ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal

Patrick D. McGurk; C. Ben Lovely; Johann K. Eberhart

doi:10.3791/51190

Method Article

ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal

DOI:

10.3791/51190

⸱

January 30th, 2014

Patrick D. McGurk¹ , C. Ben Lovely¹ , Johann K. Eberhart¹

¹Institute for Cell and Molecular Biology, The University of Texas at Austin

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

confocal הדמיה זמן לשגות היא טכניקה רבת עוצמה שימושית לאפיון התפתחות עוברית. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה ולאפיין המורפוגנזה craniofacial בסוג פראי, כמו גם PDGFRA, smad5, וSMO עוברים שעברו מוטציה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זמן לשגות הדמיה היא טכניקה המאפשרת תצפית הישירה של תהליך המורפוגנזה, או הדור של צורה. בשל הבהירות האופטית שלהם ורמת מוכנות למניפולציה גנטית, עובר דג הזברה הפך אורגניזם מודל פופולרי שבה לביצוע ניתוח הזמן לשגות של המורפוגנזה בעוברי חיים. ההדמיה confocal של עובר דג הזברה לחיות דורשת כי רקמה של עניין היא שכותרתו בהתמדה עם סמן פלואורסצנטי, כגון transgene או צבע שהוחדר. התהליך דורש כי העובר הוא הרדים ושנערך במקום בצורה כזאת, שהתפתחות בריאה ממשיכה כרגיל. פרמטרים להדמיה חייבים להיות מוגדרים חשבון לצמיחה תלת ממדים וכדי לאזן את הדרישות של פתרון תאים בודדים תוך קבלת תמונות מהירות של פיתוח. התוצאות שלנו מראות את היכולת לבצע לטווח ארוך בתחום ההדמיה vivo של עוברי דג הזברה שכותרתו הקרינה ולזהות התנהגויות רקמה מגוונות בהרכס עצבי הגולגולת שגורמים למומי craniofacial. עיכובים התפתחותיים הנגרמים על ידי הרדמה והרכבה הם מינימאליים, והם עוברים ללא פגע על ידי התהליך. ניתן להחזיר עובר זמן לשגות הדמיה למדיום נוזלי ולאחר מכן צילם או קבוע בנקודות מאוחרות יותר בהתפתחות. עם שפע הולך וגדל של קווים מהונדסים דג הזברה ומיפוי גורל מאופיין היטב וטכניקות השתלה, הדמיה כל רקמה רצויה אפשרית. ככזה, זמן לשגות בתחום ההדמיה vivo משלב עוצמה עם שיטות גנטיות דג הזברה, כוללים ניתוחים של עוברים שעברו מוטציה וmicroinjected.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המורפוגנזה Craniofacial היא תהליך רב שלבים מורכב הדורש אינטראקציות מתואמות בין סוגי תאים מרובים. רוב שלד craniofacial נגזר מתאי רכס עצביים, שרבים מהם חייבים לעבור מ הצינור העצבי הגבי למבנים ארעיים שנקראים קשתות בלוע ^1. כמו ברקמות רבות, המורפוגנזה של שלד craniofacial היא יותר מסובכת ממה יכול להיות מובן על ידי תמונות סטטיות של עוברים בנקודות זמן ההתפתחותי ספציפיות. למרות שזה הוא לבצע זמן רב, in vivo מיקרוסקופיה זמן לשגות מספקת מבט מתמשך בתאים של עובר המתפתח ורקמות. כל תמונה בסדרת הזמן לשגות מעניקה הקשר לאחרים, ומסייעת למהלך חוקר לכיוון של הסקה מדוע תופעה מתרחשת ולא הסיק את מה שמתרחש באותו זמן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. גידול בעלי חיים וMutant אללים

לגדל ולהרבות דג הזברה כמתואר ^21.
אללים מוטציה דג הזברה השתמשו במחקר זה היו PDGFRA ^{b1059 16, B1100} smad5 ^{22, וb577} SMO ^23. מקורות לזני דג הזברה אלה כוללים Zirc.

2. הכנה של פתרונות ומיישמת

הערה: כל הפתרונות וכלים יכולים להתבצע מראש ולאחסן לשימוש עתידי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעוברי wild-type, בעקבות אוכלוסיית רכס עצבית, קשתות בלוע להאריך לאורך צירי הגחון קדמי / אחורי וגב / תוך כדי התנועה בכיוון מקורי (סרט 1). ב30 שעות לאחר הפריה (hpf), האורך קדמי / האחורי של קשת בלוע הראשונה הוא בין 1.8-1.9 פעמים הגבי / גובה גחונה. גב / התארכות הגחון ממשיכה בהתמדה, מהר יותר מאשר הארכה קדמית / אחורי עד 36.5 hpf. מכאן, גב / מישורים גובה הגחון סביב 104 מיקרומטר באמצעות 48 hpf. הרחבה קדמית / אחורית ממשיכה דרך 48 hpf, עם אורך קדמי / אחורי הכולל הגדלת מתחת .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות היא כלי רב עוצמה לניתוח של התפתחות. הנה, אנחנו מדגימים את התועלת של השיטה בלימוד המורפוגנזה קשת בלוע בדג זברה שהן מוטציה למסלולי איתות חשובות באמצעות מהונדס כי תוויות בתאי רכס עצביים. בנוסף לרמת רקמת ניתוחים, ניתוחי זמן לשגות תקפים גם לניתוח בקנה מידה סלולרית ^28. יכולות גם להיות משולבות שיטות דג הזברה בשימוש נרחבת רבות לניסויים במיקרוסקופיה הזמן לשגות, כולל microinjection של morpholinos, mRNAs, או בונה מהונדס, כמו גם השתלות בין עוברים. נית.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למליסה גריפין וג'נה Rozacky לטיפול דגי המומחה שלהם. הודות PDM EGN לכתיבת סיוע, נדיבות, וסבלנות. עבודה זו נתמכה על ידי NIH / NIDCR R01DE020884 לJKE.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
6 lb קו מונופילמנט מבחן	Cortland Line Company	SLB16
Agarose I	Amresco	0710
Argon laser	LASOS Lasertechnik GmbH	LGN 3001
סידן כלוריד	Sigma-Aldrich	C8106
צינורות נימיים, 100 מ"מ, 0.9 מ"מ ID	FHC	30-31-0
שמן ציפורן	Hilltech קנדה בע"מ	HB-102
גריז ואקום גבוה	דאו קורנינג	2021846-0807
חממת אמבטיה יבשה איזוטמפ	פישר סיינטיפיק	2050FS
מיקרוסקופ סריקת לייזר	Carl Zeiss AG	LSM 710
מגנזיום סולפט הקסהידרט	סיגמא-אולדריץ'	230391
זכוכית כיסוי מיקרוסקופ, 22 x 22-1	פישר סיינטיפיק	12-542-B
זכוכית כיסוי מיקרוסקופ, 24 x 60-1	פישר סיינטיפיק	12-545-M
אשלגן כלורי	פישר סיינטיפיק	M-11321
אשלגן פוספט דו-בסיסי	סיגמא-אולדריץ'	P3786
נתרן כלורי	פישר סיינטיפיק	M-11624
נתרן פוספט דו-בסיסי	סיגמא-אולדריץ'	S7907
TempController 2000-2	PeCon GmbH
Tricaine-S	Western Chemical, Inc.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trainor, P. A., Melton, K. R., Manzanares, M. Origins and plasticity of neural crest cells and their roles in jaw and craniofacial evolution. Int. J. Dev. Biol. 47, 541-553 (2003).
Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles