מאמר שיטה

שימוש בחלבוני ניאון כדי לחזות ולכמת כלמידיה חלולית דינמיקת צמיחה בתאים חיים

DOI:

10.3791/51131

⸱

13 באוקטובר 2015

 ,  , 
1Division of Allergy and Infectious Diseases, Department of Medicine, University of Washington, 2Program in Infectious Diseases, School of Public Health, University of California at Berkeley

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתוארת שיטה מבוססת חלבון פלואורסצנטי של תאים חיים להארת ואקואולים תאיים (תכלילים) המכילים כלמידיה. אסטרטגיה זו מאפשרת קביעה מהירה ואוטומטית של זיהום כלמידיה בדגימות וניתן להשתמש בה כדי לחקור כמותית את דינמיקת הצמיחה של הכללה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החיידק התוך-תאי המחייב כלמידיה מעורר נטל גדול על בריאות הציבור העולמית. קלוסטרידיום טרכומטיס הוא הגורם החיידקי המוביל לזיהומים המועברים במגע מיני וגם הגורם העיקרי לעיוורון הניתן למניעה בעולם. גורם חיוני להדבקה מוצלחת של תאי מארח על ידי כלמידיה הוא יכולתו של החיידק לתמרן את איתות התא המארח מתוך תא ריק חדש הנקרא הכללה. מתוך ההכללה, כלמידיה רוכשת חומרים מזינים הנדרשים לצמיחה ההתפתחותית שלהם במשך 2-3 ימים, והם מפרישים בנוסף פאנל של חלבוני אפקטור על הפנים הציטוזוליות של קרום הווקואול ולתוך הציטוזול המארח. עם זאת, פערים בהבנתנו את הביולוגיה של כלמידיה מציבים אתגרים משמעותיים להדמיה וניתוח תא תוך-תאי זה. לאחרונה תוארה אסטרטגיית הדמיה הפוכה להמחשת ההכללה באמצעות GFP המבטא תאים מארחים. גישה זו מנצלת באופן רציונלי את האטימות הפנימית של קרום ההכללה למולקולות גדולות כגון GFP. בעבודה זו, אנו מתארים כיצד נוצרים תאים מארחים המבטאים GFP או mCherry להדמיה עוקבת של תכלילים כלמידיים. יתר על כן, שיטה זו הוכחה כתחליף יעיל לשיטות ספירה יקרות המבוססות על נוגדנים, ניתן להשתמש בה במקביל לתוויות פלואורסצנטיות אחרות, כגון כלמידיה המבטאת GFP, וניתן לנצל אותה כדי להפיק נתונים כמותיים מרכזיים על צמיחת ממברנת הכללה ממגוון זנים וזנים של כלמידיה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלות זיהומיות הנגרמות על ידי זנים של חיידק כלמידיה תאית לעורר נטל גדול על בריאות הגלובלית, כולל מחלות המועברים במגע מיני, מחלה דלקתית של אגן, עיוורון, דלקת ריאות ואולי טרשת עורקים 1-4. היכולת של כלמידיה לאינטראקציה עם התא המארח, מתוך vacuole (מכונה ההכללה), הוא הקובע קריטי לזיהומם המוצלח של תאים והמארח. ההכללה היא תא פתוגניים רומן המאפשר צמיחת כלמידיה והוא שונה באופן דינמי לאורך כל המחזור ההתפתחותי 2-3 היום השלם של כלמידיה 5. הטבע תאיים לחייב של chlamydiae מציג מספר רב של אתגרים לקהילת המחקר, בפרט לישירות לומד הביולוגיה הייחודית של ההכללה. מכשול עיקרי היה חוסר היכולת לחזות או כלמידיה תאית או ההכללה שלהם על ידי גישת ניאון ביעילותes בתאים חיים. תגלית האחרונה סוף סוף גילתה את האמצעים ליצור GFP להביע ג 6 trachomatis; עם זאת, ממצא זה עדיין לא הוביל לתיוג ספציפי של ההכללה. כמה טכניקות שתוארו לתיוג של חיידקים ותכלילים 7,8, אך הם סובלים מליקויים כגון אי-סגוליות, ארעיות ורגישות לphotobleaching. גילוי מפתח על ידי הקבוצה שלנו הוקם אסטרטגיה חדשה להארת ההכללה באמצעות GFP להביע תאי מארח 9. אסטרטגיה זו באופן רציונלי מנצלת את האטימות הפנימיות של קרום ההכללה למולקולות גדולות יותר מאשר 520 Da 10. כאשר תאים מהונדסים לבטא חלבון מסוים cytosolic ניאון (למשל, ה- GFP או mCherry) ביציבות, תכלילים כלמידיה נראים בבהירות יוצאת דופן על ידי ההדרה המוחלטת שלהם של הקרינה. אסטרטגית הדמיה הפוכה זה מאפשרת הדמיה מיידית של תכלילים לכל Chlמיני amydia וזה יכולים להתאים בקלות למרבית תאי המארח של עניין. כהפגנה של השירות שלה, שיטה זו שימשה בעבר כדי לחשוף ולהגדיר את נתיבי יציאה הסלולריים לכלמידיה spp 9.

כאן, אנו נוספים להדגים כיצד שיטה זו מתבצעת, וניתן לנצל כדי להפיק נתונים כמותיים מפתח על דינמיקת צמיחת הכללה. יתר על כן, זה יכול למעשה תחליף לשיטות ספירה מבוסס נוגדנים יקרות וניתן להשתמש בו במקביל עם תוויות ניאון אחרות, כגון mKate2 להביע 11 כלמידיה. זה שילוב רב עוצמה של כלים מאפשר חקירה של התכונות הפיזיות של קרום הכללת כלמידיה בתוך תאי מארח חיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. דור של שורות תאי מארח פלורסנט

  1. 1. תאי יום 293T פלייט (או קו האריזה retroviral אחר) על 6 צלחות גם ב2 x 10 6 תאים / טוב, להיות ~ 75% ומחוברות למחרת. אם תרצה, בארות כפולות צלחת עבור כל רטרו-וירוס לשימוש.
  2. 2. תאי היום לשאוב ולהוסיף 2 מיליליטר בינוני טרי צמיחה (DMEM + 10% FBS L- גלוטמין + 2 מ"מ). Transfect תאים עם 5-8 ק"ג כל אחד מוקטור retroviral (המכיל GFP) ווקטור אריזה (למשל., PVSVg) באמצעות Lipofectamine 2000 או מגיב דומה ובעקבות הוראות היצרן.
  3. דגירה תאים עם DNA במשך 4-6 שעות בC-CO 2 באינקובטור 37 מעלות, ולאחר מכן להחליף בינוני עם 1 מיליליטר מדיום גידול.
  4. דגירה תאים עבור 48 שעות בחממת 37 ° C-CO 2.
  5. תאי יום 3. פלייט היעד (לדוגמא., הלה) על 6 צלחות גם בצפיפות של כ 10 5 תאים / טוב, להיות ~ ומחוברות 50%היום הבא. ודא transfection החיובי בתאי 293T על ידי ניטור הקרינה GFP על מיקרוסקופ הפוכה.
  6. יום 4. לאסוף supernatants את תאי 293T בעזרת פיפטה ולסנן את supernatant דרך פילטר מזרק אצטט 0.45 מיקרומטר תאית המכיל רטרו-וירוס.
  7. הסר בינוני מתאי הלה ולהוסיף בינוני 0.5 מיליליטר צמיחה המכיל polybrene / מיליליטר 16 מיקרוגרם. להוסיף ~ 0.5 מיליליטר של רטרו-וירוס המסונן לתאי ירידה מבחינת דגירה תאים בחממה CO 2 37 ° C למשך 24 שעות. אחסן כל רטרו-וירוס שנותר (כלומר, מלשכפל גם) בשעת 4 מעלות צלזיוס.
  8. יום 5. אם בארות כפולות נעשו כדי ליצור רטרו-וירוס נוסף, חזור על שלב 1.7 להדביק סדרתי עם חלקיקי retroviral שנותרו.
  9. יום 6. מעבר transfected תאי הלה 1: 1 לאנטיביוטיקת בחירת מנה מכילה 10 סנטימטר (למשל, 500 מיקרוגרם / מיליליטר נאומיצין).
  10. חכה מספיק זמן לתאי transduced לצמוח בחזרה בנוכחות של antibio הבחירהטיק, אחרי שיכולים להיות מופצים על ידי תאי טכניקות סטנדרטיים עם ריכוז נמוך של אנטיביוטיקה בחירה (למשל., 200 מיקרוגרם / מיליליטר נאומיצין).
    הערה: תאים יכולים להיות גם נבחר clonally לבהירות אידיאלית בשלב זה, במידת צורך.

2. דור של להביע GFP כלמידיה trachomatis

  1. הכן CaCl 2 חיץ 2x (20 מ"מ טריס pH 7.4, 100 מ"מ CaCl 2) וחיץ 4SP (0.4 מ 'סוכרוז, 16 מ"מ Na 2 HPO 4).
  2. יום ג 1. הקפוא הפשירי מניית trachomatis על קרח ולדלל מייד 10 חיידקי μl ל2x CaCl חיץ 2 μl 50. הוסף 3 פלסמיד דנ"א מיקרוגרם (לדוגמא., PASK-GFP-mKate2-L2), מערבב היטב ודגירה של 30 דקות ב -25 מעלות צלזיוס.
  3. במהלך שלב זה, להכין תאי מארח ידי trypsinizing בקבוק T-75 של תאים מקוי לתוך צינור צנטריפוגות. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 50 XG במשך 5 דקות וזורקים supernatant. Resuspenתא גלולה ד בנפח המתאים של 1x CaCl חיץ 2 לתת ריכוז סופי של 4 x 10 7 תאים / מיליליטר.
  4. לאחר הדגירה 30 דקות (מהשלב 2.2), להוסיף 100 μl מוכן תאים מקוי לצינור תערובת שינוי (סה"כ נפח 200 μl) ו דגירה 20 דקות נוספות ב 25 מעלות צלזיוס. להוסיף תערובת של תאים הפך זה 100 μl ולאחת מצלחת 6 היטב וכיסוי בינוני עם 2 מיליליטר צמיחה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור במשך 2 ימים.
  5. 3. תאי Lyse מקוי היום נגועים בג trachomatis ידי החלפה בינונית עם 1 מיליליטר DH 2 O וגירוד תאים עם קצה pipet 1,000 μl כפוף. הוסף 1 מיליליטר חיץ 4SP ולהעביר השעיה באמצעות מחט 27.5 G ~ 5 פעמים לתמוגה יעילה תא ושחרורו של ג trachomatis.
  6. העברה 2 מיליליטר של lysate התא המכיל ג trachomatis לבקבוק T-75 המכיל monolayer מחוברות של MCC טרי מצופהתאים אוי; להוסיף 8 מיליליטר DMEM (ללא FBS) ו דגירה של שעה 2 ב 25 ° C כדי לאפשר ג trachomatis לדבוק תאים.
  7. תאים לשאוב ולהוסיף מדיום גידול טרי בתוספת 10 U / G פניצילין מיליליטר ו1 מיקרוגרם / מיליליטר cycloheximide. דגירה בקבוק במשך 48 שעות בחממה 37 ° C-CO 2.
  8. יום 4. ודא ידי מיקרוסקופ אור שתאים נגועות ותכלילים מכילים כלמידיה חריגה. לזהות תכלילים כvacuoles בהיר במיקרוסקופ אור רגילה, וגופי כלמידיה חריגים כאובייקטים כמו טבעת בתוך תכלילים כי הם יותר מ 2 מיקרומטר קוטר.
  9. יום 5. Lyse תרבות על ידי החלפה בינונית עם 2 מיליליטר DH 2 O ולגרד תאים לתוך השעיה. הוסף 2 מיליליטר חיץ 4SP ולהעביר השעיה באמצעות מחט 27.5 G ~ 5 פעמים.
  10. השתמש 2 מיליליטר של lysate התא להדביק monolayer טרי של תאים מקוי בבאר יחידה בצלחת 6 היטב. דגירה תאים עם lysate לשעה 2 ב 25 מעלות צלזיוס, לשאוב ולהוסיף צמיחה טרימדיום המכיל G פניצילין וcycloheximide.
  11. דגירה תאים בחממה 37 ° C CO 2 במשך 3-5 ימים, תלוי בבריאות כללית של תאים.
  12. חזור על שלבים 2.9-2.10 אחד או יותר פעמים, תרבויות צורך, passaging לתוך בארות טריות בצלחת 6-היטב עד תכלילים מחפשים נורמלים (נטולי גופים הסוטים) צמחו. בשלב זה להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך כדי לבדוק שג trachomatis להביע mKate2 (אדום).
  13. בהיקף של עד תרבויות נגועות לדור של מניות כלמידיה גבוהה כייל, למשל על ידי קצירת transformants כלמידיה מהתאים מקוי או הלה נגוע גדלו בT-150 צלוחיות.

3. להדביק תאים עם כלמידיה

  1. תאי צלחת ה- GFP-הלה בכלי תרבות רצוי, לדוגמא כלים מזכוכית תחתונה או שקופיות קאמריות להדמיה ברזולוציה גבוהה, או 24 גם צלחות לקביעת IFU והקרנת multiwell.
  2. להפשיר הלוך ושובצינור זן המכיל ג trachomatis, ג muridarum, או ג pneumoniae על קרח ולדלל בHBSS לריבוי רצוי של זיהום (משרד הפנים), למשל משרד הפנים = 1.
  3. בצע זיהומים או סטטי או בעזרת צנטריפוגה המבוססים על זן כלמידיה המסוים שישמש.
    1. לזיהומים עם ג serovar trachomatis LGV L2 או ג muridarum, לשטוף תאי GFP-הלה עם HBSS ו דגירה עם חיידקים מדוללים לשעה 2 ב 25 מעלות צלזיוס. לשאוב ולשטוף תאים עם HBSS, דגירה תאים במדיום גידול בחממת 37 ° C-CO 2.
    2. לזיהומים עם D serovar trachomatis ג או ג pneumoniae, לשטוף תאי GFP-הלה עם HBSS ולהוסיף חיידקים בדילול לתאים. מניחים צלחת multiwell או צלחת זכוכית תחתונה (מובטחת בקלטת במכסת צלחת multiwell) בבעל צלחת multiwell של קובץ מצורף הרוטור דלי מתנדנד בצנטריפוגה המעבדתיים.
    3. תאי צנטריפוגה ב 900 XG ב 25 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    4. הסר כלי תרבות מצנטריפוגות והמקום בחממה 37 ° C CO 2 עבור שעה 1.
    5. תאים לשאוב בארון בטיחות ביולוגית, לשטוף תאים פעמיים עם HBSS, ולהוסיף מדיום גידול טרי. תאי מקום בC חממת CO 2 37 מעלות.

4. ויזואליזציה של תא חי תכלילים כלמידיה

  1. הסרת תאי GFP-הלה נגוע כלמידיה מCO 2 באינקובטור ולהחליף בינוני עם RPMI ללא FBS% אדומים 5 + פנול.
  2. תאי הר על מיקרוסקופ הפוכה הקרינה (Nikon Eclipse טי-E או דומה) באמצעות מטרת 20X ומעלה שמן.
  3. באמצעות תוכנת הדמיה (Volocity 6 או דומה), ולהתמקד בזיהוי כלמידיה נגועה תאי GFP-הלה: תאים ירוקים המכילים חורים שחורים גדולים (תכלילים כלמידיה).
  4. סמן את מקומות XYZ של אזורים המכילים תאי -infected כלמידיה של עניין באמצעות תוכנת הדמיה (כרךocity 6 או דומה). לבצע זאת על ידי ידני 'הוספת נקודות' ואילו במצב תצוגת XY השלב. באופן זה, קואורדינטות XYZ נשמרות עבור כל מיקום מסומן.
  5. בתיבת הדו-שיח התקנת הרכישה, להגדיר את התוכנה לרכוש ירוק (GFP, cytosol הלה) ואדום (trachomatis mKate2, ג) ערוצים, ובשיעור של מסגרות חדשות לערוץ כל 5 דקות.
  6. לרכוש את התמונה ברצף באמצעות רכישת פרוטוקול נכנס לעיל על ידי לחיצה על "/ לכידה רשומה" הכפתור.

5. Quantitation של פרמטרי צמיחת הכללה בתאים חיים

  1. בזמנים רצויים לאחר זיהום (למשל., 24, 48 HPI) להסיר כלמידיה נגועה תאי GFP-הלה מחממה וההר במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. הערה: מטרת 20X או 40X אוויר עם NA גבוה היא מתאימה ביותר לצלחות 24 גם, ומטרת נפט 40X מומלצת לשקופיות קאמריות. לגדל תאים משני מצע לזה את התחתאיי.
  2. להתמקד בmidplanes של תאים, שבי תכלילים הם בקוטר המרבי שלהם ולהניב קצוות חדים.
  3. לרכוש תמונות לתחומים רבים וב( לפחות 10 בכל טוב) כל אחד; בארות בדרך כלל מייצגות משכפל או משתנים ניסיוניים.
  4. למנות את מספר תכלילים ידני, על ידי עין (תכלילים הם תאים שחורים בתאי ה- GFP-הלה) או להשתמש באלגוריתמי תוכנת הדמיה לזהות באופן אוטומטי ולספור תכלילים.
    1. מצא את תאי ה- GFP-ידי הלה עוצמת הקרינה ("מצא את האובייקטים" הפקודה) ולהתאים את עוצמת סף הקרינה המבוססת על עוצמות יחסי של תאים.
    2. אובייקטי סינון שנבחרו באמצעות הנחיות גודל של שמירה על אלה של יותר מ -5 מיקרומטר 2 בלבד. זה "אוכלוסייה 1 '.
    3. החל "למלא חורים באובייקטים" הפקודה באמצעות "אוכלוסייה 1 'כקלט. צעד זה מייצר "אוכלוסייה 2 '.
    4. "אוכלוסיית 1 'הפחת מ'עמ'opulation 2 'לתשואה חיובית מסומן תכלילים כלמידיה, המיועדים כ'אוכלוסיית 3'.
    5. החל מסנן גודל ל'אוכלוסייה 3 '(הפקודה "אוכלוסיית מסנן'), לאובייקטי שמירת דוגמא יותר מ -25 מיקרומטר 2 לתכלילים בתאים נגועים למשך 24 שעות או יותר. לפעמי זיהום מוקדמות, כגון לפני 18 שעות, מסנן גודל מוגדר לשמור חפצים גדולים יותר מ -4 מיקרומטר 2, כתכלילים אלה הם הרבה יותר קטנים. תוצאות סינון גודל באוכלוסייה של אובייקטים המיועדים כ'תכלילים '.
    6. לחשב נתונים כמותיים מתמונות, למשל, מספר הכללה, גודל הכללה, והיקף הכללה, באמצעות תוכנת הדמיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יכולים להיות מהונדסים תאי יונקים להביע חלבוני ניאון cytosolic (למשל, ה- GFP) כדי לאפשר הארת תכלילים כלמידיה בתרביות תאים חיות, נגועות. על הזיהום בכלמידיה, תכלילים הם בקלות לעין כמו כתמים שחורים בתאי המארח (איור 1). הבהירות של תכלילים חסרי-הקרינה יכולה להיות מנוצלת לזיהוי האוטומטי של תכלילים על פני מספר רב של תחומים מבט ו / או טיפולים (איור 1). ברגע שתאי מארח ניאון כבר נוצרו, עבודה חדשה ורבה עצמה מופעלת לניתוח מהיר, כמותי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים את האסטרטגיה הניסיונית ליצירת תאי מארח ניאון להדמיה בזמן אמת וניתוח של תכלילים כלמידיה. גישה להדמיה vacuole זה מקנה יכולת רבת עוצמה כדי להאיר, לעקוב ולמדוד כמותית את המאפיינים הדינמיים של תכלילים כלמידיה פני אוכלוסיות של תאים או בתאים בודדים לאורך זמן. תכלילים כלמידיה בתאי חלבון הנקראים ניאון מוגדרות בולט היטב, כך שהם מזוהים בקלות ללא הצורך בעיבוד נוסף immunofluorescent. יתר על כן, גישה זו היא רגישה מספיק כדי לפתור את המחלוקות בין חתימה מורפולוגיים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לאיאן קלארק ול-P. Scott Hefty על הפלסמידים pGFP-SW2 ו-pASK-GFP-mKate2-L2, בהתאמה. אנו מודים לפול מילר על הסיוע הטכני ולריצ'רד סטיבנס על משאבים אחרים. עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH AI095603 (KH).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Lipofectamine 2000Invitrogen11668
Opti-MemInvitrogen31985
PolybreneSigmaH9268
0.45 & micro; m מסנניםפישר09-719D
G418Invitrogen10131
HBSSInvitrogen14025
DMEMInvitrogen11995
RPMI 1640Invitrogen11875
RPMI 1640 w/o פנול אדוםCellgro17-105-CV
פניצילין GSigma13752
CycloheximideSigmaC7698
כלי תחתית מזכוכיתMatTekP35G-1.5-14-C
מגלשות קאמריות, Lab-Tek IINunc154526, 154534

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stamm, W. E. Chlamydia trachomatis infections: progress and problems. The Journal of Infectious Diseases. 179, Suppl 2. S380-S383 (1999).
  2. Schachter, J. Infection and disease epidemiology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. Stephens, R. S. , ASM Press. 139-169 (1999).
  3. Campbell, L. A., Kuo, C. C. Chlamydia pneumoniae--an infectious risk factor for atherosclerosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (1), 23-32 (2004).
  4. Darville, T., Hiltke, T. J. Pathogenesis of genital tract disease due to Chlamydia trachomatis. The Journal of Infectious Diseases. 201, Suppl 2. S114-S125 (2010).
  5. Hackstadt, T. Cell biology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. Stephens, R. S. , ASM Press. 101-138 (1999).
  6. Wang, Y., Kahane, S., Cutcliffe, L. T., Skilton, R. J., Lambden, P. R., Clarke, I. N. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector). PLoS Pathogens. 7 (9), e1002258(2011).
  7. Hackstadt, T., Scidmore, M. A., Rockey, D. D. Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids to the chlamydial inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
  8. Boleti, H., Ojcius, D. M., Dautry-Varsat, A. Fluorescent labelling of intracellular bacteria in living host cells. Journal of Microbiological Methods. 40 (3), 265-274 (2000).
  9. Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11430-11435 (2007).
  10. Heinzen, R. A., Hackstadt, T. The Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuolar membrane is not passively permeable to low-molecular-weight compounds. Infection and Immunity. 65 (3), 1088-1094 (1997).
  11. Wickstrum, J., Sammons, L. R., Restivo, K. N., Hefty, P. S. Conditional gene expression in Chlamydia trachomatis using the tet system. PLoS One. 8 (10), 10-1371 (2013).
  12. Chin, E., Kirker, K., Zuck, M., James, G., Hybiske, K. Actin recruitment to the Chlamydia inclusion is spatiotemporally regulated by a mechanism that requires host and bacterial factors. PLoS One. 7 (10), e46949(2012).
  13. Agaisse, H., Derré, I. A C. trachomatis cloning vector and the generation of C. trachomatis strains expressing fluorescent proteins under the control of a C. trachomatis promoter. PLoS One. 8 (2), e57090(2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Chlamydia InclusionFluorescent Host CellsLive Fluorescence MicroscopyInclusion Growth DynamicsReverse Imaging StrategyGFP Hela CellsInclusion QuantitationChlamydia SpeciesInclusion MembraneMicroscope Analysis Software

מאמרים קשורים