם האולטימטיבי לתפקוד לקוי של הלב. לירידה בהתכווצות החדרים של לב כושל קדמו דרגות שונות של הצטברות רקמה סיבית והיפרטרופיה ותפקוד לקוי של הקרדיומיוציטים1. הפרעות קצב יכולות להיגרם על ידי תפקוד לקוי בתאים המוליכים2, פיברוזיס המפריע להולכת הלב3, או שינויים בביטוי תעלות יונים בקרדיומיוציטים1,4. ואכן, בעיות אלה מתקיימות לעתים ק....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
להבטיח שכל ההליכים כרוכים בבעלי חיים מאושרים על ידי השימוש בבעלי החיים המתאימים וטיפול גוף.
.1 הכינו חוצצי המלאי מראש
- הכן מניית 2 L Ca 2 + של Tyrode החופשי (טבלת 1). התאם את רמת החומציות ל7.4 עם NaOH.
- הכן מניית 2 L 1.2 של מ"מ Ca 2 + Tyrode (טבלת 2). התאם את רמת החומציות ל7.4 עם NaOH.
.2 ביום של ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ברגע שההתכווצות והעתקים חולפים נאספות (איור 2), הנתונים מנותחים בקלות עם התוכנה המתאימה. המעקב כל, או החלקים מן יכול להיות בממוצע (איור 3). התכווצות יכולה להיות מנותחת במגוון של דרכים. לתפקוד הסיסטולי, אחד יכול להעריך את סדר הגודל של התכווצות עם קיצור חלקי, או במהירות של התכווצות עם זמן להגיע לשיא קיצור, ומהירות התכווצות. פונקציה הדיאסטולי ניתן לנתח באופן דומה עם זמן לקיצור 50% ומהירות הרפיה. עבור ארעיים סידן, ניתן להשוות נתונים דומים הכוללים בסיס.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בידוד של שריר לב באיכות דורש רמה מסוימת של תרגול ואופטימיזציה. פרוטוקול זה מכיל שלבים עיקריים שיכול להשפיע על התוצאה של העיכול באופן משמעותי. אלה יש לשקול בזהירות בעת ביצוע ופתרון הבעיות בפרוטוקול. הזמן מהסרת הלב לcannulation וזלוף צריך להיות ממוזער, באופן אידיאלי פחות מחמש דקות. שטיפת הלב מייד במאגר זלוף קר כקרח לאחר הסרת מהעכבר ולנתח וcannulating הלב במאגר קר כקרח גם תגדיל את הסיכויים של מערכת עיכול איכות. Cannulation עצמו הוא שלב קריטי. הקצה של הצינורית יש להציב מתחת לענפים הרא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש לנו מה למסור.
תודות
מארק ווזניאק לשימוש במחלקה לסלולרית וציוד צילום וידאו בביולוגיה התפתחותית.
תא ההדמיה האוניברסיטה ונדרבילט משותף למשאב.
עבודה זו נתמכת על ידי מענק AHA 12PRE10950005 לERP, מענק AHA 11GRNT7690040 לבנק דיסקונט למשכנתות, NIH מענק R01 HL037675 לבנק דיסקונט למשכנתות. בנק דיסקונט למשכנתאות הוא יו"ר גלדיס פ Stahlman במחקר לב וכלי דם.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| NaCl | RPI | S23020 | |
| KCl | Sigma | P-3911 | |
| MgCl2 | Sigma | M-8266 | |
| HEPES | EM Science | S320 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2· 2H2O | Fisher | C79 | |
| D-(+)-גלוקוז | Sigma | G7528 | |
| 2,3-בוטנדיון-מונוקסים (BDM) | Sigma | B-0753 | |
| טאורין | Sigma | T-0625 | |
| אלבומין סרום בקר (BSA) | Sigma | A-7030 | |
| קולגנאז B | Roche Diagnostics | 1-088-823 | |
| קולגנאז D | Roche Diagnostics | 1-088-882 | |
| פרוטאז XIV | Sigma | P-5147 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals, LLC | 401586D | |
| איזופלואורן | באטלר שיין | 11695-6776-2 | |
| Fura-2 AM | Teflabs | 103 | |
| DMSO – | סיגמא | 276855 | |
| מערכת קוצב תאים וניתוח פלואורסצנטי IonOptix | |||
| 250 μ m מסנן רשת ניילון | Sefar America | Lab Pak 03-250/50 | |
| 23 G מתאם Luer-stub | Becton Dickinson | 1482619E | |
| PE-50 צינורות | Becton Dickinson | 427410 |
מקורות
- Babick, A. P., Dhalla, N. S. Role of Subcellular Remodeling in Cardiac Dysfunction due to Congestive Heart Failure. Medical Principles and Practice. 16, 81-89 (2007).
- Nogami, A. Purkinje-Related Arrhythmias Part I....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
