הזרקת intracardiac מונחה ההדמיה אולטראסאונד לפתח מודל עכבר של שד גרורות סרטן מוח ואחריו האורכי MRI

סיכום

מודל שד סרטן מוח גרורות עכבר הוא הקים עם הזרקת intracardiac אולטרסאונד מונחה הדמיה של תאי MDA-MB231/Br-GFP. התפתחות של גרורות תוך גולגולתי multifocal כבר במעקב אורכים באמצעות רזולוציה גבוהה 9.4 T-MRI.

תקציר

גרורות במוח סרטן השד, המתרחשות ב30% מחולות בסרטן השד בשלב IV, קשורה בתמותה גבוהה. חציון ההישרדות היא רק 6 חודשים. זה קריטי כדי להיות מודלים של בעלי חיים מתאימים לחקות את ההתפשטות המודינמית של התאים גרורתי בתרחיש הקליני. כאן, אנו מציגים את השימוש בהדמית אולטרסאונד החיה קטנה כדי להדריך את ההזרקה מדויקת של תאי סרטן שד טרופי מוח לתוך החדר השמאלי של עכברים בעירום athymic. MRI אורך משמש להערכת חניכה וצמיחה של גרורות במוח תוך גולגולתי. הזרקת intracardiac מונחה אולטרסאונד מבטיחה לא רק בהזרקה מדויקת וזאת בשיעור מוצלח גבוהה יותר, אלא גם ירדה באופן משמעותי שיעור תמותה, בהשוואה להליך במדריך הקודם שלנו. בבדיקת MRI ברזולוציה גבוהה vivo מאפשרת ההדמיה של נגעי multifocal hyperintense, קטן כמו 310 מיקרומטר קוטר ב-T-משוקלל ₂ תמונות ב3 שבועות לאחר הזרקה. FolloMRI w למעלה חושף את צמיחת גידול תוך גולגולתי ומספר גדל של גרורות שלהפיץ בכל המוח כולו.

מבוא

גרורות במוח היא הגידול הממאיר תוך גולגולתי השכיחה ביותר במבוגרים. התחזית היא ענייה מאוד, עם חציון הישרדות של 4-6 חודשים אפילו עם טיפול אגרסיבי. סרטן השד הוא אחת משלושת סוגי הסרטן העיקריים גדולים עם תחלואה גבוהה של גרורות במוח ^1-3. קווי סרטן שד המוח טרופי כמה הם מסוגלים לפתח גרורות במוח לאחר intracardiac או הזרקת intracarotid ^4. הזרקה ישירה של תאים סרטניים לתוך החדר השמאלי יכולה לעקוף את מיטת נימי ריאה ובכך להגדיל את השכיחות של יצירת גרורות במוח תוך מזעור גרורות קרביים. קו מד"א-MB231Br הוא אחד קווי סרטן השד האנושיים הנפוצים ביותר לפתח גרורות במוח במודלים של מכרסמים ^5,6.

כמו רבים מחקרים אחרים ^4,7, אנחנו צריכים לבצע הליך ידני של הזרקת intracardiac במחקרים הקודמים שלנו. עם זאת, רק 50% שיעור מוצלח הושג עם המדריךהזרקה ושבריר של עכברים מתו מהפרוצדורות פולשניות החוזרות ונשנות במידה וניסויים לפני נכשלו. כאן, אנו מציגים את השימוש בהליך מונחה הדמיה כדי לאבטח את ההזרקה של תאי סרטן שד המבקש מוח לתוך החדר השמאלי של עכברי athymic. MRI ברזולוציה גבוהה אורך מוחל לעקוב אחר התפתחות תוך גולגולתי של גרורות במוח.

פרוטוקול

נהלי כל החיה אושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש במרכז Southwestern הרפואי של אוניברסיטת טקסס.

1. הכנת תאי MDA-MB231/Br-GFP

1. אחזר ותרבות תאי MDA-MB231/Br-GFP (הניתנים באדיבות על ידי בני הזוג. פלמיירי וSteeg, NCI) במדיום DMEM המכיל 10% FBS, גלוטמין 1% ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין.
2. שים לב למצבם של התאים והצבע של מדיום, ולהחליף בינוני כל 2-3 ימים.
3. Trypsinize ולאסוף את התאים כאשר מגיע למפגש 80% כפי שמתואר בצעדים 1.3.1-1.3.5:
   1. הסר את המדיום הישן לחלוטין ולהוסיף 5 מיליליטר PBS (1x) כדי לשטוף את התאים בעדינות. הסר את PBS מהצלחת.
   2. הוסף 1.5 מיליליטר טריפסין בצלחת; להטות את הצלחת בעדינות כדי להבטיח את כל התאים מכוסים על ידי טריפסין. שים את הצלחת בחזרה לתא החממה ולשמור אותו ב37 מעלות צלזיוס במשך דקות 1.
   3. קח את המנה מתוך חממה ולבחוןהתאים תחת מיקרוסקופ אופטי כדי להבטיח את התאים להתנתק המנה.
   4. הוסף 3 מיליליטר בינוני כדי לעצור את ההשפעה של טריפסין. לאסוף את תערובת התאים בצינור צנטריפוגות. צנטריפוגה את התערובת על 2,000 סל"ד למשך 5 דקות.
   5. הסר את המדיום בזהירות וresuspend תאי 5 בינוני סרום ללא מיליליטר עד הומוגנית.
4. רוזן המספר מתאים של תאי resuspend אותם במדיום DMEM החופשי בסרום עם ריכוז סופי של 1.75 x 10 ⁵ תאים ב100 μl נפח.
   1. קח 50 תערובת תא μl ולהוסיף 50 μl Trypan הכחול. לאחר הערבוב, לקחת 10 תערובת μl ובזהירות להוסיף לשקופית ספירת תאים. השתמש בדוגמאות רבות כדי להבטיח הערכת מספר התא מדויקת.
   2. היצמד בשקופית ספירת תאים, קצה אחד בכל פעם ודלפק התא מתחיל לספור באופן אוטומטי. קח את הממוצע של כל תוצאות הספירה והחישוב הכולל מספר התא.
   3. צנטריפוגה התאים שוב וresuspend אותםהנפח המתאים של מדיום סרום ללא לגרום לריכוז הסופי של 1.75 x 10 ⁵ cells/100 μl נפח.
5. תאים מניחים על קרח לפני זריקת intracardiac.

2. הזרקת intracardiac מונחה ההדמיה אולטראסאונד

1. השתמש בעכברי עירום נשיים (BALB / ג נו / נו) בין 6-8 שבועות.
2. התחבר מערכת ההדמיה. לאתחל את 704 (MHz 40) מתמר.
3. התחל מחקר חדש ולמלא את הפרטים.
4. הרדימי (3% O isoflurane/100% ₂ בחדר אינדוקציה) ולשמור על בעלי החיים עם isoflurane (2%) ב100% O ₂ (DM 1 ³ / min) במהלך ההליך כולו באמצעות חרטומו. הרדמה הוא אישר כאשר לא רפלקס נסיגה הוא ציין עם קמצוץ הבוהן.
5. הגדר את הטמפרטורה של טבלת ההדמיה 37 ° C. תדביק את העכבר הרדים לשולחן ההדמיה המחומם במצב שכיבה.
6. שמור ג'ל אולטרסאונד על 37 מעלות צלזיוס לפני imהזדקנות. להחיל את הג'ל לחזו של העכבר.
7. הר מתמר בבעל. מנמיכים את המתמר עד שיגיע לעומק ההדמיה הרצוי. להזיז את הבמה עד לחדר השמאלי מזוהה עם אב העורקים עולים כאתר (איור 1 א). נעל את הבמה כאשר תצוגה ברורה של חדר השמאלי היא מדמיין.
8. צייר של תערובת תא 100 μl לתוך מזרק 1 מיליליטר עם מחט G 22. מקום ולתקן את המזרק על מזרק הר.
9. הזז את המזרק קדימה לכיוון החזה בעכבר ולעבור אותו בזהירות מצד לצד עד שקצה המחט הוא בתחום ההדמיה של נוף (לפני הכניסה לעכבר).
10. התאם את גובה המחט וזווית כדי לכוון את החדר השמאלי.
11. לחדור את מחט המזרק לתוך חלל intercoastal מייד דרך שכבות עור ושרירים לתוך החדר השמאלי תחת הדרכתו של ההדמיה אולטרה סאונד.
    אינדיקציה להחדרה מוצלחת של המחט לתוך ventri השמאלCLE הוא ריפלוקס של דם טרי בעורקים (צבע ורוד בניגוד לדם ורידים אדום כהה) לתוך המזרק
12. הזרק את תערובת התא לאט (איור 1).
13. בסיום, למשוך את המחט, להרים את המתמר, לנקות את הג'ל אולטרסאונד עם גזה לחה ולהסיר קלטת.
14. הכן את כלוב נקי עם כרית שחומם מראש.
15. מניחים את החיה על הכרית ולבחון את החיה עד להחלמה מלאה.
16. לפקח על התנהגותם של בעלי החיים בכל שעות 24 במשך יומיים.
17. תנאים כלליים וסימני נוירולוגים של סיבוכים בעכברי ניסוי מנוטרים באופן שיגרתי.

3. ניטור ה-MRI של התפתחות גידול תוך גולגולתי

1. להשתמש במגנט טסלה 9.4 לעקוב אחר התפתחות תוך גולגולתי של גרורות במוח.
2. ליזום MRI שבועיים לאחר השתלת גידול ולחזור פעם בשבוע לתקופה של עד שלושה שבועות.
3. להרדים את החיות עם 3% isoflurane ולשמור אותם תחת גןההרדמה RAL (isoflurane 1.5%).
4. לפקח ולשמור על טמפרטורת הגוף של בעלי החיים ומתמידים נשימה לאורך כל הניסוי.
5. multislice ברזולוציה גבוהה (14 פרוסות עם 1 מ"מ עובי, אין פער) T ₁ - ו-T ₂ משוקללי תמונות העטרה, המכסות את האזור מהאונה הקדמית לפוסה האחורית, נרכשים עם הפרמטרים הבאים: תמונות ₁ משוקללת-T: ספין הפרוסה מרובה הד (SEM), TR / TE אלפיות = 400 msec/20, מטריקס: 256 x 256, FOV מ"מ 20 x 20, ברזולוציה מטוס: 78 x 78 מיקרומטר ^2. תמונות _{משוקללות-2} T: מהירות ספין הד הפרוסה מרובה רצפים (FSEMS), TR / TE אלפיות = 2500 msec/48, 8 רכבות הד, מטריקס: 256 x 256, FOV 20 x 20 מ"מ, ברזולוציה מטוס: 78 x 78 מיקרומטר ^28,9.
   נגעים סרטניים מופיעים בהירים יותר מרקמות מוח נורמליות על T תמונות משוקללת _2.
6. גודל גידול נקבע על T תמונות _{2-משוקללות} ידי התוויית enhan ידניcing חלק מהמסה על כל תמונה על ידי שימוש בתוכניות MATLAB שנכתבו על ידינו ^8.
   בהתחשב ביותר של הגידול בקטרים ​​קטנים יותר מהעובי פרוס (1 מ"מ), גודל הגידול מוצג כבאזור מטוס ולא את עוצמת הקול.

4. H & E מכתים אישור גרורות

1. להקריב את העכברים מייד לאחר MR האחרון לסרוק, לנתח את המוח של נושאי גידול ולהטביע אותו במדיום OCT ו קפוא ב-80 ° C.
2. סעיף סדרה של 10 מוח העטרה מיקרומטר בעובי דגימות עם cryostat.
3. לבצע צביעת H & E על החלקים במוח.

תוצאות

עם הרזולוציה מרחבית הגבוהה של ה-MRI (78 מיקרומטר ברזולוציה מטוס), ניתן לזהות נגעי hyperintense קטנים כמו 310 מיקרומטר קוטר (איור 2). מאז גרורות במחקר זה הן קטנות מאוד והתפתחות של נמק ובצקת הוא מינימאלי, נגע hyperintense על T תמונות משוקללת ₂ באמת ייצג את מסת הגידול.

מחקרי MRI אורך לאפשר בהערכה לא פולשנית vivo של גידול. כפי שניתן לראות באיור 3, MRI ברז...

דיון

במחקר הנוכחי, יש לנו הראו כי הזרקה של חדר השמאל מונחה הדמיה אולטרסאונד מבטיחה את הדיוק, כך שכל בעלי חיים בגרורות במוח מחקר פיתח את זה ולא מוות של בעלי חיים נצפו. היופי של הזרקת דימוי מודרך הוא שהדרך של חדירת מחט לעור ולבסוף לתוך החדר השמאלי יכולה להיות במעקב ומותאם תחת תמונה, שהוא שונה מההליך הידני הדורש ציוני דרך אנטומיים קפדניות לעקוב.

הבנות הנוכחיות של התפתחות של גרורות במוח תוך גולגולת מבוססות במידה רבה על מח...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM	HyClone	SH30022.01
טריפסין	מדיה-טק	25-051-C1
מונה תאים אוטומטי	BioRad	TC10
איזופלורן	בקסטר אינטרנשיונל בע"מ	1001936060
מערכת הדמיה ברזולוציה גבוהה VisualSonics Vevo 770	ויז'ואל סוניקס בע"מ
מגנט קדח אופקי 9.4 T עם מערכת Varian INOVA Unity	אג'ילנט
מתחם O.C.T	סאקורה פינטק ארה"ב	4583