בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

סיכום

ניתן לבודד קרדיומיוציטים בודדים מעכברים פראיים ועכברים מוטנטיים מהלב על מנת לחקור את ההתכווצות שלהם ואת מעברי הסידן שלהם. זה מאפשר לאפיין את התרומה של תפקוד לקוי של התאים לתפקוד לקוי של הלב מכל סיבה שהיא.

תקציר

קרדיומיוציטים, תא סוס העבודה של הלב, מכילים אלמנטים ציטו-שלד והתכווצות מאורגנים להפליא המייצרים את כוח ההתכווצות המשמש לשאיבת דם. קרדיומיוציטים בודדים בודדו לראשונה לפני למעלה מ-40 שנה על מנת לחקור טוב יותר את הפיזיולוגיה והמבנה של שריר הלב. הטכניקות השתפרו במהירות וכוללות עיכול אנזימטי באמצעות זלוף כלילי. לאחרונה, ניתוח ההתכווצות ושטף הסידן של מיוציטים מבודדים סיפק כלי חיוני בניתוח תאי ותת-תאי של אי ספיקת לב. אקו לב וא.ק.ג מספקים מידע על הלב ברמת האיבר בלבד. קיימות מערכות תרבית תאים קרדיומיוציטים, אך לתאים חסרים מבנים חיוניים מבחינה פיזיולוגית כגון סרקומרים מאורגנים וצינוריות T הנדרשות לתפקוד מיוציטים בתוך הלב. בפרוטוקול המוצג כאן, קרדיומיוציטים מבודדים באמצעות זלוף לנגנדורף. הלב מוסר מהעכבר, מורכב דרך אבי העורקים לצינורית, מועשר באנזימי עיכול, והתאים מוכנסים לריכוזי סידן הולכים וגדלים. תוכנת זיהוי קצה וסרקומר משמשת לניתוח התכווצות, וצבע פלואורסצנטי קושר סידן משמש להמחשת מעברי סידן של קרדיומיוציטים בקצב חשמלי; הבנה הולכת וגוברת של התפקיד ששינויים תאיים ממלאים בתפקוד לקוי של הלב. באופן מסורתי משתמשים במערכת זו לבדיקת השפעות תרופות על קרדיומיוציטים, אנו משתמשים במערכת זו כדי להשוות מיוציטים מעכברי WT ועכברים עם מוטציה הגורמת לקרדיומיופתיה מורחבת. פרוטוקול זה ייחודי בהשוואה של תאים חיים מעכברים עם תפקוד לב ידוע וגנטיקה ידועה. מצבי ניסוי רבים משווים באופן מהימן, כולל מניפולציה גנטית או סביבתית, זיהום, טיפול תרופתי ועוד. מעבר לנתונים פיזיולוגיים, קרדיומיוציטים מבודדים מקובעים ונצבעים בקלות עבור אלמנטים ציטו-שלד. בידוד קרדיומיוציטים באמצעות זלוף הוא שיטה רב-תכליתית ביותר, שימושית בחקר שינויים תאיים הנלווים או מובילים לאי ספיקת לב במגוון מצבי ניסוי.

מבוא

קרדיומיוציטים מספקים את כוח ההתכווצות ללב. כל מיוציט מכיל אלמנטים ציטוסקלטליים והתכווצות מאורגנים החיוניים להתכווצות. הלב מכיל לא רק קרדיומיוציטים אלא גם פיברובלסטים, רקמת חיבור ומיוציטים שעברו שינוי כגון סיבי פורקיניה. ניתן לראות שינויים בכל אחד מסוגי התאים הללו או בכולם, באי ספיקת לב, מה שמקשה על קביעת הגורם האולטימטיבי לתפקוד לקוי של הלב. לירידה בהתכווצות החדרים של לב כושל קדמו דרגות שונות של הצטברות רקמה סיבית והיפרטרופיה ותפקוד לקוי של הקרדיומיוציטים¹. הפרעות קצב יכולות להיגרם על ידי תפקוד לקוי בתאים המוליכים², פיברוזיס המפריע להולכת הלב³, או שינויים בביטוי תעלות יונים בקרדיומיוציטים^1,4. ואכן, בעיות אלה מתקיימות לעתים קרובות במקביל בצורה מורכבת.

בידוד ולימוד קרדיומיוציטים מאפשר לבחון תפקוד לקוי של התכווצות ותפקוד חשמלי של מיוציטים בודדים בהקשר של תפקוד הלב הכללי. טכניקות לבידוד מיוציטים לבביים בודדים פותחו לפני למעלה מ-40 שנה במאמץ לחקור טוב יותר את הפיזיולוגיה של תא 'סוס העבודה' הזה של הלב. טכניקות הבידוד שופרו כדי להגדיל את התפוקה והאיכות של התאים, עם התפתחות חיונית של זלוף כלילי באמצעות קנולציה של אבי העורקים, שבוצעה לראשונה בשנת 1970⁵. מאמר זה מתאר בידוד קרדיומיוציטים ואחריו מדידה של התכווצות וטרנזיינטי סידן באמצעות תוכנת רכישת נתונים פלואורסצנטיים רציומטריים וממדי תאים. במודלים גנטיים וסביבתיים של מחלות לב, שימוש בפרוטוקול זה מספק מידע מרכזי על התכווצות התאים, התכווצות והרפיה סרקומריות, מעברי סידן והפרעה לשלד הציטו. מערכת זו משמשת לעתים קרובות לבדיקת השפעת תרופות על קרדיומיוציטים מבודדים^6,7. אנו משתמשים במערכת כדי להשוות התכווצות ומעברי סידן של קרדיומיוציטים בין עכברים ועכברים מסוג בר עם מוטציה המובילה לקרדיומיופתיה מורחבת.

לחקר מיוציטים לבביים בודדים יש יתרונות רבים על פני שיטות נפוצות אחרות לחקר אנטומיה ופיזיולוגיה של הלב. אקו לב ואלקטרוקרדיוגרפיה מספקים מידע על תפקוד ההתכווצות וההולכה החשמלית של הלב באופן כללי. אף אחת מהשיטות הללו לא מסבירה את הסיבה או את האופי של התפקוד הלקוי מתחת לרמה של האיבר כולו. מדידת התכווצות של קרדיומיוציטים בודדים באמצעות אלגוריתמים לזיהוי קצה ואורך סרקומר יכולה להוכיח ששינויים בתוך תא ההתכווצות של הלב קיימים בתפקוד לקוי של הלב הגלובלי. מדידת מעברי סידן מדגימה את ההשפעה של שינויים בשטף היונים ברמה התאית לתפקוד לקוי של התכווצות או הפרעות קצב.

בנוסף להשלמת מחקרי איברים שלמים, פרוטוקול זה מספק תאים שנצבעו בקלות עבור רכיבים תת-תאיים. ניתן לראות שינויים בשלד הציטו על ידי צביעת קטעי רקמה של הלב כולו; עם זאת, אדם מסוגל לדמיין רק חתך רוחב של תאים. קרדיומיוציט שלם עבה יותר מקטע הרקמה הטיפוסי, ובהתחשב בסידור ואורך הקרדיומיוציטים, קשה לראות תאים שלמים בקטע אחד. ניתן לתקן קרדיומיוציטים מבודדים באופן מיידי ולהכתים אותם עבור מגוון אלמנטים של שלד תא ותעלות יונים. ניתן להרכיב תמונות קונפוקליות לערימות z בעובי מלא של התא. בנוסף, צביעה של מיוציטים לבביים מבודדים מאפשרת צביעה של רכיבים שאי אפשר לדמיין בקטעים, כגון פלישות הממברנה הידועות בשם צינוריות T.

קיימים קווי תאים מתורבתים של מיוציטים לבביים, שלחלקם פרופילי שעתוק ומאפיינים פנוטיפיים דומים למיוציטים לבביים. חלקם, כמו קו התאים HL-1, אפילו שומרים על ארגון סרקומרי כלשהו ויכולת כיווץ בסיסית⁸. למרות תכונות אלה, תאים מתורבתים חסרים את צורת "קרון הקופסה" ואת מבנה צינוריות ה-T של קרדיומיוציטים ויש להם פחות ארגון סרקומרי. רכיבים אלה חיוניים לתפקודם של קרדיומיוציטים in vivo. בנוסף, שימוש בתאים מתורבתים מאפשר מניפולציה גנטית אך לא מניפולציה פיזיולוגית in vivo. קרדיומיוציטים מבודדים שומרים על הארגון התאי שלהם מספיק זמן כדי לחקור, אך עדיין ניתן לדמות אותם בקלות ואף^{להפוך אותם} 9.

קרדיומיוציטים מבודדים הם מגוונים ביותר, ומספקים מצע לניתוח זהה של תאים מתנאי ניסוי מגוונים. בידוד וניתוח פיזיולוגי של מיוציטים שימשו אינספור מעבדות למגוון ניסויים, כולל חקר ההשפעה של תרופות^6,7 או מולקולות קטנות¹⁰, גורמי לחץ סביבתיים¹¹, זיהום¹², מחלה¹³ או מוטציה גנטית^14,15 על התכווצות ו/או מעברי סידן וחקר ויסות ההתכווצות ושחרור הסידן בתוך קרדיומיוציטים^15-17. עם יישום כל אחד מגורמי הלחץ הללו, שינויים בתפקוד הלב יכולים לנבוע מכל שילוב של שינויים בקרדיומיוציטים עצמם ושינויים בסביבת הלב, כגון צלקות, שינויים במוליכות או שינויים במטריצה החוץ-תאית. זהו פרוטוקול אידיאלי למענה על שאלות מחקר הנוגעות למבנה ותפקוד מיוציטים בודדים בהקשר של אי ספיקת לב מכל סיבה שהיא.

למרות שיש לו אינספור יתרונות על פני טכניקות אחרות, ניתוח פיזיולוגי של קרדיומיוציטים מבודדים אינו אידיאלי לכל שאלת מחקר. בידוד הוא הליך סופני, ולכן ניתן להעריך קרדיומיוציטים רק בשלב אחד בחיי העכבר. ניתן להתגבר על כך באופן חלקי באמצעות קבוצות והקרבת עכברים בודדים לאורך התפתחות המחלה או על ידי ניטור העכבר כדי לקבוע אם יש לו אי ספיקת לב משמעותית מבחינה קלינית לפני הבידוד. למרות שפרוטוקול זה יכול לקבוע אם התרחשה הפרעה בתפקוד הקרדיומיוציטים, לא ניתן להסיק את המסקנה שתפקוד לקוי זה הוא הגורם השורש לאי ספיקת לב ללא מידע ניסיוני נוסף. ייתכן שתפקוד לקוי של קרדיומיוציטים עצמו הוא משני לשינויים אחרים בלב. למרות האתגרים הללו, חקר קרדיומיוציטים מציע מידע רב ערך בקביעת אופי התפקוד הלקוי של הלב, במיוחד בשילוב עם ניסויים אחרים.

הפרוטוקול הבא מותאם מפרוטוקול שסופק על ידי ד"ר צ'י לים, אוניברסיטת ונדרבילט. למרות שנתוני התכווצות ושטף סידן ניתנים לשחזור ושימושיים מאוד בהשוואת לבבות עם מניפולציה גנטית או סביבתית, הבידוד עצמו נותר פרוטוקול תלוי טכניקה, הדורש אופטימיזציה. מזעור הזמן בין הוצאת הלב מהעכבר לבין החדרת הלב באמצעות צינורית אבי העורקים חיוני לעיכול איכותי. בנוסף, ניתן למטב את זמן העיכול וריכוז האנזימים עבור מיוציטים באיכות הגבוהה ביותר. שלבים שסביר להניח שדורשים מיטוב, יחד עם הצעות למיטוב, מצוינים להלן.

פרוטוקול

להבטיח שכל ההליכים כרוכים בבעלי חיים מאושרים על ידי השימוש בבעלי החיים המתאימים וטיפול גוף.

.1 הכינו חוצצי המלאי מראש

1. הכן מניית 2 L Ca ^{2 +} של Tyrode החופשי (טבלת 1). התאם את רמת החומציות ל7.4 עם NaOH.
2. הכן מניית 2 L 1.2 של מ"מ Ca ^{2 +} Tyrode (טבלת 2). התאם את רמת החומציות ל7.4 עם NaOH.

.2 ביום של הניסוי, הכינו זלוף, העברה, ועיכול חוצצים

1. הכן חיץ זלוף 150 מ"ל בCa ^{2 +} של Tyrode החופשי (לוח 3) ולסנן דרך פילטר 0.2 מיקרומטר.
2. הכן 35 מ"ל Ca ^{2 +} העברה חופשית "חוצץ" (לוח 4) ו25 מ"ל Ca ^{2 +} המכיל "הצפת B" (לוח 5). לסנן כל דרך מסנן 0.2 מיקרומטר.
3. הכן את הפתרונות של 0.06, 0.24, 0.6, ו1.2 מ"מ Ca ^{2 +} על ידי הצפת ערבוב וB ללוח 6.
4. הכן חיץ עיכול 25 מ"ל על ידי המסת אנזימי עיכול ב25 מ"ל חיץ זלוף (לוח 7) המבוסס על משקל הגוף (BW) של העכבר. לסנן דרך פילטר 0.2 מיקרומטר לפני השימוש.

.3 הגדרת ניסוי

1. להרכיב מנגנון זרימת Langendorff קבוע, זמין באופן מסחרי או באמצעות משאבה, צינורות, וסליל מחליף חום peristaltic כדי לאפשר קצב זרימה של 3ml / דקה של perfusate המחומם ל37 מעלות צלזיוס. סכמטי פשוט מסופק בסקירת 2011 על ידי בל, et al ^18.
2. הגדר טמפרטורת אמבט מים במחזור (~ 47 ° C) של מנגנון Langendorff כך יצוא שמהצינורית הוא על 37 מעלות צלזיוס בקצב זרימה של 3 מ"ל / דקה.
3. הפעל 70% אתנול באמצעות מערכת זלוף במשך 15 דקות, ואחריו מסוג ultrapure אני מים 100 מ"ל. חיץ זלוף להפעיל באמצעות התוכנה למ 'במשך 5 דקות תוך ביטול בועות אוויר.
4. לעקר את כל הכלים כירורגיים עם שיטה רצויה.
5. צור צינורית על ידי הצמדת קטע קצר (מ"מ על 3) PE-50 צינורות לקצה מתאם Luer-בדל 23 G. טיפ חום של צינורות כדי ליצור שפה אשר לאב העורקים יהיו ממוצבת.

בידוד .4 Cardiomyocyte

1. הזרק עכבר עם 0.2 מ"ל פתרון הפרין (1,000 IU / ml), באמצעות הזרקת intraperitoneal.
2. אחרי 5 דקות, להרדים עכבר עם isofluorane. כשהרדים (אין תגובה לקמצוץ רגל חזקה) באופן מלא, לרסס חזה עם EtOH 70%. פתח את החזה, לכרות במהירות הלב, נזהר שלא לפגוע באב העורקים, ומקום ב4 ° C חיץ זלוף. השתמש במלקחיים מעוקלים לתפוס ולהרים תחת הלב. זה יוצר חלל לקצץ קבצים מצורפים מאחורי הלב עם מספריים עדינים.
3. Cannulate הלב בעדינות על ידי אחיזה בקצה של אב העורקים עם שני זוגות מלקחיים בסדר ומושך openi בזהירותng של אב העורקים מעבר לשפה של הצינורית. ודא את הקצה של הצינורית הוא לא עבר שסתום אב העורקים ולתוך החדר, כמו זה יהיה לעכב זלוף של הלב באמצעות העורקים הכליליים.
4. אבטח את אב העורקים לצינורית על ידי קשירת לולאה של 5-0 תפר משי סביב אב העורקים מייד מעל השפה של הצינורית.
5. הערה: שלבי 4.2 דרך 4.4 אמורים להסתיים במהירות האפשרית לעיכול באיכות הטובה ביותר.
6. הערה: הלב יכול להיות תלוי ישירות על גבי הצינורית כבר מחוברת למכשירי Langendorff עם זורם חיץ זלוף. עם זאת, תלוי הלב על צינורית שמחוברת למזרק קטן של חיץ זלוף תחת מיקרוסקופ לנתיחה כבר מצא להיות מוצלח ביותר. זה מאפשר כמות קטנה של חיץ זלוף כדי שתועבר, צופה לסליקת עורקים הכליליים והבטחת לב מחוברת היטב לצינורית. הצינורית לאחר מכן נתלתה על Langendorff עם הפעלת מאגר זלוף.
7. תנקבהלב עם חיץ זלוף החופשי Ca ^{2 +} בזרימה של 3 מ"ל / דקה במשך 2-3 דקות.
8. לעבור לאנזים חיץ עיכול ותנקב ל7-10 דקות, לב יהפוך רך יותר וקל יותר בצבע.
9. הערה: זמן עיכול יכול להיות מותאם המבוסס על פעילות אנזים וגודל לב.
10. ברגע שהלב הוא מוחשי רפוי, להוציא את הלב מהצינורית ומניחים בצלחת P60 סטרילי עם הצפת (Ca ^{2 +} חיץ העברה חופשית).
11. הסר אטריה וכלי גדול. הסר חדר ממני אם תרצה בכך. עם מלקחיים, מפריד את החדר לחתיכות קטנות. כמה פעמים פיפטה עם טפטפת העברה 5 מ"ל סטרילי כדי לפזר עוד תאים.
12. סנן את ההשעיה התא לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל דרך מסנן רשת ניילון 250 מיקרומטר.
13. לאפשר ההשעיה עד גלולה במשך כ 10 דקות.
14. העבר את הכדור לפתרון 0.06 מ"מ Ca ^{2 +.} לאפשר לתאי גלולה עבור 10 דקות. תאים בריאים גלולה, בעוד שרוב התאים מתים יצופו.
15. לשאוב supernatant, ולהעביר את הכדור לפתרון ^{2 +} מ"מ Ca 0.24.
16. חזור 10 דגירה דקות, שאיפה, ולהעביר באמצעות שני ^{2 +} פתרונות Ca שנותרו עד תאים בפתרון 1.2 מ"מ. בשלב זה, רוב התאים צריכים להיות myocytes מוט בצורה.

.5 ארעיים התכווצות וסידן מדידה

1. הערה: שתי התכווצות וארעית סידן ניתן למדוד בו זמנית.
2. הכן פורע-2 פתרון PM על ידי resuspending בDMSO נטול מים לריכוז של 1 מיקרוגרם / μl. פתרון הפורע-02:00 יכול להיות מאוחסן בתא ייבוש ב-20 מעלות צלזיוס.
3. 1 טען מ"ל של תאים תלויים עם μl 1 פורע-2 PM. לאפשר לתאים לשבת בחושך 10 דקות לאחר מכן supernatant לשאוב. שטוף פעמיים עם הפתרון של Ca ^{2 +} Tyrode, מאפשר לתאי גלולה בחושך עבור 10 דקות בין שוטף.
4. מניחים coverslip זכוכית בהוספת שלב שמאפשרת PE המחומםrfusion / שאיפה ואלקטרודה צעדה עם ממריץ שדה myocyte. הוספת שלב מקום במיקרוסקופ ההפוכה להגדיר למדידת הקרינה, הוספת טיפה של שמן לעדשה אם באמצעות אובייקטיבי טבילת שמן.
5. הגדרת זלוף כובד המחומם עם פתרון 1.2 מ"מ Ca ^{2 +} של Tyrode כך פתרון על במה מגיע 37 מעלות צלזיוס. צרף שאיפה לואקום. חבר אלקטרודות.
6. הפעל את מערכת מיקרוסקופ, ולפתוח את תוכנת הקרינה ורכישת נתונים מידות תא ratiometric.
7. הוסף כמה טיפות של תאים עמוסים פורע-2 בבוקר ועד הוספת השלב, חסימת זלוף לרגע כדי לאפשר לתאים בריאים להתיישב.
8. השתמש אובייקטיבי 40X כדי לאתר תאים הרצויים. תא בריא צריך להיות מוט בצורה ולא באופן ספונטני להידבקות. צריך כאשר התא בקצב זה בעליל וחוזה אחיד ב5-20 V.
9. הערה: ניתוח פיזיולוגי דורש עיכול באיכות גבוהה. זה אפשרי שיהיה לי תאים שנראים בריא, אבל לא pa ce גם לניתוח פיסיולוגי. פרוטוקול עיכול עשוי לדרוש עידון כדי לקבל איכות גבוהה, myocytes הבריא. בנוסף, לבבות מוטציה או חולים עשויים לדרוש שינויים בפרוטוקול.
10. התאימו סיבוב עדשה ושינוי צמצם כך התא רצוי הוא בשורה בצורה אופקית על מסך ורקע אינה גלויה.
11. יישר ברים גילוי קצה לכל קצה של myocyte ולהתאים סף. יישר זיהוי sarcomere על חלק מתא עם sarcomeres האחיד. ככל שאתה יכול לעשות זה בר, המודל המתמטי מדויק יותר של אורך sarcomere יהיה, כל עוד זה לא על שתי אוכלוסיות של sarcomeres.
12. תאי קצב ב2 הרץ ו5-20 V של 10-15 שניות לפני ההקלטה.
13. רשומה מעקב. אור הסביבה צריך להיות ממוזער להקלטה ארעית סידן הטוב ביותר.

.6 ניתוח

1. לנתח עקבות באמצעות הקרינה ratiometric ותוכנת רכישת נתונים מידות תא.

כותרת "> 7. מחקרים נוספים

1. פרוטוקול זה מספק תאים עודפים שיכול לשמש למגוון רחב של ניסויים אחרים, כוללים: קיבעון וimmunostaining, הערכת השפעות ישירות סמים, תרבות טווח קצרה, ומיקרוסקופ כוח אטומי.

תוצאות

ברגע שההתכווצות והעתקים חולפים נאספות (איור 2), הנתונים מנותחים בקלות עם התוכנה המתאימה. המעקב כל, או החלקים מן יכול להיות בממוצע (איור 3). התכווצות יכולה להיות מנותחת במגוון של דרכים. לתפקוד הסיסטולי, אחד יכול להעריך את סדר הגודל של התכווצות עם קיצור חלקי, או במהירות של התכווצות עם זמן להגיע לשיא קיצור, ומהירות התכווצות. פונקציה הדיאסטולי ניתן לנתח באופן דומה עם זמן לקיצור 50% ומהירות הרפיה. עבור ארעיים סידן, ניתן להשוות נתונים דומים הכוללים בסיס...

דיון

בידוד של שריר לב באיכות דורש רמה מסוימת של תרגול ואופטימיזציה. פרוטוקול זה מכיל שלבים עיקריים שיכול להשפיע על התוצאה של העיכול באופן משמעותי. אלה יש לשקול בזהירות בעת ביצוע ופתרון הבעיות בפרוטוקול. הזמן מהסרת הלב לcannulation וזלוף צריך להיות ממוזער, באופן אידיאלי פחות מחמש דקות. שטיפת הלב מייד במאגר זלוף קר כקרח לאחר הסרת מהעכבר ולנתח וcannulating הלב במאגר קר כקרח גם תגדיל את הסיכויים של מערכת עיכול איכות. Cannulation עצמו הוא שלב קריטי. הקצה של הצינורית יש להציב מתחת לענפים הרא...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
NaCl	RPI	S23020
KCl	Sigma	P-3911
MgCl2	Sigma	M-8266
HEPES	EM Science	S320
NaH2PO4	Sigma	S5011
CaCl2· 2H2O	Fisher	C79
D-(+)-גלוקוז	Sigma	G7528
2,3-בוטנדיון-מונוקסים (BDM)	Sigma	B-0753
טאורין	Sigma	T-0625
אלבומין סרום בקר (BSA)	Sigma	A-7030
קולגנאז B	Roche Diagnostics	1-088-823
קולגנאז D	Roche Diagnostics	1-088-882
פרוטאז XIV	Sigma	P-5147
Heparin	APP Pharmaceuticals, LLC	401586D
איזופלואורן	באטלר שיין	11695-6776-2
Fura-2 AM	Teflabs	103
DMSO –	סיגמא	276855
מערכת קוצב תאים וניתוח פלואורסצנטי IonOptix
250 μ m מסנן רשת ניילון	Sefar America	Lab Pak 03-250/50
23 G מתאם Luer-stub	Becton Dickinson	1482619E
PE-50 צינורות	Becton Dickinson	427410

נטול מים