הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד של תאי T αβ כפול שליליים מהכליות

11.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51192

⸱

16 במאי 2014

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

תאי DNabT הם נדירים בין תאי T היקפיים; עם זאת, הם נמצאים בשפע ברקמות שאינן הלימפה מסוימות. קושי של בידוד תאי T DN מרקמות שאינן הלימפה מעכב אנליזה הפונקציונלית שלהם למרות במיוחד גדל הבחין במשמעות pathophysiologic. אנו מתארים פרוטוקול חדשני לבידוד של תאי T DN נקיים במיוחד מכליות עכבריות.

תקציר

אין כרגע פרוטוקול סטנדרטי לבידוד של תאי T DN מהרקמות שאינן הלימפה למרות המעורבות דיווחה יותר ויותר שלהם בתגובות חיסוניים שונות. תאי T DN הם סוג תא חיסון ייחודי שהיה מעורב בויסות תגובות וסובלנות חיסוניים ואוטואימוניות לallotransplants 1-6. תאי T DN, לעומת זאת, נדיר בדם היקפי ואיברים משניים הלימפה (בלוטות לימפה וטחול), אבל הם התושבים עיקריים של הכליות תקינות. מעט מאוד ידוע על תפקוד pathophysiologic 7 בשל מיעוטם בפריפריה. לאחרונה תיארו ניתוח פנוטיפי ופונקציונלי מקיף של אוכלוסייה זו בכליות 8 במצב יציב, ובמהלך פגיעת reperfusion איסכמיה. ניתוח של תפקוד תא T DN יהיה משופר מאוד על ידי פיתוח פרוטוקול לבידודם מהכליה.

כאן אנו מתארים פרוטוקול רומן המאפשר isolation של תאים טהורים מאוד ab מסוג CD4 + CD8 + T ותאי T DN מהכליות העכבריות. בקצרה, אנחנו לעכל רקמת כליה באמצעות collagenase ובודד תאים חד גרעיניים בכליות (KMNC) על ידי שיפוע צפיפות. זה ואחריו שני צעדים להעשרת תאי T hematopoietic מ -3% ל 70% מKMNC. הצעד הראשון מורכב מסלקציה חיובית של תאי hematopoietic באמצעות CD45 + ערכת בידוד. בשלב השני, תאי T DN מבודדים באופן שלילי על ידי הסרת תאים הלא רצויים באמצעות CD4, CD8, וMHC הכיתה השני נוגדנים חד שבטיים וtetramer α-galcer CD1d. אסטרטגיה זו מובילה לאוכלוסייה של תאי DN T יותר מ 90% טהורים. צביעת משטח עם הנוגדנים שהוזכרו לעיל ואחרי ניתוח FACS משמשת כדי לאשר את טוהר.

מבוא

ההיקפית αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - כפולה שלילי תאים (DN) T מחולקים לקבוצות משנה שונות שיש להם פנוטיפים ופונקציות 1-4 מובחנים. תאי T DN גרוע הם הבינו, אבל יותר ויותר להיות מעורבים בתגובות חיסונית pathophysiological במודלים של מחלות שונות 4-6.

תאי T DN הם סוג תא חיסון ייחודי כי הוא מעורב יותר ויותר ברגולציה של תגובות חיסוניים ומחלות אוטואימוניות שונות והאפנון של סובלנות allotransplant. 4-6, 9 הם נדירים בדם ההיקפי ואיברי הלימפה משניים (בלוטות לימפה וטחול ). עם זאת, הם תושבים עיקריים של האפיתל בכליות ומעיים הנורמלי 10-12. מעט מאוד ידוע על תפקידם 7 בכליות במצב היציב ותחת מצבים פתולוגיים כגון פגיעה אקוטית בכליות (AKI) הקשורים transpl כליותנמלה.

בגלל התפקידים המורכבים של תאים חיסוניים שונים בויסות תגובה חיסונית כולל alloresponses, המגדיר את תפקידו של כל שחקן הוא קריטי בהבנת alloresponses ועיצוב תרופות חדשות. בהתחשב במספרים המשמעותיים של תאי T DN הווה בכליות בתנאים פיסיולוגיים ומחלות שונים, תאי T DN עשויים לשחק תפקיד קריטי בויסות תגובה חיסונית ומחלות אוטואימוניות בעכברים ובבני אדם, וalloresponses במושתלים. צבירה למרות שראיות עדיין מפוזרות מפלילה תאי DN T בשתי פונקציות פתוגניים ומדכאות את מערכת חיסון, אבל הוא הבין למה ואיך הם מפגינים פונקציה מזיקה או מדכאת ספציפית ואיך הסביבה משפיעה עליהם בצורה גרועה.

בשל השפע הנמוך שלהם בכליות, שיטות משופרות של בידוד נחוצות.

אין כרגע פרוטוקול סטנדרטי לבידוד של תאי T מDN tהוא רקמות שאינן הלימפה. הפרוטוקול שלנו מתאר שיטה חדשה לבידוד של תאי T DN מהכליות; עם זאת, השיטה יכולה לשמש גם לרקמות שאינן הלימפה שונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת מכשירים, תרבות מדיה וריאגנטים

  1. מכשירים: הכינו את חומרים כימיים בתנאים סטריליים ולהשתמש בזרימה למינרית.
  2. הכן 1 ליטר של מדיום תרבית רקמת RPMI, להוסיף 5% בסרום שור עוברי, 2.1 גרם של סודה לשתייה, 10 מיליליטר גלוטמט 100x, 10 מ"ג HEPES, פירובט מ"ג נתרן 1 ו10 מיליליטר של 100x פניצילין / סטרפטומיצין.
    הערה: הבינוני מומלצת רקמות התרבות, RPMI, הוא להחלפה עם DMEM.
  3. הכן את פתרון 5% collagenase "D" (5 מיליליטר של collagenase "D" ל9 מיליליטר של מדיום תרבית רקמה).
  4. הפוך פתרון Percoll בשלושה ריכוזים שונים: 100%, 80% ו40%. הריכוזים הבאים מחושבים למדגם 1. שמור על פתרונות בטמפרטורת חדר.
    1. פתרון Percoll: להוסיף 9 מיליליטר של Percoll חי (מפתרון מניות); להוסיף 1 מיליליטר של PBS 10x.
    2. פתרון Percoll: להוסיף 8 מיליליטר של Percoll 100%; להוסיף 2 מיליליטר של PBS 1X.
    3. פתרון Percoll:להוסיף 4 מיליליטר של Percoll 80%; להוסיף 4 מיליליטר של PBS 1X.
  5. הפוך 1 ליטר של תא הקרינה המופעל מיון חיץ (FACS); להוסיף 5 מיליליטר BSA 10% (BSA 0.1%), 1 מיליליטר 10% אזיד הנתרן (0.1%), 2 סוכן מיליליטר EDTA, לעשות עד 1,000 מיליליטר עם 1X PBS.

2. הכנת עיכול כליות

  1. לאחר שרכש כל אישור מוסדי צורך, להקריב ולגרום לדימום מחודש העכברים עם שיטות סטנדרטיות ובעקבות התקנות הנוכחיות והנחיות טיפול בבעלי החיים.
    1. להרדים את העכבר עם pentobarbital (0.07 מ"ג / קילוגרם).
    2. המשך exsanguination.
    3. מניחים את העכבר בעמדת פרקדן על שולחן ניתוחים.
    4. לרסס את אזור הבטן עם 70% אתנול.
  2. הוסף 10 מיליליטר של תמיסת D collagenase לצלחת פטרי.
  3. הסר וdecapsulate שני הכליות מכל עכבר.
    1. פתח את חלל abdomimal על ידי ביצוע חתך קו האמצע דרך עור הבטן והצפק מעצם החזה ועדהערווה.
    2. לחשוף את הכליה השמאלית על ידי הזזת המעי רוחבית לצד.
    3. להפריד בזהירות את הקפסולה נשארה עם המלקחיים.
      הערה: הכמוסה מופיעה כשכבת שקופה המקיפה את הכליה ומכוסה חלקית על ידי רקמת שומן perinephric.
    4. הסר את הכליה השמאלית על ידי חיתוך כלי pedicle באמצעות מספריים כירורגיות.
    5. חזור על אותו התהליך עבור הכליה הימנית.
      הערה: הכליה הימנית היא יותר גולגולתי ויותר קרובה לקו האמצע (pedicels הם קצרים יותר).
  4. הנח את הכליה לתוך צלחת פטרי.
  5. חותכים את רקמת הכליה לחתיכות קטנות (1-2 מ"מ בממד) באמצעות סכין מתכת בעיצוב רגיל ומניח את החתיכות לתוך תמיסת collagenase ל30-45 דקות בחממה ב 37 ° C (איור 1).

3. הכנת תאים חד גרעיניים בכליות (KMNC) מעיכול הכליות

  1. לקבל השעיה תא של הכליהעיכול על ידי מכאני לשבש את הרקמה באמצעות מסננת (70 מיקרומטר) ו resuspend ב 25 מיליליטר של מדיום תרבית רקמה ומערבבים.
  2. צנטריפוגה ב XG 400 10 דקות ב 4 ° C עד גלולה ההשעיה התא.
  3. Re-להשעות גלולה ב 4 מיליליטר של 40% פתרון Percoll ועדינות שכבה על גבי 4 מיליליטר של 80% פתרון Percoll עם טפטפת פלסטיק העברה, מאוד לאט ובזהירות. זה יגרום בשני שלבים מופרדים על ידי שכבה שקופה באופן ברור. בחלק העליון תהיה שכבה צהובה המתאימה לשומנים.
  4. צנטריפוגה ב 1,500 XG במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר עם צנטריפוגות בבלם ממצב.
  5. הסר על ידי שאיפה לשכבה הצהובה ועבה העליונה (כ 1-2 מיליליטר).
  6. לאסוף את השכבה הקלה בלבד לבנבן השקופה מהממשק של שני השלבים עם טפטפת העברה. להעביר בזהירות השעיה זו לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל 2 מיליליטר של מדיום תרבית רקמה ולאחר מכן להוסיף 13 מיליליטר של מדיום כדי להפוך את הנפח כולל של15 מיליליטר.
  7. צנטריפוגה ב XG 400 10 דקות ב 4 ° C.
  8. Resuspend הדגימות ב 1 מיליליטר של המדיום.
  9. לספור את מספר KMNC באמצעות הרחקת trypan הכחולה על hemocytometer ולבטא אותן התוצאות כמו מספרים של KMNC למ"ל לכליות.
  10. שטפי פעם כאמור לעיל.

4. תאי בידוד של hematopoietic (+ CD45) מKMNC (שלב I)

  1. Resuspend התאים עד 10 7 ל90 μl של הפעלת מאגר.
  2. הוסף 10 μl של microbeads CD45 ודגירה של 15 דקות ב 4 ° C.
  3. הוסף 1 מיליליטר של החיץ פועל כדי לעצור את התגובה. צנטריפוגה ב XG 400 10 דקות ב 4 ° C ו resuspend ב 500 μl של הפעלת מאגר.
  4. הכן את העמודה המגנטית על ידי הצבת במגנט ולשטוף עם 3 מיליליטר של הפעלת מאגר.
  5. להעביר את ההשעיה התא דרך העמודה המגנטית ולאסוף את התאים ללא תווית שעוברים דרך העמודה.
  6. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 3 מיליליטר של running חיץ. ואז לאסוף את השפכים.
  7. הסר את העמודה מהמפריד ופיפטה 5 מיליליטר של חיץ פועל על גבי העמודים ולשטוף את החלק שכותרתו באופן מיידי. חלק זה מכיל את CD45 + התאים. ספירת התאים.
  8. כדי לחשב את המספר המוחלט של תת קבוצות תאי T שונות לתוך הכליות להכפיל את המספר הכולל של KMNC ידי אחוז התאים החיוביים שנקבע על ידי cytometry זרימה (איור 2).

5. בידוד של תא T מDN CD45 + ההכנה על ידי סלקציה שלילית (שלב II)

  1. הוסף 2.5 μl (0.5 מ"ג / מיליליטר, מיקרוגרם 1.25) של כל אחד מנוגדני biotinylated הבאים: אנטי CD4, אנטי CD8, קולט אנטי-FC (CD16/32), אנטי-MHC הכיתה השני (IA ב), אנטי tetramer CD1d PBS-57 לכל 10 תאים 7 hematopoietic.
  2. דגירה תאים למשך 30 דקות בחדר קר.
  3. הוסף 1 microbeads אנטי ביוטין מיליליטר.
  4. דגירה במשך 30 דקות בחדר קר.
  5. מניחים את הצינור בtהוא המגנט ולהמשיך לדלדול.
  6. ספירת תאי קיימא כדי לקבוע את המספר הכולל של תאי DN T בחלק השלילי באמצעות hemocytometer.
  7. בדוק טוהר תאי DN T עם cytometry זרימה על ידי ביצוע אסטרטגית gating זה: + CD45 השער ראשון, שער השני TCRαβ +. תכלול CD1d + תאים. עלילה מסוג CD4 + CD8 + לעומת לזהות תאי DN T (איור 3).
  8. הכפל את המספר הכולל של אחוז שנקבע בטהרה.
    הערה: שימוש בתוצאות פרוטוקול זה באוכלוסייה של תאי DN T יותר מ 90% טהורים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כליות סוג בר C57BL / 6 (B6) מכילה כ 1.5-2.1 x 10 6 תאים חד גרעיניים לכליות. כ פחות מ -10% הם CD45 + תאי hematopoietic. להכנת תאים חד גרעיניים בכליות (KMNC), הכליות לחתוך לחתיכות קטנות כפי שמוצגים באיור 1 ואחרי עיכול באמצעות collagenase 5%.

זה ואחריו על ידי ביצוע צנטריפוגה שיפוע צפיפות לאסוף שכבת KMNC (איור 2, פנל משמאל). KMNC אז היו נתונים לסלקציה חיובית באמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

יש עניין גובר בתאי T DN שכן הם נמצאים מעורבים בתנאים פתולוגיים שונים כגון הפרעות אוטואימוניות, סרטן, סובלנות שתל, ומחלות עיקריות של הכליות כולל פציעת כליות חריפה (AKI), גלומרולונפריטיס 8, 13. לכן, יש צורך להבין טוב יותר ולאפיין את פונקציות pathophysiologic של תאי T DN. עם זאת, כיום יש חוסר בהבנה של התפקוד של התאים אלה בהשוואה לתאי CD4 ו CD8 T. סיבה העיקרית היא מחסור בתאי T DN באיברי הלימפה משניים ומכאן קושי בהשגת תאים מספיקים לניתוח במבחנה וניסויים העברת מאמצת....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי NIH PBS (R21 AI095484). אנו מודים למתקן גרעין tetramer ביטוח בריאות ממלכתי לtetramer CD1d.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קולט אדים למינארי Baker Company, Incאו ציוד שווה ערך 
צנטריפוגהבקמן קולטראו ציוד שווה ערך 
המוציטומטרמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית63514-11
חממה מבוקרת אטמוספירהפישר סיינטיפיק ( 37 מעלות; C עם 5% CO2)
ציטומטר זרימה אנליטיתLSR II
RPMI 1640Media Tech10-040-CV
קולגנאז DRoche11088858001
Percoll GE Healthcare17-0891-01
סרום בקר עוברי Corning Cellgro35-011-CV
0.1% נתרן אזיד (NaN3)Sigma-AldrichS2002
בופר פוספט מאגר מלח (PBS)Corning Cellgro21-040-CV
PBS 10xMediatech46-013-CM
EDTA buffer טורים של Sigma-AldrichE1161
LS MiltenyiBiotec130-042-401
CD45+ מיקרו-חרוזיםMiltenyiBiotec6.78E-51
מיקרו-חרוזי ביוטין MiltenyiBiotec130-090-485
אנטי-CD45 (שיבוט: 30-F11)  PerCP eBioscienceG1397
אנטי-CD45 (שיבוט: 30-F11)  APC-Cy7Biolegend103116
אנטי-TCR פסיפיק בלו  (שרשרת ab, שיבוט: H57-597)InvitrogenHM3628
anti-CD4 PEeBioscience12-0043
anti-CD8 FITCeBioscience8011-0087
anti-CD4 biotinylated (GK1.5)BD553728
anti-CD8 biotinylated  (שיבוט 53-6.7)BD553029
אנטי-MHC Class II (I-A b) מאגר ריצה ביוטינילBD
- מאגר הפרדה של MACS MIlteny I Biotec130-091-221
C57BL/6J עכבריםJackson Labs000664כליות - בלוטות לימפה
צלחת פטרי BD Biosciences356517
70 & #956; מסנן M פישר סיינטיפיק22363548
בוכנה או ציוד שווה ערך 
צינורות GeneMate 50 מ"לBioexpressC-3394-3או ציוד שווה ערך 
צינורות GeneMate 15 מ"לBioexpressC-3394-1או ציוד שווה ערך 
CD1d α-galcer tetramerNHI
553609-AutoMACS

מקורות

  1. Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med. 6, 782-789 (2000).
  2. Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo. J Exp Med. 196, 261-267 (2002).
  3. Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression. J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).
  4. Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells. Blood. 100, 3408-3414 (2002).
  5. Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice. Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).
  6. Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells. J Immunol. 171, 134-141 (2003).
  7. Mohamood, A. S., et al. Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells. Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).
  8. Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).
  9. Hamad, A. R., et al. B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production. J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).
  10. Rabb, H., et al. Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).
  11. Burne, M. J., et al. Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).
  12. Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation. 74, 759-763 (2002).
  13. Crispin, J. C., et al. Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys. J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).
  14. Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice. Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).
  15. Dowdell, K. C., et al. Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome. Blood. 115, 5164-5169 (2010).
  16. Juvet, S. C., et al. FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice. J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).
  17. Thomson, C. W., et al. FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function. J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תיקון


Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 2/10/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.

There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:

Samatha Bandapelle

instead of:

Samantha Bandapelle

תגיות

תאי כליה חד-גרעינייםעיכול בקולגנאזסנטריפוגציה במדרג צפיפותברירה חיובית של CD45ברירה שליליתאנליזה פלוו-ציטומטריתהפרדה באמצעות חרוזי מגנטהעשרה של תאים המטופואטייםבידוד כליות של עכבר
בידוד של תאי T αβ כפול שליליים מהכליות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.