מאמר שיטה

אנושי עכבר מודל ללמוד זיהומים חיידקיים מיקוד microvasculature

DOI:

10.3791/51134

⸱

1 באפריל 2014

 ,  , 
1INSERM U970, Paris Cardiovascular Research Centre, 2Faculté de Médecine Paris Descartes, Université Paris Descartes

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

meningitidis Neisseria הוא הפתוגן ספציפי אדם שמדביק את כלי דם. בפרוטוקול זה microvessels אדם מוכנס בעכבר על ידי השתלת עור אנושי על עכברי חיסון. חיידקים לדבוק בהרחבה לכלי האנושי, שהובילו לניזק והתפתחות כלי דם של הפריחה purpuric נצפתה בדרך כלל במקרים של בני אדם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neisseria meningitidis גורם לאלח דם חמור, לעתים קרובות קטלני כאשר הוא נכנס לזרם הדם של בני האדם. זיהום גורם לנזק נרחב של כלי הדם וכתוצאה מכך הדליפה של כלי דם, ההתפתחות של פריחות purpuric ונימק רקמות סופו של דבר. לומד בפתוגנזה של זיהום זה היה מוגבל בעבר על ידי האדם ספציפי של החיידקים, מה שהופך במודלי vivo קשה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים מודל אנושי לזיהום זה שבו עור אנושי, המכיל microvessels עורי, הוא מורכבים על עכברי מדוכאי חיסון. כלים אלה anastomose עם מחזור העכבר תוך שמירה על התכונות האנושיות שלהם. ברגע שהציג למודל, נ 'זה meningitidis לדבוק אך ורק לכולים האנושיים, וכתוצאה מכך לנזק רב בכלי דם, דלקת ובמקרים מסוימים להתפתחות של הפריחה purpuric. פרוטוקול זה מתאר את שלבי השתלה, זיהום והערכה של מודל זה בקונטהXT של נ ' זיהום meningitidis. הטכניקה עשויה להיות מיושמת לפתוגנים ספציפיים אדם רבים כי להדביק את זרם הדם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אלח דם קרום המוח הוא זיהום בדם נולד לעתים קרובות קטלני הנגרם על ידי meningitidis Neisseria פתוגן החיידקים. חולי אלח דם קרום מוח לעתים קרובות בהווה עם פריחה petechial או purpuric על העור שלהם שהעבר היה קשור להרס של כלי דם נגרמים על ידי חיידקים במחזור ומוצרי חיידקי 1. ביופסיות עור של חולים קליניים מראות חיידקים הקשורים microvessels, לעתים קרובות ממלאים את כלי 2. מלבד דליפת חיידקים, פקקת נרחב, קרישה, גודש כלי דם ונראה באזורי purpuric 3-5. נזק בכלי דם זה יכול להוביל לנימק נרחב של העור ורקמות הסובבות, וכתוצאה מהטריה ואפילו קטיעה בניצולי קרום מוח. הבנה כיצד זיהום גורם לניזק בכלי דם זה חשוב כדי לייעל את אסטרטגיות מניעה וטיפול. רוב המחקר על אלח דם קרום המוח שבוצע במבחנה עלשורות תאים אנושיות בשל הייחוד האנושי של נ ' meningitidis. היבטים של זיהום רבים כבר למדו במבחנה כולל הידבקות חיידקים, תגובת תא מארחת, כמו גם תגובת ציטוקינים 6-9. פילי סוג IV (פריון כולל) היו מעורבים כאברון הידבקות הגדול לנ ' meningitidis משני תאי אפיתל ואנדותל 10. זה גם הוכח שהידבקות של נ ' meningitidis לארח תאים הוא מאמץ גזירה תלוי ולכן הוא חשב להיות קשור לשיעורי זרימת דם בנימי הדם 11. הדבר מצביע על הלחצים הדינמיים החיידקים להתמודד in vivo הם קריטיים להיווצרות מחלה. זה אולם קשה מאוד למודל המיקרו של כלי דם קטנים במבחנה.

קולט ההידבקות לNeisseria הפריון כולל עדיין אינו ידוע, ולכן לא ניתן בחזון אסטרטגיות לדפוק בלהשיג הידבקות חיידקים במודל חיה בשלב זה. CD46 הוצע להיות קולט הפריון כולל ובעלי החיים מהונדסים יוצרו לפעול כמודלים עכבר. עם זאת, זיהום בבעלי החיים אלה אינו מוביל לזיהום נרחב או לפריחת 12,13 פיתוח. מודלים של בעלי חיים אחרים, שתוארו להיבט קטרמיה של זיהום Neisseria לקחת בחשבון את העדפת החיידקים לtransferrin אנושי כמקור ברזל 14,15. כך או להשלים transferrin אדם או להביע אותו מתוצאות transgene בעומס חיידקים גדל בזרם הדם על פני תקופת זמן ממושכת, אבל מודל זה לא מראה הידבקות חיידקים או התפתחות הפריחה 16,17.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים מודל עכבר אנושי שבו עור אדם, כולל נימי דם עורי, הוא הושתל על עכברי מדוכאי חיסון 18,19. התוצאה היא כלי אנושי פונקציונלי, perfused עם מחזור העכבר. , מ 'בשילוב עם תוספי transferrin האנושי הזהאודל מהווה לפחות שני ההיבטים הספציפיים האדם של נ ' meningitidis, כלומר האנדותל אנושי וtransferrin אדם, בסביבה בvivo. נ meningitidis הציג לווריד למודל זה לדבוק במיוחד כדי האנדותל האנושי, ייצור פתולוגיה כי הוא דומה למה שדווח בחולים קליניים, כוללים נזק בכלי דם והתפתחות הפריחה purpuric 18.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. סיכונים והרשאות

  1. ועדות אתיקה מקומיות חייבים לאשר את כל הפרוטוקולים של בעלי החיים. פרוטוקול זה נערך בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי התקנות צרפתיות ואירופאיות לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה (87-848 Décrets, 2,001-464, 2001-486 ו2,001-131 ו הדירקטיבה אירופאית 2010/63/UE) ואושר על ידי ועדת האתיקה המקומית Comité d'en Ethique matière d'הניסויים animale, אוניברסיטת פריז דקארט, פריז, צרפת. No: CEEA34.GD.002.11.
  2. לעור אנושי, שנכתבה הסכמת מטופל הודיעה הושגה וכל ההליכים בוצעו על פי קווים מנחים לאומיים צרפתים ואושרה על ידי ועדת האתיקה המקומית, Comité d'הערכת Ethique de l'INSERM IRB 00003888 FWA 00005881, חוות דעת פריז, צרפת: 11-048 .
  3. meningitidis נ 'הוא הפתוגן אנושי מזיק ויש לנקוט בכל אמצעי הזהירות הנדרש בעת טיפול organism. אמצעי זהירות אלה כוללים חיסון ועובד תחת רמת בטיחות ביולוגית 2 תנאים.

2. השתלת עור

  1. אסוף עור אנושי קרוב להשתלת זמן ככל האפשר. רוב העור בעבודה זו מגיעה מניתוחים פלסטיים הכוללים את אזור הבטן. מקורות אחרים, כגון שד, רגל ואפילו פנים כבר בשימוש בהצלחה.
  2. הכן את דגימת העור האנושית על ידי ניקוי פני השטח עור עם EtOH 70% ומשקרים אותו שטוח על פני השטח נוקה היטב, רצוי מתחת למכסה המנוע לזרום.
  3. פורסים 200-400 מיקרומטר פרוסות מהחלק העליון של העור באמצעות dermatome עם עובי קבוע מראש.
  4. בדקו את פרוסות עור לשלמות ולחתוך אותם ל2 ס"מ X 2 סנטימטר ריבועים, ואז למקם ב-PBS (ללא קטיונים דו ערכיים) אם השתלה באופן מיידי או על 4 מעלות צלזיוס בDMEM עם סרום 10% עבור אחסון לטווח קצר (שעה 3-12 ).
  5. לטשטש 6-8 עכברים בשבוע ישן SCID.bg (כ 20 ז) עם קטמין (100 מ"ג / קילוגרם) וinje Xylazine (10 מ"ג / קילוגרם)ip cted
  6. ברגע שהעכברים הם מורדמים, לבדוק לתגובת כאב על ידי ביצוע קמצוץ הבוהן, שיטה סטנדרטית להקמת רפלקס כאב. החל ג'ל לעיניים כדי למנוע התייבשות של קרנית ולגלח את צד השמאל של החיה מאחורי הכתף, שבו השתל ימוקם. שמור חם עכבר על משטח חום לאורך כל ההליך.
  7. לאחר ההכנות לקראת עכבר לניתוח, לנקות את האזור המגולח עם EtOH 70%.
  8. להחיל הרדמה מקומית למריחה לאתר השתל (Tronothane) ולהכין את אתר השתל על ידי הסרת השכבה השטחית של עור עכבר עם זוג מספריים מעוקלים בזהירות. היזהר שלא לשבש את כלי הדם הבסיסיים.
  9. הסר את העור באזור קצת יותר קטן באזור של פרוסת העור האנושית.
  10. הסר פרוסת עור מPBS (או DMEM) ולמקם את השתל מעל המיטה, כדי להבטיח את צד אפידרמיס הוא פונה כלפי מעלה. צעדים 2.8-2.10 צריכים להתבצע מהר ככל האפשר, כדי להבטיח את מיטת השתל לא להתייבש.
  11. יישר פינה אחתאו קצה ולתקן עם דבק רקמות. להתאים בזהירות את שאר פרוסת העור למיטת השתל, הצבת כמויות קטנות של דבק רקמות מסביב לקצוות. תמיד לקצץ את העור האנושי לגודל ולא להפוך את מיטת השתל גדולה יותר.
  12. לא למשוך את העור הדוק מדי על מיטת השתל כמו העור של העכבר הוא מאוד גמיש.
  13. ודא את השתל קבוע עם דבק רקמות בכל פינה.
  14. נקה את האזור עם תמיסת יוד.
  15. החל פלסטר עם אזור הכרית מעל השתל. ודא פלסטר הוא חברה אבל לא חזק ושנשימתו של בעל החיים אינה מושפעת.
  16. תקן פלסטר עם קלטת הלבשה.
  17. לאפשר החיה להתאושש על משטח חם.
  18. ברגע ער, להחזיר את בעל החיים לכלוב שלה. בעלי חיים הם שוכנו 2-3 לכלוב.
  19. בדקו עכברים באופן קבוע במהלך התאוששות לסימנים של כאב או מצוקה. 10-14 ימים לאחר ההשתלה, להסיר פלסטר, נזהר שלא לשבש את השתל. מניסיוננו כאב לאחר ניתוח הוא מיניmal. אף על פי כן צריכים להיות במעקב בעלי חיים כל יום ובמיוחד בכמה הימים הבאים מבצע. קריטריונים לכאב או מצוקה הם את הדברים הבאים.
    • ירידה במשקל של מעל 10%
    • מראה חיצוני, פרווה, עמדה גיבנת, עיניים
    • שיעורי נשימה או לב מוגבר
    • תנועות מתחלש או יוצאות דופן.
    • עלייה בטמפרטורת גוף
    • paracetamole במקרה סימנים של כאב מזוהים ניתן דרך הפה (300 מ"ג / קילוגרם, כל שעה 4). נקודות קצה הומניות הם דבקו בקפדנות אם הכאב נמשך.
  20. אם השתל נראה יבש להחיל שמן תינוקות כל 2-3 ימים כדי לשמור על גמישות העור.
  21. השתל הוא מוכן להודעה 21 ימי ניסויים שתל.

3. זיהום

  1. היום לפני הזיהום, להכין זן חיידקים על ידי פסים על גבי צלחות אגר GCB עם אנטיביוטיקה מתאימה. לגדול בין לילה ב 37 ° C ב 5% CO 2.
  2. הכנת חיידקים
    1. חיידקי Reinoculate לתוך 5 מיליליטר של תקשורת SFM האנדותל אדם עם סרום 10% ל OD 600 0.05.
    2. דגירה תוך רעד במשך שעה 2 באינקובטור (37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2) עם מכסה רופף, עד שצפיפות חיידקים של כ 600 OD 0.1.
    3. צנטריפוגה חיידקים במשך 3 דקות 15,000 סל"ד.
    4. הסר supernatant ו resuspend ב PBS, אז צנטריפוגות שוב.
    5. חזור על השלב לשטוף (2.2.4-2.2.5) פעמיים.
    6. Resuspend גלולה חיידקים ב-PBS.
    7. מדוד OD 600.
    8. הפוך תרבות של או OD 600 0.1 (10 8 CFU / מיליליטר), או 600 OD 1.0 (10 9 CFU / מיליליטר). מריכוז ידוע זו, לדלל ל10 7 CFU / מיליליטר. נסה להכין חיידקים קרובים לזמן הזרקה ככל האפשר.
  3. עכברים
    1. שוקל עכברים.
    2. ip לטשטש עכברים עם קטמין (100 מ"ג / קילוגרם) וXylazine (10 מ"ג / קילוגרם) שהוחדר
    3. ברגע שנרדם, גלעזאזל כי תגובת הכאב נעדר ידי הבוהן קמצוץ, לשמור על העכברים חמים עם כרית חום ולשים משחת עיניים על מנת למנוע התייבשות.
    4. תן לכל עכבר 8 מ"ג של transferrin האנושי, resuspended בתמיסת מלח או PBS, הזריק ip
    5. קח טיפה קטנה של דם מהזנב והתפשט על גבי צלחת אגר כדי לבדוק את הדם הוא סטרילי לפני ההדבקה.
    6. הזרק 100 μl 10 7 CFU / מיליליטר תרבות חיידקים (10 6 סך הכל CFU) לווריד דרך וריד רטרו מסלולית או זנב. מדידות של CFU לקחו 5 דקות לאחר הזרקה עקביות ללא קשר לזריקה.
    7. אחרי כמה דקות, לגזור זנב והתפשט בדגימת דם על גבי צלחות אגר עם אנטיביוטיקה מתאימה עם אחד דילול של פי 10 להקים CFU דם בעקבות הזיהום באופן מיידי.
    8. חותם את הזנב עם דבק רקמות.
    9. לאחר הזרקה, לדלל את הבידוד החיידקים ולהפיץ על גבי צלחות אגר עם אנטיביוטיקה מתאימה להקים CFU.
    10. לאפשר לעכבריםכדי להתאושש על כרית חום עד שהם למעלה ונעו
    11. בשעת 6 שלאחר זיהום שעה למשוך כמות קטנה של דם מהזנב, לדלל וצלחת להקים CFU ב 6 שעות.
    12. דגירה כל הצלחות אגר על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 בלילה.

4. הקרבה

  1. בזמן שנבחר לזיהום, לטשטש את העכברים עם קטמין (100 מ"ג / קילוגרם) וXylazine (10 מ"ג / קילוגרם) הזריק ip
  2. ברגע שנרדם, לשמור על חם עכבר עם כרית חום.
  3. כאשר רפלקס הכאב נעלם (הבוהן קמצוץ), לגזור קצה זנב ולהקיז דם.
  4. מורחים דם על גבי צלחות אגר עם אנטיביוטיקה מתאימה; דילול 1:10 5 μl ישיר ו10 μl להקים CFU.
  5. להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם.
  6. לאחר להקריב את העכבר על פי כל ההנחיות מוסדיות ואתיות הרלוונטיות, לאשר מוות על ידי עדר של פעימות לב. ביצוע חתך קו האמצע, לחתוך דרך כלוב צלעות, ועושה חתך בשומעלא.
  7. לאסוף כמה שיותר דם ככל האפשר מהלב / חלל החזה והמקום בצינור סטרילי.
  8. הסרת איברים (למשל כבד, טחול, מוח) לתוך צלחת סטרילית.
  9. הסר את שתל העור וקטע מעור של עכבר לתוך צלחת סטרילית.
  10. השלך את גוף העכבר.
  11. אחרי הדם שנאסף כבר מותר להיקרש במשך 15 דקות, צנטריפוגות זה 15 דקות ב 3,000 סל"ד.
  12. הסר את הפלזמה מהדם ולאחסן ב -80 ° C לניתוח מאוחר יותר, למשל לגילוי ציטוקינים על ידי שיטות מבוססות ELISA או FACS.

5. ספירת האיברים CFU

  1. שוקל מאחדים צינורות המכילים 500 μl של PBS כל לפני נטילת דגימות ביופסיה.
  2. קח 4 דגימות ביופסיה מ"מ מרקמות באמצעות ביופסית סטרילי.
  3. ביופסיות מקום לתוך צינורות homogenizing preweighed מכילים 500 μl PBS. Homogenize דגימות עור עם 2 חרוזים מ"מ, להשתמש בחרוזים קטנים יותר לאיברים אחרים.
  4. הצב את t שנותרסוגיות בParaformaldehyde 4% (PFA) ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למיקרוסקופיה (ראו להלן).
  5. שוקל מאחדים צינורות המכילים ביופסיות להקים משקל ביופסיה (לחישוב מאוחר יותר של CFU / רקמת מ"ג).
  6. Homogenize דגימות.
    1. Homogenize כבד, בטחול ובמוח, ב6,000 סל"ד במשך 30 שניות.
    2. Homogenize דגימות עור ב6,000 סל"ד במשך 30 שניות וחזור במידת צורך.
  7. מורחים דילולים מצינור אחד שמאחד על גבי צלחות אגר ולגדול בין לילה ב 37 ° C ב 5% CO 2 להקים ספירת CFU איברים.

6. היסטולוגיה / אימונוהיסטוכימיה

  1. קבעון
    1. לתקן הרקמות בPFA 4% בין לילה ב 4 ° C. צעד הקיבעון יכול להיות ארוך יותר, אם אחסון לתקופות ארוכות יותר למקם את הרקמות ב0.25% PFA.
    2. יש לשטוף את הרקמות בPBS ולאחר מכן למקם ב20% תמיסת סוכרוז ולחזור ל4 ° C למשך לילה או עד שהרקמות שקעו בפתרון.
    3. שטוף את הרקמות בPBS, לחתוך לגודל ומקום בפתרון אוקטובר (או בעובש רקמה או דבק לוח בסיס).
    4. במהירות להקפיא את הרקמות על צלחת פטרי מרחף בחנקן נוזלי.
    5. לאחר ההקפאה, לשים את הרקמות על קרח יבש לפני ההעברה ל-80 ° C לאחסון.
  2. פלוח
    1. הסרת רקמות מ-80 מעלות צלזיוס ומאפשר לאזן ל-20 מעלות צלזיוס בcryostat.
    2. רקמות פרוסה בעובי של כ 10-15 מיקרומטר ומניחים על גבי שקופיות מיקרוסקופ מצופים.
    3. חנות מחליקה ב -20 ° C עד צורך.
  3. הכתמה
    1. לאפשר שקופיות להגיע לטמפרטורת חדר.
    2. לצייר סביב הפרוסה בשקופית עם עט הידרופובי. חכה 5-10 דק '.
    3. רעננותם / פרוסת לשטוף בPBS במשך 5 דקות, חזור פעמיים.
    4. Permeabilize פרוס ב0.1% טריטון ב PBS עבור 10 דקות.
    5. שטוף בPBS 2-3x במשך 5 דקות.
    6. בלוק ב-PBS0.1% BSA 1% טריטון לבין 10-60 דקות בהתאם לנוגדנים או הכתם לשמש.
    7. הסר את חסימת חיץ ולהוסיף נוגדן ראשוני המדולל כפי שנדרש במאגר בלוק. דגירה במשך זמן שנקבע. (לעתים קרובות 1 שעות בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 מעלות צלזיוס).
    8. שטוף בPBS 2-3x במשך 5 דקות.
    9. החל נוגדנים משני בדילול מלא כמתאים במאגר בוק; DAPI כלול בדרך כלל בשלב זה. דגירה לזמן שנקבע, לעתים קרובות 1-2 טמפרטורת חדר שעות, בחושך.
    10. שטוף בPBS 2-3x במשך 5 דקות.
    11. הר בלדעוך הגנה על תקשורת הרכבה עם מכסה זכוכית ולאטום עם מסמר לכה.
    12. מוכתמות שקופיות תמונה באופן מיידי או בחנות ב 4 ° C.
    13. לבצע הדמיה עם מיקרוסקופיה confocal או הניאון להגדיר עם מסננים / לייזרים מתאימים לfluorophores בשימוש.
  4. היסטולוגיה
    1. לאפשר שקופיות שישמשו להיסטולוגיה כדי להגיע לטמפרטורת חדר.
    2. שקופיות כתם באמצעות כפרוטוקול מכתים hematoxylin tandard / eosin.
      1. מניחים את השקופיות במעמד שקופיות.
      2. העבר את המדף עם מגלשות בין פתרונות לפי הסדר הבא:
      3. 2 שניות למים זורמים מברז.
      4. 3 דקות בפתרון hematoxylin מסוננת.
      5. 10 שניות למים זורמים.
      6. 10 שניות למים מזוקקים.
      7. 10 שניות ל100% אתנול.
      8. 2 שניות לeosin מסונן.
      9. 10 שניות למים זורמים.
      10. 10 שניות ל100% אתנול
      11. 2 דקות לקסילן x 3 (אני אמבטיה, II, III).
      12. להעביר באופן מיידי ולהוסיף כמה טיפות של דבק קיבעון על כל שקופיות, להחליק לכסות מקום על גבי, להסיר בועות אוויר, לתת להתייבש במשך כמה שעות.
      13. תמונה מחליקה תחת מיקרוסקופ אור הלבן סטנדרטית.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ספירת CFU

נ זן meningitidis השתמש בתוצאות הנציג אלה הוא נ meningitidis 8013 שיבוט 12, בודד קליני C serogroup, להביע בכיתה אני pilin SB, אופה -, OPC -, PilC1 + / PilC2 + 20. המתח היה שהונדס חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מהכנסה כרומוזומליות 18. ספירת יחידות מושבה להרכיב חיידקים נקבעות על ידי ספירת מספר המושבות על הצלחות אגר וחישוב או CFU / מיליליטר של דם או CFU / מ"ג של רקמה מהכרכים הידועים מצופים. ספירת דם הראתה כי 5 דקות לאחר ההזרקה הרביעית של 10 6 חיידקי CFU היו ממוצעת של 1.5 x 10 5 CFU / מיליליטר במחזור הדם (איור 1 א). לאחר 6 שעות בממוצע הספירות 4.8 x 10 4 CFU / מיליליטר. על ידי 24 שעות הספירה הממוצעת היו 2.4 x 10 4 CFU / מיליליטר אבל בקבוצה זו של 10 עכברים, 5 היואין לגילוי חיידקים במחזור ואילו 5 אחר ספירות גבוהות יחסית (איור 1 א). ספירת CFU שנלקחה דגימות העור להראות את רוב העכברים שיש סעיפים רבים בעור האנושי, עם ממוצע של 2.1 x 10 4 CFU / מ"ג של רקמה ב6 שעות ו4.4 x 10 2 CFU / מ"ג של רקמה ב24 שעות (איור 1) . דגימות עור העכבר הנגדית לא הראו ספירת חיידקים ב24 שעות ומספר נמוך מאוד רק בשעה 6, מפגינה ההעדפה החזקה לנ meningitidis לכלי אדם בעור מורכב (איור 1). באופן כללי ספירת חיידקים היו נמוכה מאוד לnondetectable באיברים האחרים שנדגמו למרות 2 חיות עשו ספירה להראות שניתן לייחס לזיהום מהדם, כפי שהם מתואמים עם גבוהים במחזור מספרי חיידקים (איור 1 ג). גם המודל יכול לשמש כדי לקבוע את התפקיד של גורמים ארסי in vivo, למשל pi הסוג IVli. זני חיידקים עם מוטציות מוגדרות בגן pilD 21, וכתוצאה מזן חסר פריון כולל, כמו גם את גן pilC1 8, חסר 'adhesin' הפריון הכולל המוצע הוכנסו לתוך המודל. מוטציות אלה לא גרמו להידבקות חיידקים בשתל העור האנושי, המאשרות את התפקיד המכריע פריון הכולל הוא משחק בהידבקות בvivo (1D איור).

אימונוהיסטוכימיה / היסטולוגיה

בניסויים אלה השתמשנו בנ זני meningitidis המבטאים חלבון ירוק הקרינה (GFP), כדי לאפשר זיהוי ניאון ללא הצורך בצביעה משנית. כלי אדם הוכתמו באמצעות סמן על האנדותל אנושי, או CD31 (PECAM-1) או agglutinin קטיני Ulex europaeus (UEA) 18,22. UEA היה מצומדת לrhodamine מאפשר צביעת צעד אחד (איורים 2A-C). ניתן להכתים גרעין תאאד עם DAPI כדי לסייע בזיהוי מבני רקמות (איורים 2A-B). היסטולוגיה בוצעה באמצעות צביעת hematoxylin / eosin סטנדרטי. גבול אפידרמיס / עורי של העור היה ברור לזיהוי. דליפת דלקת, פקקת וכלי דם היו מרוכזת לכלי קרובים לשעת גבול 24 זה לאחר ההדבקה (איור 2 ד). פקקת היה גלוי לעין בכמה כלי עורי קטנים, לעתים קרובות מלווים בגודש ודלקת. דליפה של כדוריות דם אדומים מתוך לתוך הרקמות ניתן הייתה לראות, המציין רמה נרחבת של נזק כלי שיט. Histopathology של עור מושתל בעכברי noninfected נראה נורמלי ללא דלקת להבחין 18. בעוד כ30% מזיהומי הידבקות חיידקים בעור מובילה להתפתחות של ארגמנת macroscopically לגילוי (2E דמויות ו2F).

figure-results-1 "5in" עבור: src = /> "/ files/ftp_upload/51134/51134fig1highres.jpg" = "/ files/ftp_upload/51134/51134fig1.jpg" src
איור 1. ספירת CFU. () ספירת החיידקים CFU לכל מיליליטר של דם בדקות 5, 6 שעות, ו24 הודעה hr זיהום. (ב) בקטריאלי CFU סופר מדגימות עור השוואת עור אנושי (HS) ועור של עכבר (MS) בשתי שעות 6 ו24 הודעה hr זיהום. (ג) בקטריאלי CFU סופר מאיברים אחרים נלקחו 24 הודעה hr זיהום. (ד) השוואה בין ספירות CFU חיידקים מדגימות עור אנושיות ועכבר שצולמו ב24 הודעה hr זיהום מעכברים נגועים בנ הסוג בר כתם meningitidis 2C43 (WT), מתח עם מוטציה בגן pilD (pilD) או מתח עם מוטציה בגן pilC1 (pilC1). כל הגרפים מוצגים כנתונים גולמיים בחציון. איור הוא שונה מMelican et al. 18"_blank"> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

figure-results-2
איור 2. הקרנה מיקרוסקופית. (א) לערימת confocal מראה microvessel אנושי מוכתם בקטיני UEA (אדום) קרובים לעורי (ד) גבול אפידרמיס (ה). כלי נגוע בנ meningitidis 2 הודעה hr זיהום (ירוק). (ב) פרוסה אופטית והקרנה פרוסה (C) מראה נ זיהום microcolonies meningitidis (ירוק) כלי אנושי (UEA - אדום) בתוך עור שתל 2 הודעה hr זיהום. (ד) מכתים Haematoxylin / Eosin של שתל עור האנושי נגוע עבור שעות 24 עם נ ' meningitidis. אפידרמיס (ה), גבול עורי (ד) הוא באופן ברור פקקת וגודש של microvess גלויים ונרחבאלס (חיצים) נתפסת בדרמיס. יכולים גם להיות מזוהה דלקת וכמה דליפה של כלי דם (ראש חץ). (ה) שתל עור אדם לפני ההדבקה. אותו שתל העור כשעה לאחר זיהום (E) 24 עם נ '(F) meningitidis מראה אזורי purpuric (חיצים). איורים 2B, 2D, 2E, ו2F הם שונה מMelican et al. 18 לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודלים של בעלי החיים חשובים באופן קריטי למחקר פתוגנזה של חיידקים. אי אפשר לחקות את הסביבה vivo בתרבית תאים באופן מלא וזה הופך להיות ברור כי האינטראקציה המאכסן לפתוגן מושפעת מגורמים דינמיים רבים. הייחוד האנושי של כמה פתוגנים חשובים קליני, כגון נ meningitidis, HIV, HCV, Plasmodium falciparum, חיידקי ליסטריה, וסלמונלה typhi הגביל את השימוש במודלי vivo לזיהומים אלה. עם זאת, כפי שאנו מתחילים להבין שצעדי זיהומיות מעורבים בסגולי, מודלים אנושיים מפותחים. הפרוטוקול המתואר כאן הוא הפגנה של זה עם ההקדמה של microvessels האנושי בעכברים, המאפשר נרחב בזיהום vivo עם נ ' meningitidis, וכתוצאה מכך לנזק בכלי דם ולעתים ההתפתחות של פריחות purpuric.

שימוש במודל זה,אנחנו כבר יכולים להגדיר שמאפייני ההדבקה של פריון הכולל מעורבים בהתישבות בכלי הדם בvivo באמצעות מוטציות בקטריאלי וכי הנזק בכלי הדם מופחת בהיעדר ההידבקות 18. בעבר, מוצרי חיידקים במחזור היו מעורבים בנזק הזה, אבל התוצאות שלנו מצביעות על תפקיד מכריע בהדבקה מקומית וקולוניזציה של כלי דם. זו פותחת אפשרויות חדשות לפיתוח של מטרות טיפול חדשני. אם הידבקות של חיידקים פתוגניים יכולה להיחסם pharmaceutically זה אולי יכול למנוע ההתפתחות של נגעי עור ולהוביל לתוצאות טובות יותר עבור ניצולי קרום מוח במונחים של נמק רקמות, הטרייה וקטיעות. העבודה הוכיחה גם את המורכבות של הזיהום ואת מעורבותם של התגובה החיסונית ומפל קרישה. זיהינו איתות ציטוקינים אדם בסרום של עכברים נגועים למרות הכמות הקטנה יחסית של האנדותל הווה האנושי 18.זה היה רמז לתגובת ציטוקינים משמעותי, יחד עם החדירה של אוכלוסיות תאים חיסוניים עכבר לאזור.

מודלים של בעלי חיים כמובן לא יכולים לשכפל באופן מלא מחלות של בני אדם וכל התוצאות זכו מהם יש לקחת בחשבון עם זה בחשבון. לדוגמא, במודל זה הדם ותאים במחזור הם ממוצא עכבר ולא ניתן לשלול כי הם עשויים להתנהג באופן שונה לתאים אנושיים. יתרון של זה עם זאת, כפי שמודגם בפרסום האחרון שלנו 18, הוא היכולת להבחין שמקורו איתות מהאנדותל האנושי מזה של תאי עכבר במחזור. רקע החיסון של העכברים משמשים במודל זה גם יאפשר את העברת allogenic של אוכלוסיות תאי חיסון אנושיות, והוסיף היבט 'האנשה' נוסף. רקע החיסון של העכברים עשוי עם זאת להסוות תפקיד לנ"ח, T או תאי B, אשר כולם חסרים או פגום במודל זה. שור יחסיתזמן t (24hr) המשמש במודל זה בעיקר נוגע לתגובה המולדת, אך לזיהומים לטווח ארוך והפיתוח של אפשרויות אחרות חסינות ייתכן שיצטרך להיחקר.

העור הוא אתר זיהום חשוב לנ meningitidis אלא שיש כמות קטנה יחסית של כלי אנושיים גם אומר שחיוץ הנתונים לזיהום מערכתי הכולל איברים רבים הוא קשה. בעוד מודל זה מאפשר לחקר התפתחות נגע עורי, צעדים חשובים של זיהום קרום המוח כגון מעבר אפיתל ודם למוח אינם כלולים. יש צורך בפיתוח נוסף של המודלים אנושיים האלה כדי לטפל בהיבטים שונים של זיהום. עם זאת מודל זה מציע פוטנציאל גדול לפתוגנים רבים אדם ספציפיים, במיוחד אלה המתמקדים בכלי הדם.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות לכל החברים במעבדה Dumenil, במיוחד סלקתי סילבה לקריאה ביקורתית של כתב היד. מחלקת הכירורגית בHôpital Europeen ז'ורז' פומפידו-(HEGP), ד"ר דוד Maladry. מיכאל Hivelin וד"ר פטריק Bruneval, פתולוגיה המחלקה בHEGP. מתקן בעלי החיים בPARCC, בראשותו של אליזבת איק. עבודה זו נתמכה על ידי סוכנויות המענק הבאות: אחוות מארי קירי IEF לא. 273,223 (KM), ATIP-Avenir גרנט מINSERM, מענק ציוד CODDIM (Ile de France אזור), FRM (Fondation לשפוך la משוכלל ונדיר médicale) מענק ציוד, המעבדה IBEID של קונסורציום מצוינות, ANR (סוכנות הידיעות Nationale לשפוך משוכלל ונדיר לה) מענק " באגס-בזרימה ". היו הממנים שום תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEMGibco Invitrogen31885-023
פוספט חוצץ מלחGibco Invitrogen10010-056
קטמין 500Virbac צרפתפריט מס' VAL4243
XylazineBayer HealthcareAMM N° FR/8146715 2/1980פריט מס' KPO809S
אופטיגל     Europhta
Lacrigel Medicament Autorisé
TronothaneLisa Pharma
GC agar baseConda1106
Human endothelium SFM mediaGibco Invitrogen11111
סרום בקר עובריP A AA15-101
טרנספרין אנושיSigma-AldrichT3309
UEA לקטין - מעבדותוקטור רודמיןRL-1062
HematoxylinSigma-AldrichH9627
EosinSigma-AldrichE4009
XyleneSigma-Aldrich534056
Sober Hand DermatomeHumeca BV, הולנד4.SB01
דיור לבעלי חייםחדשניM-BTM-C8
(4 מ"מ)דומיניק דוטשר30737
מהיר הכנה ליזינג מטריקס M צינורותMP ביו116923050
MagNA ליזר ירוק חרוזיםRoche3358941001
MagNA LyzerRoche3358976001
VECTASHIELD הרכבה מדיהוקטור מעבדות H-1000
Vetbond3M1469SBרקמות דבק
OCT רקמות tekסאקורה4583
אגרוף ביופסיה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davis, C. E., Arnold, K. Role of meningococcal endotoxin in Meningococcal purpura. J. Exp. Med. 140, 159-171 (1974).
  2. Mairey, E., et al. Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier. J. Exp. Med. 203, 1939-1950 (2006).
  3. Brandtzaeg, P., van Deuren, M. Classification and pathogenesis of meningococcal infections. Methods Mol. Biol. 799, 21-35 (2012).
  4. Guarner, J., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays. Am. J. Clin. Pathol. 122, 754-764 (2004).
  5. Hill, W. R., Kinney, T. D. The cutaneous lesions in acute meningococcemia; a clinical and pathologic study. J. Am. Med. Assoc. 134, 513-518 (1947).
  6. Capecchi, B., et al. Neisseria meningitidis NadA is a new invasin which promotes bacterial adhesion to and penetration into human epithelial cells. Mol. Microbiol. 55, 687-698 (2005).
  7. Merz, A. J., Enns, C. A., So, M. Type IV pili of pathogenic Neisseriae elicit cortical plaque formation in epithelial cells. Mol. Microbiol. 32, 1316-1332 (1999).
  8. Morand, P. C., Tattevin, P., Eugene, E., Beretti, J. L., Nassif, X. The adhesive property of the type IV pilus-associated component PilC1 of pathogenic Neisseria is supported by the conformational structure of the N-terminal part of the molecule. Mol. Microbiol. 40, 846-856 (2001).
  9. Taha, M. K. Neisseria meningitidis induces the expression of the TNF-alpha gene in endothelial cells. Cytokine. 12, 21-25 (2000).
  10. Kirchner, M., Meyer, T. F. The PilC adhesin of the Neisseria type IV pilus-binding specificities and new insights into the nature of the host cell receptor. Mol. Microbiol. 56, 945-957 (2005).
  11. Mikaty, G., et al. Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress. PLoS Pathog. 5, (2009).
  12. Johansson, L., et al. CD46 in meningococcal disease. Science. 301, 373-375 (2003).
  13. Kirchner, M., Heuer, D., Meyer, T. F. CD46-independent binding of Neisserial type IV pili and the major pilus adhesin, PilC, to human epithelial cells. Infect. Immun. 73, 3072-3082 (2005).
  14. Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
  15. Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. Receptors for transferrin in pathogenic bacteria are specific for the host's protein. Can. J. Microbiol. 36, 145-147 (1990).
  16. Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 26, 75-82 (1999).
  17. Zarantonelli, M. L., et al. Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection. Infect. Immun. 75, 5609-5614 (2007).
  18. Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Dumenil, G. Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model. PLoS Pathog. 9, (2013).
  19. Murray, A. G., et al. Human T-cell-mediated destruction of allogeneic dermal microvessels in a severe combined immunodeficient mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 9146-9150 (1994).
  20. Nassif, X., et al. Antigenic variation of pilin regulates adhesion of Neisseria meningitidis to human epithelial cells. Mol. Microbiol. 8, 719-725 (1993).
  21. Geoffroy, M. C., Floquet, S., Metais, A., Nassif, X., Pelicic, V. Large-scale analysis of the meningococcus genome by gene disruption: resistance to complement-mediated lysis. Genome Res. 13, 391-398 (2003).
  22. Ho, M., Hickey, M. J., Murray, A. G., Andonegui, G., Kubes, P. Visualization of Plasmodium falciparum-endothelium interactions in human microvasculature: mimicry of leukocyte recruitment. J. Exp. Med. 192, 1205-1211 (2000).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Neisseria Meningitidis

מאמרים קשורים