דופן התא החיידקי מורכבת מפפטידוגליקן, רשת מקרומולקולרית של גדילי סוכר המוצלבים על ידי פפטידים. כרומטוגרפיה נוזלית עם ביצועים גבוהים מספקת רזולוציה גבוהה ותפוקה לגילויים חדשניים של הרכב פפטידוגליקני. אנו מציגים הליך לבידוד קירות התא (sacculi) והכנתם לאחר מכן לניתוח באמצעות UPLC.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד והכנת קירות תא חיידקי לניתוח קומפוזיציוני על ידי כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים
במאמר זה
סיכום
תקציר
דופן התא החיידקי היא קריטית לקביעת צורת התא במהלך הצמיחה והחלוקה, ושומרת על השלמות המכנית של התאים לנוכח לחצים טורגורים מספר אטמוספרות בעוצמה. על פני הצורות והגדלים המגוונים של ממלכת החיידקים, קיר התא מורכב מפפטידוגליקן, רשת מקרומולקולרית של גדילי סוכר המחוברים על ידי פפטידים קצרים. החשיבות המרכזית של Peptidoglycan לפיזיולוגיה חיידקית עומדת ביסוד השימוש בו כמטרה אנטיביוטית והניעה מחקרים ביולוגיים גנטיים, מבניים ותאיים של האופן שבו הוא מורכב באופן איתן במהלך צמיחה וחלוקה. עם זאת, עדיין נדרשות חקירות מקיפות כדי לאפיין באופן מלא את הפעילות האנזימטית העיקרית בסינתזה פפטידוגליקנית ואת ההרכב הכימי של קירות התא החיידקי. כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) היא שיטה אנליטית רבת עוצמה לכימות הבדלים בהרכב הכימי של קירות החיידקים הגדלים תחת מגוון תנאים סביבתיים וגנטיים, אך התפוקה שלה מוגבלת לעתים קרובות. כאן, אנו מציגים הליך פשוט לבידוד והכנת קירות תא חיידקי לניתוחים ביולוגיים של פפטידוגליקן באמצעות HPLC ו כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים (UPLC), הרחבה של HPLC המשתמשת במשאבות כדי לספק לחצים גבוהים במיוחד של עד 15,000 psi, לעומת 6,000 psi עבור HPLC. בשילוב עם הכנת קירות תא חיידקי המוצגים כאן, מזרקי המדגם בנפח נמוך, גלאים עם שיעורי דגימה גבוהים, נפחי מדגם קטנים יותר וזמני ריצה קצרים יותר של UPLC יאפשרו רזולוציה גבוהה ותפוקה לגילויים חדשים של הרכב פפטידוגליקני וביולוגיה בסיסית של תאי חיידקים ברוב המעבדות הביולוגיות עם גישה לאולטרה-סנטריפוג ו- UPLC.
מבוא
מטרת השיטה המתוארת במסמך זה היא לבודד קירות תא חיידקי שלמים (sacculi) ולעכל את הפפטידוגליקן (PG) כך שניתן יהיה להשתמש בכרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים (UPLC) כדי לספק מידע כגון זהותם של רכיבי muropeptide וריכוזיהם, האורך הממוצע של גדילי הגליקן, ושבריר החומר המעורב בקישורים צולבים בין גדילים. לדיון מפורט על ביוכימיה PG ומינים muropeptide, ישנן מספר ביקורות מצוינות המתארות מבנה PG ותפקידה זיהום, התנגדות, morphogenesis, וצמיחה1-6. כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) לניתוח PG פותחה בתחילה על ידי גלונר ושוורץ בשנות השמונים, ולאחרונה שופרה ויושמתה בהרחבה במעבדות של מיגל דה פדרו ו-וולדמר וולמר. שיטות קודמות השתמשו בניתוח חומצות אמינו או כרומטוגרפיה של....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. לגדל תרבויות חיידקים ב 2.5 מ"ל של מדיה לילה
תרבויות לדלל בחזרה 1:100 לתוך 250 מ"ל של מדיה טרייה לגדול OD600 של 0.7-0.8. הכינו פתרון של 6% נתרן דודקיל סולפט (SDS) במים.
התראה: אבקת SDS מסוכנת - הימנע משאיפת אבקת SDS; ללבוש מסכה על האף והפה.
2. יום 1 - תרביות חיידקים Lysing מבוצע במהלך יום אחד ולילה
- בעוד תרבויות מדוללות גדלות, להקים אמבט מים רותחים על צלחת חמה 1 L. לאחר המים רותחים, aliquot 6 מיליליטר של 6% SDS לתוך צינורות פוליפרופילן 50 מ"ל, להוסיף בר ערבוב אחד קטן לכל צינור, מכסי צינור מאובטח כדי אצבע הדוקה, למקם צינורות באמבט מים, ולהדליק ערבוב 500 סל"ד על הצלחת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות ההליך המתואר באיור 1, המדגם הסופי צריך לכלול לפחות 200 μl של פתרון ברור שסונן ישירות לתוך בקבוקון UPLC (שלב 4.4). הפרדת UPLC של המורופפטידים השונים במדגם חיידקי מסתמכת על המסיסות היחסית שלהם בין השלב הנייד הנוזלי לשלב הנייח של העמודה. עמודי C18 הפוכים מספקים מטריצה הידרופובית חזקה להפרדת מינים muropeptide המבוסס על הידרופוביות וגודל8; מונופולים קוטביים, בעלי משקל מולקולרי נמוך, נוטפים ראשונים, ואוליגומרים בעלי משקל מולקולרי גבוה יותר נוטפים לאחר מכן (איור 2). באיור
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שלב קריטי בהליך זה הוא שלב 3.1 של היום השני של הכנת מדגם. אם SDS יש זירז לילה, או אם הדגימות אוחסנו 4% SDS במשך כמה שבועות בטמפרטורת החדר, הדגימות חייבות להיות reboiled לפחות 1 שעה כדי לפתור מחדש את SDS. סיבה נפוצה עבור משקעים SDS היא השימוש במדיה עם מלחי אשלגן, ולכן אשלגן יש להימנע במדיה במידת האפשר. כפי שצוין בסעיף תוצאות מייצגות, זה גם קריטי כדי להתאים את ה- pH בתוך הנקודה האיזואלקטרית של muropeptides (~ 3.5), אבל לא נמוך מדי מאשר pH 3, או החומר עשוי לזרז. לבסוף, ההשעיה מחדש של המדגם חייבת להתרחש בנפח המתאים של מאגר נ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
עלויות ההפקה של מאמר זה מומנו על ידי תאגיד ווטרס.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי פרס החדשנות החדש של מנהל NIH DP2OD006466 (ל K.C.H.). המחברים מודים לראסל מונדס על הדגמה מעשית של השיטה ועל דיונים מדעיים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פרונאז E | אמרסקו | E629 | |
| מוטנוליזין מ-Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| נתרן בורוהידריד (NaBH<תת>4) | Sigma-Aldrich | 452882 | נתרן בורוהידריד הוא תגובתי מאוד ומסוכן לטיפול |
| בחומצה אורתופוספורית | Sigma-Aldrich | 79607 | חומצה אורתופוספורית היא קורוזיבית ומסוכנת לטיפול |
| בחומצה בורית | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| נתרן אזיד | Sigma-Aldrich | S2002 | נתרן אזיד הוא רעל |
| נתרן טטרבוראט | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μ m מסנני מזרק | פישר | SLGVR04NL | |
| רצועות pH (טווח pH 0-6) | פישר | M95863 | |
| 50 מ"ל צינורות פלקון פוליפרופילן | VWR | 21008-951 | |
| 13 מ"מ x 100 מ"מ צינורות זכוכית | קימבל צ'ייס | 60CM13 | |
| 12 מ"מ x 32 מ"מ בקבוקון שחזור זכוכית צוואר בורג | מים | 186000327C | |
| נתרן דודציל סולפט | אמביון | אבקת AM9820 | SDS מסוכנת |
| מכשור | |||
| מים Acquity UPLC מערכת H-Class, כולל: | |||
| Acquity UPLC H-Class מנהל מדגם FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class מנהל | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 ומיקרו; m עמודה | |||
| Acquity UPLC PDA גלאי | |||
| מים שבר אספן III | |||
| Acquity UPLC 30 ס"מ עמוד מחמם/מצנן |
מקורות
- den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A. Morphogenesis of rod-shaped sacculi. FEMS Microbiol. Rev. 32, 321-344 (2008).
- Holtje, J. V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Bio....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
