בידוד והכנת קירות תא חיידקי לניתוח קומפוזיציוני על ידי כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים

Summary

דופן התא החיידקי מורכבת מפפטידוגליקן, רשת מקרומולקולרית של גדילי סוכר המוצלבים על ידי פפטידים. כרומטוגרפיה נוזלית עם ביצועים גבוהים מספקת רזולוציה גבוהה ותפוקה לגילויים חדשניים של הרכב פפטידוגליקני. אנו מציגים הליך לבידוד קירות התא (sacculi) והכנתם לאחר מכן לניתוח באמצעות UPLC.

Abstract

דופן התא החיידקי היא קריטית לקביעת צורת התא במהלך הצמיחה והחלוקה, ושומרת על השלמות המכנית של התאים לנוכח לחצים טורגורים מספר אטמוספרות בעוצמה. על פני הצורות והגדלים המגוונים של ממלכת החיידקים, קיר התא מורכב מפפטידוגליקן, רשת מקרומולקולרית של גדילי סוכר המחוברים על ידי פפטידים קצרים. החשיבות המרכזית של Peptidoglycan לפיזיולוגיה חיידקית עומדת ביסוד השימוש בו כמטרה אנטיביוטית והניעה מחקרים ביולוגיים גנטיים, מבניים ותאיים של האופן שבו הוא מורכב באופן איתן במהלך צמיחה וחלוקה. עם זאת, עדיין נדרשות חקירות מקיפות כדי לאפיין באופן מלא את הפעילות האנזימטית העיקרית בסינתזה פפטידוגליקנית ואת ההרכב הכימי של קירות התא החיידקי. כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) היא שיטה אנליטית רבת עוצמה לכימות הבדלים בהרכב הכימי של קירות החיידקים הגדלים תחת מגוון תנאים סביבתיים וגנטיים, אך התפוקה שלה מוגבלת לעתים קרובות. כאן, אנו מציגים הליך פשוט לבידוד והכנת קירות תא חיידקי לניתוחים ביולוגיים של פפטידוגליקן באמצעות HPLC ו כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים (UPLC), הרחבה של HPLC המשתמשת במשאבות כדי לספק לחצים גבוהים במיוחד של עד 15,000 psi, לעומת 6,000 psi עבור HPLC. בשילוב עם הכנת קירות תא חיידקי המוצגים כאן, מזרקי המדגם בנפח נמוך, גלאים עם שיעורי דגימה גבוהים, נפחי מדגם קטנים יותר וזמני ריצה קצרים יותר של UPLC יאפשרו רזולוציה גבוהה ותפוקה לגילויים חדשים של הרכב פפטידוגליקני וביולוגיה בסיסית של תאי חיידקים ברוב המעבדות הביולוגיות עם גישה לאולטרה-סנטריפוג ו- UPLC.

Introduction

מטרת השיטה המתוארת במסמך זה היא לבודד קירות תא חיידקי שלמים (sacculi) ולעכל את הפפטידוגליקן (PG) כך שניתן יהיה להשתמש בכרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים (UPLC) כדי לספק מידע כגון זהותם של רכיבי muropeptide וריכוזיהם, האורך הממוצע של גדילי הגליקן, ושבריר החומר המעורב בקישורים צולבים בין גדילים. לדיון מפורט על ביוכימיה PG ומינים muropeptide, ישנן מספר ביקורות מצוינות המתארות מבנה PG ותפקידה זיהום, התנגדות, morphogenesis, וצמיחה^1-6. כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) לניתוח PG פותחה בתחילה על ידי גלונר ושוורץ בשנות השמונים, ולאחרונה שופרה ויושמתה בהרחבה במעבדות של מיגל דה פדרו ו-וולדמר וולמר. שיטות קודמות השתמשו בניתוח חומצות אמינו או כרומטוגרפיה של נייר, טכניקות גוזלות זמן ומייגעות שאינן מניבות הערכות מדויקות או מלאות של רכיבי קיר התא.

ניתוח UPLC ניתן ליישם בקלות בכל מעבדת מחקר בסיסית שיש לה גישה ultracentrifuge ו UPLC. שיטת UPLC שאנו מציגים להלן מבודדת sacculi שלם, ובכך מספקת מידע מקיף, כמותי על כל המינים הכימיים בו. שיטה זו מניבה כימות מדויק של כל muropeptides על פני אוכלוסייה של חיידקים, כל בתוך 20 דקות UPLC לרוץ. יישום שיטה זו כרוך בכישורי מעבדה בסיסיים בלבד, ללא השקעה כספית משמעותית בחומרים. על מנת לבצע את השלבים בשיטה זו, החוקרים צריכים להיות מיומנים רק בצנרת, הכנת מאגרים ואנזימים, והתאמת ה- pH, מה שהופך אותו לנגיש למגוון רחב של דיסציפלינות מדעיות. הבחירה של אנזימים המשמשים בפרוטוקול זה תלויה במין החיידק המנותח; הפרוטוקול המתואר כאן שימושי עבור Escherichia coli, ובדרך כלל נמצא כי הוא מתאים לבודד sacculi מאורגניזמים אחרים גראם שלילי. התייעצות עם הספרות מומלצת בעת יישום שיטה זו על חיידקים גראם חיובי; במינים אלה, טיהור סקולוס באופן מסורתי היה קשה יותר. בפרט, שיטה זו עשויה להיות צריכה להיות שונה במונחים של בחירת אנזים ואורך זמני העיכול כדי להתאים את הקירות העבים פולימרים אביזר כגון חומצות teichoic של חיידקים גראם חיובי. האנזים הראשון בפרוטוקול זה מבקע ליפופרוטאין קרום החיצוני (כגון ליפופרוטאין של בראון, או Lpp) מצורף פפטידוגליקן, ובכך משחרר את כל אבל C-terminal di- (או תלת)פפטיד של Lpp מקיר התא. שלב זה נחוץ בעת בחינת Enterobacteria, אבל חיידקים רבים אחרים גראם שלילי אין מקבילות Lpp, ולכן צעד זה ניתן לדלג. אנזים שני נצמד במיוחד לאחר רכיב החומצה המורמית של הפפטידוגליקן, ומזלזל בתת-המין disaccharide היוצר את מינים muropeptide. כדי לספק הערכה מדויקת של הארכיטקטורה של PG, יש להקפיד על עיכול sacculi כדי למנוע מחשוף של הגשרים או כל חלק אחר של גזע פפטיד.

למרות ההרכבים הכימיים של peptidoglycan מעל 100 זנים של ~ 40 מינים חיידקיים נותחו על ידי HPLC, לא בוצעו ניתוחים עם טכנולוגיית UPLC. בנוסף, עבודה קודמת אפיינה peptidoglycan רק חלק קטן של התחום החיידקי, בחלקו מוגבל על ידי התפוקה של HPLC. לכן, הפצת שיטה זו לחוקרים רבים ככל האפשר, ויישום על פלטפורמות UPLC, יהיה קריטי להנעת מחקרים פיזיולוגיים של חלק גדול של מיני חיידקים אשר peptidoglycan עדיין לא סווג.

Protocol

1. לגדל תרבויות חיידקים ב 2.5 מ"ל של מדיה לילה

תרבויות לדלל בחזרה 1:100 לתוך 250 מ"ל של מדיה טרייה לגדול OD₆₀₀ של 0.7-0.8. הכינו פתרון של 6% נתרן דודקיל סולפט (SDS) במים.

התראה: אבקת SDS מסוכנת - הימנע משאיפת אבקת SDS; ללבוש מסכה על האף והפה.

2. יום 1 - תרביות חיידקים Lysing מבוצע במהלך יום אחד ולילה

1. בעוד תרבויות מדוללות גדלות, להקים אמבט מים רותחים על צלחת חמה 1 L. לאחר המים רותחים, aliquot 6 מיליליטר של 6% SDS לתוך צינורות פוליפרופילן 50 מ"ל, להוסיף בר ערבוב אחד קטן לכל צינור, מכסי צינור מאובטח כדי אצבע הדוקה, למקם צינורות באמבט מים, ולהדליק ערבוב 500 סל"ד על הצלחת החמה.
2. לקצור את 250 מ"ל תרבויות ב 5,000 × גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ואת כדורי resuspend ב 3 מ"ל של מדיה או 1x פוספט אגירה מלוחים. לאט תלויי תא פיפטה לתוך צינורות 50 מ"ל עם 6% רותחים SDS כדי lyse התאים (ריכוז סופי 4% SDS) בעוד הצינורות שקועים באמבט המים הרותחים, ולשקם מחדש את העפעפיים כדי אצבע הדוקה. השעיות התא חייב להיות מועבר במהירות לתוך SDS רותחים פעם בשימוש חוזר. יש להימנע משינויים סביבתיים פתאומיים, שכן זה יכול לגרום לשינוי שגוי של מבנה קיר התא.
3. מכסים אמבט מים רותחים ומאפשרים לתאים לרתיחה במשך 3 שעות, בדיקת מפלס המים מעת לעת ומילוי אמבט המים בעת הצורך. לאחר 3 שעות, לכבות את אלמנט החימום של הצלחת החמה, ולהמשיך לבחוש לילה ב 500 סל"ד.

3. יום 2 - עיכול אנזימטי מבוצעים במהלך יום אחד

1. אם SDS יש זירז בצינורות 50 מ"ל לילה, להגדיר את אמבט המים לרתיחה במשך 1-2 שעות נוספות. הפעל בלוק חום ל 60 °C (60 °F). הכן 1 מ"ג / מ"ל מלאי של Pronase E ב 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) + 0.06% w / v NaCl ולהפעיל Pronase E ב 60 °C (60 °F) לפחות 30 דקות.
2. השתמש ultracentrifuge להגדיר ב 400,000 × גרם כדי לסובב דגימות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר על מנת גלולות פולימרים PG גדול ובכך לטהר אותם מרכיבים סלולריים אחרים. הסר supernatant בזהירות, ולאחר מכן resuspend כל גלולה במים אולטרה-דק טמפרטורת החדר. הערה: נפח ההשעיה תלוי בנפח של צינורות ultracentrifuge בשימוש; השתמש בנפח הממלא את הצינורות לפחות באמצע הדרך אך אינו עולה על הנפח המרבי של הצינורות. צנטריפוגה חוזרת/כביסה עד שהמים אינם יוצרים בועות במהלך ההשעיה, מה שמצביע על כך שה- SDS הוסר לחלוטין (בדרך כלל שלוש שטיפות). להפסיק לשטוף את גלולה אם משקע לבן צורות, כמו זה מציין כי sacculi הם גושים יחד. גושים אינם קטסטרופליים, אך גושים נקשרים בחוזקה רבה לפלסטיק וכלי זכוכית הגורמים לאובדן מדגם גדול. במקרה זה, המשך עם הפרוטוקול באמצעות מדגם sacculi מגושם.
3. על צעד צנטריפוגה / כביסה האחרון, resuspend את הדגימות ב 900 μl של 10 מ"מ Tris-HCl (pH 7.2) + 0.06% w / v NaCl ולהעביר 2 צינורות מיליליטר בעבר דקר עם חורים בחלק העליון עם מחט קטנה. הוסף 100 μl של 1 מ"ג / מ"ל מופעל Pronase E (100 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי) לכל מדגם דגירה ב 60 °C (60 °F) במשך 2 שעות. הגדר בלוק חום שונה ל 100 מעלות צלזיוס.
4. לעצור את עיכול Pronase E על ידי הוספת 200 μl של 6% SDS לכל מדגם להרתיח את הדגימות בלוק חום 100 °C במשך 30 דקות. הגדר בלוק חום שונה ל 37 °C (69 °F) ולעשות 1 מ"ג / מ"ל מלאי של muramidase (mutanolysin) ב 50 mM מאגר פוספט (pH 4.9).
5. כמו בשלב 3.2, השתמש ב- ultracentrifuge מוגדר ב- 400,000 × גרם כדי לסובב דגימות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף עם מים אולטרה-דקים בטמפרטורת החדר עד ש- SDS יוסר במלואו (בדרך כלל שלוש שטיפות). נפח ההשעיה תלוי בנפח של צינורות ultracentrifuge בשימוש; השתמש בנפח הממלא את הצינורות לפחות באמצע הדרך אך אינו עולה על הנפח המרבי של הצינורות.
6. על צעד צנטריפוגה / כביסה האחרון, resuspend דגימות ב 200 μl של 50 mM מאגר נתרן פוספט (pH 4.9). נפח זה יכול להיות מותאם על פי כמות peptidoglycan במדגם, והוא עשוי להיות תלוי מינים. אם יש דיווחים שפורסמו בעבר של ניתוח HPLC עבור המינים של עניין, נפח זה ניתן להעריך בהתבסס על כמויות אלה (אוסף של מחקרי HPLC PG ניתן למצוא את המידע המשלים של הפניה⁷). עבור מינים אחרים, הכנת sacculus יכול להתבצע עד שלב זה ולאחר מכן כמויות שונות של נפחי resuspension ניתן להוסיף כדי לשכפל דגימות על מנת לקבוע את נפח מינימלי המאפשר PG להישאר בפתרון (ראה דיון עבור הערכות נוספות). אם המדגם מכיל יותר peptidoglycan, להגדיל את נפח ההשעיה מחדש; אם המדגם יש פפטידוגליקן קטן, להפחית את נפח ההשעיה למינימום של 50 μl.
7. להעביר דגימות 1.5 מיליליטר צינורות ולהוסיף 1 מ"ג / מ"ל muramidase לתת ריכוז סופי של 40 מיקרוגרם / מיליליטר. דגירה 6-8 שעות או לילה ב 37 מעלות צלזיוס.

4. יום 3 - הכנת דגימות עבור UPLC מבוצעת ביום האחרון

1. הפעל בלוק חום ל 100 °C (60 °F). מרתיחים את הדגימות ללא SDS במשך 5 דקות כדי לעצור את העיכול muramidase. דגימות צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 16,000 × גרם בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להעביר את supernatant (muropeptides הם עכשיו מסיסים) ל 13 מ"מ x 100 מ"מ צינורות זכוכית. לנסות להתאושש כמו supernatant ככל האפשר, מקבל קרוב מאוד גלולה מבלי להפריע לו.
2. התאימו את ה-pH על ידי הוספת מאגר בוראט של 500 מ"מ (pH 9) לדגימה לריכוז סופי של 100 מ"מ מאגר בוראט. מאגר בוראט תואם לסוכן ההפחתה נתרן בורוהידריד. מוסיפים 1-2 גרגרי נתרן בורוהידריד כדי להפחית כל דגימה ולתת לתגובה להמשיך לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר. התראה: נתרן borohydride הוא תגובתי מאוד ומסוכן לטפל - להימנע ממגע עם העור (ללבוש כפפות) ולהימנע ממגע עם העיניים (ללבוש משקפי בטיחות).
3. התאם דגימות ל- pH 3-4 (הנקודה האיזואלקטרית muropeptide היא ~ 3.5) עם 50% v / v חומצה אורתופוספורית באמצעות 20 הפרשים קבועים μl עד pH 6, כפי שנמדד עם נייר מחוון pH, ולאחר מכן באמצעות 2 μl במרווחים. התראה: חומצה אורתופוספורית היא מאכלת ומסוכנת לטיפול - יש להימנע ממגע עם העור (ללבוש כפפות) ולהימנע ממגע עם העיניים (להרכיב משקפי בטיחות). המדגם צריך בועה בתגובה לתוספת של חומצה אורתופוספורית; כאשר המדגם מפסיק לבעבע, זה בדרך כלל מציין pH של 6 כבר הגיע. אם אין מבעבע מתרחשת במדגם, זה עשוי להצביע על כך שכמות הנתרן borohydride הוסיף היה קטן מדי. במקרה זה, להפסיק להוריד את ה- pH, בזהירות להוסיף אחד או שניים גרגרי נתרן borohydride, לתת להגיב במשך 5-10 דקות, ולאחר מכן לחדש את התאמת ה- pH.
4. דגימת מסנן דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר ישירות לתוך בקבוקון UPLC. אם נוצר משקע, מחממים את הצינור עם מספר מעברים דרך להבה לפני הסינון. אם המדגם לא יוזרק לתוך מכשיר UPLC בתוך היום, להקפיא ב -20 מעלות צלזיוס לילה. ניתן לאחסן דגימות עד שנה ב-80 °C (60 °F). המדגם יכול להיות מופשר על ידי עובר דרך להבה מספר פעמים.
5. הזרק 10 μl של כל מדגם על מכשיר UPLC מצויד C18 1.7 מיקרומטר הפוך פאזה עמודה גלאי ספיגה להגדיר לפקח 202-208 ננומטר. דגימות מוזרקות ברצף, אך יכולות דגימה אוטומטית מאפשרות עיבוד של עד 96 דגימות באצווה. השתמש 50 מ"מ נתרן פוספט (pH 4.35) + 0.4% v / v נתרן אזיד עבור ממס A, ו 75 mM נתרן פוספט (pH 4.95) + 15% v / v מתנול עבור ממס B. הערה: נתרן אזיד מתווסף כדי לפצות על ספיגת 205 ננומטר של מתנול כדי למנוע דריפט בסיסי. הגדר את הזרימה ל 0.25 מיליליטר / דקה ולהשתמש הדרגתי ליניארי מעל 25 דקות כדי להשיג 100% ממס B ו elution רציף של muropeptides בתוך 30 דקות. אם ספקטרומטריית מסה תשמש לאפיון muropeptides לאחר UPLC, לאסוף שברים של שיא העניין אספן שבר לייבש את השברים באמצעות מאייד צנטריפוגלי.

Results

באמצעות ההליך המתואר באיור 1, המדגם הסופי צריך לכלול לפחות 200 μl של פתרון ברור שסונן ישירות לתוך בקבוקון UPLC (שלב 4.4). הפרדת UPLC של המורופפטידים השונים במדגם חיידקי מסתמכת על המסיסות היחסית שלהם בין השלב הנייד הנוזלי לשלב הנייח של העמודה. עמודי C18 הפוכים מספקים מטריצה הידרופובית חזקה להפרדת מינים muropeptide המבוסס על הידרופוביות וגודל⁸; מונופולים קוטביים, בעלי משקל מולקולרי נמוך, נוטפים ראשונים, ואוליגומרים בעלי משקל מולקולרי גבוה יותר נוטפים לאחר מכן (איור 2). באיור

Discussion

שלב קריטי בהליך זה הוא שלב 3.1 של היום השני של הכנת מדגם. אם SDS יש זירז לילה, או אם הדגימות אוחסנו 4% SDS במשך כמה שבועות בטמפרטורת החדר, הדגימות חייבות להיות reboiled לפחות 1 שעה כדי לפתור מחדש את SDS. סיבה נפוצה עבור משקעים SDS היא השימוש במדיה עם מלחי אשלגן, ולכן אשלגן יש להימנע במדיה במידת האפשר. כפי שצוין בסעיף תוצאות מייצגות, זה גם קריטי כדי להתאים את ה- pH בתוך הנקודה האיזואלקטרית של muropeptides (~ 3.5), אבל לא נמוך מדי מאשר pH 3, או החומר עשוי לזרז. לבסוף, ההשעיה מחדש של המדגם חייבת להתרחש בנפח המתאים של מאגר נ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
פרונאז E	אמרסקו	E629
מוטנוליזין מ-Streptomyces	Sigma-Aldrich	M9901
נתרן בורוהידריד (NaBH<תת>4)	Sigma-Aldrich	452882	נתרן בורוהידריד הוא תגובתי מאוד ומסוכן לטיפול
בחומצה אורתופוספורית	Sigma-Aldrich	79607	חומצה אורתופוספורית היא קורוזיבית ומסוכנת לטיפול
בחומצה בורית	Sigma-Aldrich	31146
נתרן אזיד	Sigma-Aldrich	S2002	נתרן אזיד הוא רעל
נתרן טטרבוראט	Sigma-Aldrich	221732
Millex 0.22 μ m מסנני מזרק	פישר	SLGVR04NL
רצועות pH (טווח pH 0-6)	פישר	M95863
50 מ"ל צינורות פלקון פוליפרופילן	VWR	21008-951
13 מ"מ x 100 מ"מ צינורות זכוכית	קימבל צ'ייס	60CM13
12 מ"מ x 32 מ"מ בקבוקון שחזור זכוכית צוואר בורג	מים	186000327C
נתרן דודציל סולפט	אמביון	אבקת AM9820	SDS מסוכנת
מכשור
מים Acquity UPLC מערכת H-Class, כולל:
Acquity UPLC H-Class מנהל מדגם FTN
Acquity UPLC H-Class מנהל
Acquity UPLC BEH C18 1.7 ומיקרו; m עמודה
Acquity UPLC PDA גלאי
מים שבר אספן III
Acquity UPLC 30 ס"מ עמוד מחמם/מצנן