מאמר שיטה

מהירה ויעילה דג הזברה Genotyping באמצעות PCR עם רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח

DOI:

10.3791/51138

⸱

5 בפברואר 2014

 ,  ,  ,  , 
1Division of Pediatric Neurology, Department of Pediatrics, University of Utah School of Medicine, 2Department of Neurobiology and Anatomy, University of Utah School of Medicine, 3Interdepartmental Program in Neurosciences, University of Utah School of Medicine, 4Mutation Generation and Detection Core, HSC Core Research Facility, University of Utah School of Medicine, 5Department of Neurology, University of Utah School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PCR בשילוב עם ניתוח ברזולוציה גבוהה להמיס (HRMA) הוא הוכיח כשיטת מהירה ויעילה לגנוטיפ דג הזברה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דג הזברה היא מודל למערכת בעלי חוליות רבת עוצמה ללימוד פיתוח, דוגמנות מחלה, וביצוע הקרנת סמים. לאחרונה מגוון רחב של כלים גנטיים הוכנסו, כולל אסטרטגיות רבות לגרימת מוטציות ויצירת קווים מהונדסים. עם זאת, הקרנה בקנה מידה גדולה היא מוגבלת על ידי שיטות גנוטיפ מסורתיות, אשר גוזל זמן ועבודה אינטנסיבית. כאן אנו מתארים טכניקה לנתח גנוטיפים דג הזברה על ידי PCR בשילוב עם ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה (HRMA). גישה זו היא מהירה, רגישה, ולא יקרה, עם סיכון נמוך יותר של חפצי זיהום. Genotyping ידי PCR עם HRMA יכולה לשמש לעוברים או דגים בוגרים, לרבות בפרוטוקולי הקרנת תפוקה גבוהה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דג הזברה (Danio rerio) היא מערכת מודל חוליות בשימוש נרחבת למחקרים של פיתוח ומודלים מחלה. לאחרונה, טכנולוגיות מהונדסים ומוטציה רבות פותחו עבור דג הזברה. טכניקות transgenesis מהירה, בדרך כלל מבוססות על מערכת transposon Tol2 1, כבר בשילוב עם אפשרויות שיבוט משופרות להרכבת קטע DNA מספר 2. nucleases אבץ האצבע (ZFNs) וnucleases השעתוק כמו activator-מפעיל (TALENs) שימשו למקד לוקוסים בשני תאים סומטיים וgermline ב3,4 דג הזברה. טכניקות אלו יעילות יכולות ליצור בעלי חיים מהונדסים גנטי, עם יצירת מוטציה בתדירות גבוהה וניבט קו תמסורת 3,4.

למרות ההתפתחויות הללו, טכניקות גנוטיפ מסורתיות בדג הזברה להגביל את העצמה המלאה של הכלים mutagenesis וtransgenesis. PCR ואחריו ג'ל אלקטרופורזה, לעתים בשילוב עם restrictioעיכול אנזים n, נעשה שימוש נרחב כדי לזהות שינוי הגנום, אבל הוא גוזל זמן ופחות רגיש לזהות הוספות קטנות או מחיקות. יש מבחני הבדיקה TaqMan עלויות ראשוניות גבוהות ודורשים אופטימיזציה זהירה. רצף של מוצרי ה-PCR יכול לקחת כמה ימים ולא מעשי להקרנה בקנה מידה גדולה. ניתוח פולימורפיזם בר הגבלת אורך (RFLP) יכול רק להפלות SNPs המשפיע על מגוון מצומצם של אתרי הכרת אנזים הגבלה.

ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה (HRMA), שיטת ניתוח סגור צינור שלאחר PCR, היא שיטה שפותחה לאחרונה, כי הוא מהיר, רגיש, זול, ונוח להקרנת מספר גדול של דגימות. HRMA יכול לשמש כדי לזהות SNPs, מוטציות, וtransgenes 5-7. HRMA מבוסס על denaturation תרמית של DNAs פעמיים תקועים, ויש לו כל amplicon PCR דיסוציאציה ייחודית (להמס) אופיינית 5. יכולה להיות מופלים לדגימות לא בשלo ההרכב שלהם שונה נוקלאוטיד, תוכן GC, או האורך, בדרך כלל בשילוב עם צבע פלואורסצנטי שרק נקשר גדילי הדנ"א כפול 8. לפיכך, HRMA יכול להבחין גנוטיפים שונים בהתבסס על המאפיינים להמיס עקומה השונות. בגלל HRMA משתמש ריאגנטים עלות נמוכה והוא תהליך שלאחר PCR בשלב יחיד, ניתן להשתמש בו לאסטרטגיות תפוקה גבוהה. HRMA הוא הורסות, כך שלאחר ניתוח amplicons PCR יכולה לשמש ליישומים אחרים. HRMA הוחל באורגניזמים רבים ומערכות, כוללים שורות תאים, עכברים ובני אדם 9-11. לאחרונה השימוש בו כבר תאר בדג זברה כדי לזהות מוטציות הנגרמות על ידי nucleases אצבע אבץ (ZFNs) וTALENs 6,12,13.

במאמר זה, אנו מתארים כיצד לבצע HRMA PCR מבוסס בדג זברה עוברית ובוגרת (איור 1). פרוטוקול זה מתאים לאיתור SNPs, transgenes, ומוטציות, ובכלל זה siשינויי ngle בסיס זוג, הוספות או השמטות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ה-DNA הכנה

  1. הכן מאגר תמוגה-DNA: 50 מ"מ KCl, 10 מ"מ טריס-HCl pH 8.3, 0.3% Tween 20, NP40 0.3%. להוסיף טרי proteinase K לריכוז סופי של 1 מ"ג / מיליליטר ביום של שימוש 12.
  2. אוסף רקמות:
    1. לקליפ סנפיר דגים הבוגר:
      1. הרדימי דגים: מניחים את הדג ב0.004% MS-222 פתרון (tricaine). חכה עד שתנועת זימים מאטה.
      2. שים את הדג על ערימה של 5-10 Kimwipes ולחתוך חתיכה קטנה של סנפיר הזנב, על 2-3 מ"מ, בסכין גילוח סטרילית.
      3. במהירות למקום הדגים במכל שכותרתו עם מים טריים להתאוששות; לתייג גם את המכל וצינור מקביל שיכיל את הקליפ הסנפיר בזהירות. להחליף את המים ולהאכיל את הדגים כל יום אחר.
      4. תרים את הקליפ הסנפיר עם קצה פיפטה סטרילית ולהעביר אותו לתוך צינור מלא ב100 מאגר תמוגה DNA μl.
      5. מחק את קצה פיפטה, וזורקים את סכין הגילוח לתוך מיכל חד.
    2. לקליפ זנב עובר:
      1. הנח עוברים ל0.004% MS-222 פתרון (tricaine). לחכות 2 דקות.
      2. חותכי חתיכה של זנב עם מלקחיים תחת מיקרוסקופ לנתח.
      3. שים את הזנב לתוך צינור שכותרתו מלא ב30 מאגר תמוגה DNA μl.
      4. במהירות הכניס את העובר לתוך צינור המכיל 100 paraformaldehyde μl 4%.
      5. צינורות לייבל עם עוברים וצינורות הזנב המקביל שלהם.
      6. אחסן את הצינורות עם עוברים על 4 מעלות צלזיוס למשך לילה קיבעון.
      7. נקה את המלקחיים באמצעות מים מילי-Q וKimwipes בין כל עובר כדי למזער את הזיהום.
    3. לכל עוברים:
      1. הנח עוברים ל0.004% MS-222 פתרון (tricaine). לחכות 2 דקות.
      2. שים 1-5 עובר בצינור מלא ב100 מאגר תמוגה DNA μl. Dechorionation אינו הכרחי.
  3. עיכול ה-DNA
    דגירה צינורות עם (קליפים סנפיר או זנב או עוברים) רקמה על 55 מעלות צלזיוסעבור 4 שעות עד 12 הלילה.
  4. להשבית proteinase K
    צינורות חום ל-C ° 95 15 12 דקות. ה-DNA צריך לשמש עבור PCR באופן מיידי, או מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים.

2. PCR

  1. Primers עיצוב באופן ידני או על ידי תוכנת עיצוב פריימר (למשל Lightscanner פריימר עיצוב תוכנת Biofire). מוצרי ה-PCR לHRMA הם בדרך כלל 50-200 נ"ב; מוצרי ה-PCR לגילוי SNP צריכים להיות, בדרך כלל 50-80 נ"ב קטן יותר.
  2. PCR
    1. מבצע תגובת PCR בצלחת 96 היטב או 384 גם.
    2. השתמש 10 μl נפח כולל: 4 תמהיל μl LightScanner מאסטר (0.1 U חם להתחיל תקי-AB פולימראז, חיץ, 0.2 dNTPs מ"מ, כלוריד 2 מ"מ מגנזיום, ו1x צבע מחייב גדילי הדנ"א כפול ניאון); 5 pmol כל צבע יסוד, ותבנית הדנ"א הגנומי μl 1 חולץ מסנפיר זנב מבוגר או 3 הדנ"א הגנומי μl מזנב עוברי 13.
    3. דגימות כיסוי עם 30 שמן מינרלי μl.
    4. מכסה את הצלחת עם חותם דבק אופטי שקוף.
    5. לייעל את תנאי תנאים טיפוסיים רכיבה על אופניים PCR הם 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו30 מחזורים של 10 שניות ב 95 מעלות צלזיוס, 25 שניות ב 60 ° C, 30 שניות ב72 מעלות צלזיוס, שהסתיימו עם 95 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות ומקוררות 15 ° C.
    6. צלחות PCR חנות ב 4 מעלות צלזיוס או להמשיך ישירות לHRMA.
    7. לאשר המוצר ה-PCR שלנו על ידי ניתוח של הגודל שלה באמצעות ג'ל אלקטרופורזה agarose במהלך אופטימיזציה ראשונית של ה-PCR, ואם הצביע, על ידי רצף של המוצר ה-PCR.

3. HRMA

  1. צלחות חום
    1. מניחים צלחת במערכת ניתוח להמיס.
    2. פתח את התוכנה (LightScanner תוכנה התקשר-IT 2.0).
    3. צלחות חום 60-95 ° C.
    4. ליצור קובץ אחסון נתונים חדש.
  2. לנתח נתונים HRMA (איור 2).
    שלבים מרובים של ניתוח הם אפשריים. אנחנו מראים את הסט הנפוץ ביותר של m נתוניםanipulations.
    1. הגדרת משנה
      לחץ על כרטיסיית משנה. בחר את הבארות עם דגימות.
    2. נורמליזציה
      1. בחר בכרטיסייה לנרמל בפנל השמאלי. לחסל את שונות הקרינה, מיקום באופן ידני כפול הקו המקביל בטרום (ראשוני) ואזורים שלאחר להמיס (סופי) כפי שמודגם (איור 2C, ראשי חץ) ולנרמל את אותות premelt וקרינה שלאחר להמיס של כל הדגימות ל1 ו 0 , בהתאמה 14.
      2. התאם את המיקום של הקווים כך שהאזור להמיס הוא בתחום שבין לפני ואחרי להמיס הקווים, אך לא נבחר. באופן כללי, מינימלי הנמוך יותר ויותר מקסימום (והמינימום עליון ועליון מקס) צריכים להיות ממוקמים קווי טמפרטורה כ 1 ° C לגזרים.
      3. בחר עמדות טמפרטורה לנורמליזציה כאלה שיש להם את כל הדגימות (100%) הקרינה המרבית או מלאה לאזור premelt והמינימום או לא (0%) הקרינה לאזור שלאחר להמיס (כמיטב possible). נורמליזציה צריכה לגרום לקו כמעט אופקי בקרינה המרבית של 1 המשתרעת עד לנקודה שנמסה ולאחר מכן קו כמעט אופקי מהנקודה להמיס בקרינה המינימלית של 0; לא צריכה להיות רמות הקרינה מעל 1 או מתחת 0 . לדוגמא, באיור 2C, לנרמל את קימורי premelting באמצעות טווחי טמפרטורה של 79-80 ° C.
    3. קיבוץ / קיבוץ באשכולות
      להבחין גנוטיפים המבוססים על טמפרטורת ההתכה שלהם (איור 2 ג, קופסא ירוקה). בחר קיבוץ.
      1. בחר Autogroup מרשימת בחירת התקנים תחת סעיף הקיבוץ.
      2. בחר רגיל או גבוה להתכת פרופילים עם מעברים בודדים או מעברים מרובים בהתאמה מרשימת בחירת הרגישות תחת סעיף הקיבוץ.
      3. Compute בחרקבוצות תחת סעיף הקיבוץ.
      4. עבור לתפריט הקובץ ולחץ על השמירה כדי לשמור את התוצאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול ניתן לבצע במהלך יום אחד או פרוד בשלבים על פני כמה ימים (תרשים זרימה של עבודה מוצג באיור 1). מיצוי DNA אחריו להמיס וניתוח של amplicons ה-PCR. הטמפרטורות ללהמס של amplicon תלוי בגודל וGC-התוכן, אבל בדרך כלל מתחילות וטמפרטורות סוף 50 ˚ C ו 95 ˚ C מתאימות (2A דמויות ו2B). ברגע שלהמס מתבצע, הניתוח של העקומות להמיס הקרינה בדרך כלל דורש נורמליזציה של הווריאציה של עקומות מדגם השונות, תוך שימוש מראש ובאזורים שלאחר להמיס כתקנים (איור 2 ג)....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PCR בשילוב עם HRMA הוא טכנולוגיה רבת עוצמה לגנוטיפ דג הזברה. היתרונות של גישה זו הם המהירות שלו, חוסן, ורגישות לזיהוי מוטציות אפילו נקודה. כל הפרוטוקול, מניתוח כדי להמס עקומת סנפיר קליפ, יכול להתבצע תוך פחות משמונה שעות על ידי אדם אחד. בנוסף, הטכניקה היא נוחה להקרנת תפוקה גבוהה; אינו מחייבת את השימוש במתיל בethidium; ואטום לכל PCR וצעדי ניתוח אשר מסייע למזער את בעיות זיהום.

צעד קריטי לטכניקה זו הוא amplicon PCR ו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לחברים של מעבדות Blaschke, גרינוולד, וWittwer לקבלת ייעוץ וסיוע טכני. עבודה זו נתמכת על ידי קרן PCMC, NIH R01 MH092256 וDP2 MH100008, והמצעד הפרוטות קרן # מענק מחקר 1-FY13-425, לJLB.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
100 Reaction LightScanner Master MixBioFireHRLS-ASY-0002www.biofiredx.com
מעטפת קשיחה PCR 96 בארות BLK/WHT לוחותBio-Rad מעבדותHSP9665
www.bio-rad.com אטמי דבק Microseal 'B' מעבדותBio-RadMSB1001 www.bio-rad.com
מכשיר LightScanner 96 בארותBioFireLSCN-ASY-0040www.biofiredx.com
תוכנת LightScanner עם Call-IT 2.0BioFirewww.biofiredx.com
ניתוח התכה ברזולוציה גבוהה 2.0BioFirewww.biofiredx.com
LightScanner תוכנת עיצוב פריימרBioFirewww.biofiredx.com
וקטור NTI תוכנהInvitrogenwww.invitrogen.com
Tricaine
פרפורמלדהיד

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  2. Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  3. Sander, J. D., Cade, L., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
  4. Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
  5. Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening. Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).
  6. Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), (2012).
  7. Liew, M., Pryor, R., et al. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons. Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).
  8. Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes. Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).
  9. Carrillo, J., Martínez, P., et al. High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita. Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).
  10. Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping. PloS one. 7 (9), (2012).
  11. Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method. J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).
  12. Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).
  13. Xing, L., Hoshijima, K., et al. Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding. PloS one. 7 (8), (2012).
  14. Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns. BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).
  15. Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping. Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).
  16. Wittwer, C. T. High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen. Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).
  17. Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples. BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).
  18. Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Zebrafish GenotypingPCR AnalysisHigh resolution MeltDNA ExtractionMelt Curve AnalysisGenotyping ProtocolFluorescent ProbePCR CyclingTemperature NormalizationGenotype Detection

מאמרים קשורים