תיוג ההפרש של על פני קרום תא וחלבונים הפנימו לאחר האכלת נוגדן שידורים חיים בתרבית נוירונים

Summary

אנו מתארים שיטה לתייג חלבון על פני השטח של תאי עצב חיים באמצעות נוגדן polyclonal ספציפי לאפיטופים תאיים. החלבון קשור בנוגדן על פני התא, ולאחר מכן הפנים באמצעות אנדוציטוזה ניתן להבחין בין החלבון שנותר ב, או נסחרים ל, את פני השטח במהלך הדגירה.

Abstract

על מנת להדגים את הלוקליזציה של הקולטן הטרנסממברני המשוערת בנוירונים בתרבית על פני קרום התא, שכינינו את החלבון על פני השטח של תאי עצב חיים עם נוגדן ראשוני ספציפי שהועלה נגד חלק תאי של החלבון. בהתחשב בכך שקולטנים נסחרים ולמפני השטח, אם תאי permeabilized לאחר קיבוע אז גם על פני קרום התא והחלבון פנימי יזוהו על ידי אותו נוגדנים משני שכותרתו. כאן, אנו מותאמים שיטה המשמשת ללימודי סחר בחלבון ("האכלת נוגדן") לדיפרנציאלי חלבון תווית שהופנם על ידי אנדוציטוזה במהלך שלב הדגירה נוגדנים והחלבונים שגם נשאר על פני התא או נסחר אל פני השטח בתקופה זו . היכולת להבחין בין שתי בריכות של חלבון אלה התאפשרה באמצעות השילוב של צעד חסימת לילה עם נוגדנים משני ללא תווית מרוכזת מאוד לאחר אינקובטורים ראשונייםn של נוירונים unpermeabilized עם נוגדנים משני fluorescently שכותרתו. לאחר חסימת הצעד, permeabilization של נוירונים אפשרו זיהוי של הבריכה הפנימה עם נוגדנים משני ניאון שכותרתו עם fluorophore שונה. השימוש בטכניקה זו היינו יכול לקבל מידע חשוב על מיקום subcellular של קולטן המשוערת זו, חושף כי זה היה, אכן, נסחרים לעל פני קרום התא בתאי עצב. טכניקה זו היא החלים רחבה למגוון של סוגי תאים וחלבונים על פני קרום התא, מתן נוגדן מתאים לאנטיגן תאי הוא זמין.

Introduction

בהקמת הפונקציה של חלבונים שזוהו לאחרונה, חקירה של הלוקליזציה וסחר subcellular של החלבון מדובר יכולה לספק רמזים חשובים על התפקיד / ים הסביר של ^1,2 החלבון. ניתוח bioinformatic של transcriptome של הניאוקורטקס פיתוח ³ סיפק לנו רשימה של גנים תערוכת ביטוי השתנה במהלך corticogenesis מוח עכבר. לאחר מכן, אנו אימצנו גישת נוקאאוט הגנטי כדי לוודא שהחלבון מקודד על ידי אחד מהגנים האלה, sez6, יש לו תפקיד מפתח בהתפתחות תאי עצב. אנו הבחנו כי הגן הקשור לתפיסה 6, או Sez6, החלבון ממוקם בדנדריטים פיתוח ונוכח גם בקוצים הדנדריטים, מבנים מיוחדים על דנדריטים שיקבלו ולשלב אותות מעוררים. יתר על כן, כאשר חלבון זה הוא חסר, דנ....

Protocol

1. ניתק בהיפוקמפוס Neuron תרבות

1. הכן את coverslips (זכוכית ורוסיליקט):
   1. שטוף ב100% אתנול.
   2. אוויר יבש תחת קרינת UV.
   3. מעיל עם פולי-D-ליזין (0.5 מ"ג / מיליליטר ב0.15 M חיץ borate, הלילה בשעה 4 ° C).
   4. ביום למחרת (היום של תרבות) לשטוף 3x ב PBS אז מעיל עם laminin (2.5 מיקרוגרם / מיליליטר, laminin עכבר טבעי) + 5% בס....

Results

טכניקת immunostaining הניאון כפול צבע המוצגת כאן היא שימושית לתיוג תחומים תאיים של חלבונים הטרנסממברני בתאים חיים (המוצג באופן סכמטי באיור 1). במהלך תקופת הדגירה, נוגדנים נקשרים אפיטופים נגישים ושיעור האוכלוסייה של מולקולות חלבון, יחד עם נוגדן מאוגד, הוא endocytosed. בנוסף, חלבון מסונתז חדש עשוי להגיע לתא השטח באמצעות סחר בקדימה ומולקולות חלבון ממוחזרות ניתן להחזיר קרום הפלזמה ^10.

שיטה.......

Discussion

הטכניקה המתוארת כאן היא משלימה לזו של biotinylation על פני קרום התא (נסקר על ידי Arancibia-Càrcamo et al.) ¹² וזה שיטת בחירה של שמירת מידע על לוקליזציה subcellular של החלבון הפנים, ובלבד נוגדן ראשוני מתאים ל epitope תאי הוא זמין. בנוסף, לכמת את סחר חלבון / הפנמה לאורך זמן יכול להתבצע (על ידי תיקון coverslips בזמנים שונים במהלך הדגירה התא החי עם נוגדן ראשוני) ללא הצורך להכין תמציות חלבון.

מכתים.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS עם Ca ו-Mg	Invitrogen	14040182
מדיום נוירו-בזאלי	Invitrogen	21103-049
תוסף B27	Invitrogen	17504-044
L-גלוטמין	Invitrogen	25030-081
מערכת דיסוציאציה פפאין	Worthington Biochemical Corporation	PDS
סרום בקר אלבומין	סיגמא אולדריץ' אוסטרליה	A9418
Hank' תמיסת מלח מאוזנת ללא סידן, מגנזיום, פנול אדום	Invitrogen (Gibco)	14175-079
פולי-D-ליזין	סיגמא אולדריץ' אוסטרליה	P0899
למינין עכבר טבעי	Invitrogen	23017-015	הפשרה על קרח לפני הכנת aliquots
סרום בקר עוברי HyClone	Thermo Fisher
Fluorodeoxyuridine	Sigma Aldrich אוסטרליה	F0503
Uridine	Sigma Aldrich אוסטרליה	U3003
18 מ"מ כיסויי זכוכית עגולים	Menzel Glä ser	CB00180RA1
VECTASHIELD מדיום הרכבה מימית	Vector Laboratories	H1400
חמור נגד ארנב Dylight 649	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-495-152
AffiniPure Fab שבר עז נגד ארנב 1gG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-007-003
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich Australia	P6148	TOXIC - ידית במכסה אדים
Triton-X-100	Sigma Aldrich Australia	T8787
Alexa Fluor 488 חמור מצומד נגד ארנב 2° נוגדן	Invitrogen - בדיקות מולקולריות	A21206