מהירה ויעילה דג הזברה Genotyping באמצעות PCR עם רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח

דג הזברה (Danio rerio) היא מערכת מודל חוליות בשימוש נרחבת למחקרים של פיתוח ומודלים מחלה. לאחרונה, טכנולוגיות מהונדסים ומוטציה רבות פותחו עבור דג הזברה. טכניקות transgenesis מהירה, בדרך כלל מבוססות על מערכת transposon Tol2 ^1, כבר בשילוב עם אפשרויות שיבוט משופרות להרכבת קטע DNA מספר ^2. nucleases אבץ האצבע (ZFNs) וnucleases השעתוק כמו activator-מפעיל (TALENs) שימשו למקד לוקוסים בשני תאים סומטיים וgermline ^ב3,4 דג הזברה. טכניקות אלו יעילות יכולות ליצור בעלי חיים מהונדסים גנטי, עם יצירת מוטציה בתדירות גבוהה וניבט קו תמסורת ^3,4.

למרות ההתפתחויות הללו, טכניקות גנוטיפ מסורתיות בדג הזברה להגביל את העצמה המלאה של הכלים mutagenesis וtransgenesis. PCR ואחריו ג'ל אלקטרופורזה, לעתים בשילוב עם restrictioעיכול אנזים n, נעשה שימוש נרחב כדי לזהות שינוי הגנום, אבל הוא גוזל זמן ופחות רגיש לזהות הוספות קטנות או מחיקות. יש מבחני הבדיקה TaqMan עלויות ראשוניות גבוהות ודורשים אופטימיזציה זהירה. רצף של מוצרי ה-PCR יכול לקחת כמה ימים ולא מעשי להקרנה בקנה מידה גדולה. ניתוח פולימורפיזם בר הגבלת אורך (RFLP) יכול רק להפלות SNPs המשפיע על מגוון מצומצם של אתרי הכרת אנזים הגבלה.

ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה (HRMA), שיטת ניתוח סגור צינור שלאחר PCR, היא שיטה שפותחה לאחרונה, כי הוא מהיר, רגיש, זול, ונוח להקרנת מספר גדול של דגימות. HRMA יכול לשמש כדי לזהות SNPs, מוטציות, וtransgenes ^5-7. HRMA מבוסס על denaturation תרמית של DNAs פעמיים תקועים, ויש לו כל amplicon PCR דיסוציאציה ייחודית (להמס) אופיינית ^5. יכולה להיות מופלים לדגימות לא בשלo ההרכב שלהם שונה נוקלאוטיד, תוכן GC, או האורך, בדרך כלל בשילוב עם צבע פלואורסצנטי שרק נקשר גדילי הדנ"א כפול ^8. לפיכך, HRMA יכול להבחין גנוטיפים שונים בהתבסס על המאפיינים להמיס עקומה השונות. בגלל HRMA משתמש ריאגנטים עלות נמוכה והוא תהליך שלאחר PCR בשלב יחיד, ניתן להשתמש בו לאסטרטגיות תפוקה גבוהה. HRMA הוא הורסות, כך שלאחר ניתוח amplicons PCR יכולה לשמש ליישומים אחרים. HRMA הוחל באורגניזמים רבים ומערכות, כוללים שורות תאים, עכברים ובני אדם ^9-11. לאחרונה השימוש בו כבר תאר בדג זברה כדי לזהות מוטציות הנגרמות על ידי nucleases אצבע אבץ (ZFNs) וTALENs ^6,12,13.

במאמר זה, אנו מתארים כיצד לבצע HRMA PCR מבוסס בדג זברה עוברית ובוגרת (איור 1). פרוטוקול זה מתאים לאיתור SNPs, transgenes, ומוטציות, ובכלל זה siשינויי ngle בסיס זוג, הוספות או השמטות.

1. ה-DNA הכנה

1. הכן מאגר תמוגה-DNA: 50 מ"מ KCl, 10 מ"מ טריס-HCl pH 8.3, 0.3% Tween 20, NP40 0.3%. להוסיף טרי proteinase K לריכוז סופי של 1 מ"ג / מיליליטר ביום של שימוש ^12.
2. אוסף רקמות:
   1. לקליפ סנפיר דגים הבוגר:
      1. הרדימי דגים: מניחים את הדג ב0.004% MS-222 פתרון (tricaine). חכה עד שתנועת זימים מאטה.
      2. שים את הדג על ערימה של 5-10 Kimwipes ולחתוך חתיכה קטנה של סנפיר הזנב, על 2-3 מ"מ, בסכין גילוח סטרילית.
      3. במהירות למקום הדגים במכל שכותרתו עם מים טריים להתאוששות; לתייג גם את המכל וצינור מקביל שיכיל את הקליפ הסנפיר בזהירות. להחליף את המים ולהאכיל את הדגים כל יום אחר.
      4. תרים את הקליפ הסנפיר עם קצה פיפטה סטרילית ולהעביר אותו לתוך צינור מלא ב100 מאגר תמוגה DNA μl.
      5. מחק את קצה פיפטה, וזורקים את סכין הגילוח לתוך מיכל חד.
   2. לקליפ זנב עובר:
      1. הנח עוברים ל0.004% MS-222 פתרון (tricaine). לחכות 2 דקות.
      2. חותכי חתיכה של זנב עם מלקחיים תחת מיקרוסקופ לנתח.
      3. שים את הזנב לתוך צינור שכותרתו מלא ב30 מאגר תמוגה DNA μl.
      4. במהירות הכניס את העובר לתוך צינור המכיל 100 paraformaldehyde μl 4%.
      5. צינורות לייבל עם עוברים וצינורות הזנב המקביל שלהם.
      6. אחסן את הצינורות עם עוברים על 4 מעלות צלזיוס למשך לילה קיבעון.
      7. נקה את המלקחיים באמצעות מים מילי-Q וKimwipes בין כל עובר כדי למזער את הזיהום.
   3. לכל עוברים:
      1. הנח עוברים ל0.004% MS-222 פתרון (tricaine). לחכות 2 דקות.
      2. שים 1-5 עובר בצינור מלא ב100 מאגר תמוגה DNA μl. Dechorionation אינו הכרחי.
3. עיכול ה-DNA
   דגירה צינורות עם (קליפים סנפיר או זנב או עוברים) רקמה על 55 מעלות צלזיוסעבור 4 שעות עד ¹² הלילה.
4. להשבית proteinase K
   צינורות חום ל-C ° 95 15 ¹² דקות. ה-DNA צריך לשמש עבור PCR באופן מיידי, או מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים.

2. PCR

1. Primers עיצוב באופן ידני או על ידי תוכנת עיצוב פריימר (למשל Lightscanner פריימר עיצוב תוכנת Biofire). מוצרי ה-PCR לHRMA הם בדרך כלל 50-200 נ"ב; מוצרי ה-PCR לגילוי SNP צריכים להיות, בדרך כלל 50-80 נ"ב קטן יותר.
2. PCR
   1. מבצע תגובת PCR בצלחת 96 היטב או 384 גם.
   2. השתמש 10 μl נפח כולל: 4 תמהיל μl LightScanner מאסטר (0.1 U חם להתחיל תקי-AB פולימראז, חיץ, 0.2 dNTPs מ"מ, כלוריד 2 מ"מ מגנזיום, ו1x צבע מחייב גדילי הדנ"א כפול ניאון); 5 pmol כל צבע יסוד, ותבנית הדנ"א הגנומי μl 1 חולץ מסנפיר זנב מבוגר או 3 הדנ"א הגנומי μl מזנב עוברי ^13.
   3. דגימות כיסוי עם 30 שמן מינרלי μl. מכסה את הצלחת עם חותם דבק אופטי שקוף.
   4. לייעל את תנאי תנאים טיפוסיים רכיבה על אופניים PCR הם 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו30 מחזורים של 10 שניות ב 95 מעלות צלזיוס, 25 שניות ב 60 ° C, 30 שניות ב72 מעלות צלזיוס, שהסתיימו עם 95 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות ומקוררות 15 ° C.
   5. צלחות PCR חנות ב 4 מעלות צלזיוס או להמשיך ישירות לHRMA.
   6. לאשר המוצר ה-PCR שלנו על ידי ניתוח של הגודל שלה באמצעות ג'ל אלקטרופורזה agarose במהלך אופטימיזציה ראשונית של ה-PCR, ואם הצביע, על ידי רצף של המוצר ה-PCR.

3. HRMA

1. צלחות חום
   1. מניחים צלחת במערכת ניתוח להמיס.
   2. פתח את התוכנה (LightScanner תוכנה התקשר-IT 2.0).
   3. צלחות חום 60-95 ° C.
   4. ליצור קובץ אחסון נתונים חדש.
2. לנתח נתונים HRMA (איור 2).
   שלבים מרובים של ניתוח הם אפשריים. אנחנו מראים את הסט הנפוץ ביותר של m נתוניםanipulations.
   1. הגדרת משנה
      לחץ על כרטיסיית משנה. בחר את הבארות עם דגימות.
   2. נורמליזציה
      1. בחר בכרטיסייה לנרמל בפנל השמאלי. לחסל את שונות הקרינה, מיקום באופן ידני כפול הקו המקביל בטרום (ראשוני) ואזורים שלאחר להמיס (סופי) כפי שמודגם (איור 2C, ראשי חץ) ולנרמל את אותות premelt וקרינה שלאחר להמיס של כל הדגימות ל1 ו 0 , בהתאמה ^14.
      2. התאם את המיקום של הקווים כך שהאזור להמיס הוא בתחום שבין לפני ואחרי להמיס הקווים, אך לא נבחר. באופן כללי, מינימלי הנמוך יותר ויותר מקסימום (והמינימום עליון ועליון מקס) צריכים להיות ממוקמים קווי טמפרטורה כ 1 ° C לגזרים.
      3. בחר עמדות טמפרטורה לנורמליזציה כאלה שיש להם את כל הדגימות (100%) הקרינה המרבית או מלאה לאזור premelt והמינימום או לא (0%) הקרינה לאזור שלאחר להמיס (כמיטב possible). נורמליזציה צריכה לגרום לקו כמעט אופקי בקרינה המרבית של 1 המשתרעת עד לנקודה שנמסה ולאחר מכן קו כמעט אופקי מהנקודה להמיס בקרינה המינימלית של 0; לא צריכה להיות רמות הקרינה מעל 1 או מתחת 0 . לדוגמא, באיור 2C, לנרמל את קימורי premelting באמצעות טווחי טמפרטורה של 79-80 ° C.
   3. קיבוץ / קיבוץ באשכולות
      להבחין גנוטיפים המבוססים על טמפרטורת ההתכה שלהם (איור 2 ג, קופסא ירוקה). בחר קיבוץ.
      1. בחר Autogroup מרשימת בחירת התקנים תחת סעיף הקיבוץ.
      2. בחר רגיל או גבוה להתכת פרופילים עם מעברים בודדים או מעברים מרובים בהתאמה מרשימת בחירת הרגישות תחת סעיף הקיבוץ.
      3. Compute בחרקבוצות תחת סעיף הקיבוץ.
      4. עבור לתפריט הקובץ ולחץ על השמירה כדי לשמור את התוצאות.

הפרוטוקול ניתן לבצע במהלך יום אחד או פרוד בשלבים על פני כמה ימים (תרשים זרימה של עבודה מוצג באיור 1). מיצוי DNA אחריו להמיס וניתוח של amplicons ה-PCR. הטמפרטורות ללהמס של amplicon תלוי בגודל וGC-התוכן, אבל בדרך כלל מתחילות וטמפרטורות סוף 50 ˚ C ו 95 ˚ C מתאימות (2A דמויות ו2B). ברגע שלהמס מתבצע, הניתוח של העקומות להמיס הקרינה בדרך כלל דורש נורמליזציה של הווריאציה של עקומות מדגם השונות, תוך שימוש מראש ובאזורים שלאחר להמיס כתקנים (איור 2 ג). זה משפר את ההשוואה של תוצאות ממדגמים שונים שבווריאציה של הקרינה קשורה לשינויים ניסיוניים קטין. כל זוג של קווי טמפרטורה לנורמליזציה צריך להיות ממוקם כ 1 ˚ מלבד C (איור 2C, ראשי חץ).; הקבצה של תוצאות הנתונים מיוצגת בשתי דרכים שונות: גרף עליון שמציג פרופילים עקום להמיס, וגרף תחתון המציג עלילת הבדל תוסף בהשוואה למדגם התייחסות (איור 2 ד).

ניתוח HRMA יכול לשמש כדי לזהות מוטציות (3A דמויות ו3B) או transgenes (איור 3 ג). באיור 3 א, שתי מוטציות שונות בגן eif2b5 מוצגות (עקומות אדומות וכחולה באיור 3 א) על ידי הפחתת נתוני הקרינה המנורמלת של מדגם wild-type. זה לא משנה שגנוטיפ נבחר להתייחסות. הבדלים עדינים יותר או מבלבל בלהמס עקומות ניתן להבחין באמצעות עלילת הבדל תוסף. באיור 3 ב, דוגמא של ארבעה גנוטיפים שונים באוסף יחיד של עוברים מוצגות.

<img alt="איור 1" fo:content-width = "5in" עבור: src = "/"> "/ files/ftp_upload/51138/51138fig1highres.jpg" = "/ files/ftp_upload/51138/51138fig1.jpg" src
איור 1. קווי המתאר של פרוטוקול לHRMA של הדנ"א הגנומי דג הזברה מבוססת ה-PCR. מיצוי DNA מהרקמה שלמה (סנפיר-קליפ או עובר) ואחריו ההגברה PCR בנוכחות של צבע מחייב גדילי הדנ"א כפול ניאון. Amplicon PCR הוא מפוגל ואות הקרינה נרשמה, ואחריו ניתוח להמיס עקומה, כדי לזהות amplicon ו / או להבדיל גנוטיפים.

איור 2. תמונות מסך של תוכנה לבצע HRMA ולנתח את התוצאות.. צילום מסך של תוכנת LightScanner;. תיבה צהובה מוגדלת ב" B "B. מוגדל תצוגה של אזור התאגרף ב" ". הגדרת התחלה והסיום טמפ מוצגות (חיצים). C. מקם את premelt וקווים שלאחר להמיס במקביל לנורמליזציה (ראשי חץ). שים לב לשונות הקרינה באזורים לפני ואחרי הכור (תיבה אדומה). גרף תחתון (קופסא ירוקה) מראה להמיס עקומות נגזרות ממגרשי נתונים הגולמיים הבאים נורמליזציה. ד. מראה גרף עליון להמס פרופילים עקום אחרי קיבוץ אוטומטי; גנוטיפים שונים באים לידי ביטוי בצבעים שונים (תיבה אדומה). גרף תחתון (קופסא ירוקה) מראה את עקומת הבדל הקרינה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3. שימוש במשאבי אנוש. MA לזהות מוטציות וtransgenes עקומות הבדל הקרינה מוצגות; שינוי בקרינה (ציר y) לטמפרטורה (ציר x) מוצג.. HRMA היה משמש לאיתור דגים שנשאו מוטציות בגן eif2b5. סוג בר מוצג באפור (חץ). צבעי אדום והכחולים מייצגים את שתי מוטציות eif2b5 שונות, אושר על ידי רצף של המוצר ה-PCR. ב '. ארבעה אללים מוטנטים FOXP2 שונים מזוהים עם HRMA. zc82 / + (מחיקה נ"ב 8), ירוקה:: zc83 / + (מחיקה נ"ב 17), כחול: אדום zc82/zc83 (8bp מחיקת deletion/17bp), אפור:. zc83/zc83 (הומוזיגוטים מחיקת 17bp) C. דגי Gal4 מהונדסים (עקומות אפורות) ניתן להבחין מסוג בר (עקומת חום, חץ). שים לב כי לגילוי transgene, נורמליזציה לא צריכה להיות מבוצעת. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

יש המחברים אין לחשוף.