ניטור תחרות תוך-מין באוכלוסיית תאים חיידקיים על ידי Cocultivation של זנים שכותרתו פלואורסצנטית

סיכום

חיידקים עשויים לצבור מוטציות מזיקות או מועילות במהלך חייהם. באוכלוסייה של תאים אנשים שצברו מוטציות מועילות עשויים במהירות עולים על חבריהם. כאן אנו מציגים הליך פשוט כדי לדמיין תחרות intraspecies באוכלוסיית תאים חיידקיים לאורך זמן באמצעות אנשים בעלי תווית פלואורסצנטית.

תקציר

מיקרואורגניזמים רבים כגון חיידקים מתרבים מהר מאוד והאוכלוסיות עשויות להגיע לצפיפויות תאים גבוהות. שברים קטנים של תאים באוכלוסייה תמיד צברו מוטציות מזיקות או מועילות לתא. אם אפקט הכושר של מוטציה מספק תת-אוכלוסין עם יתרון צמיחה סלקטיבי חזק, האנשים של תת-אוכלוסיות זו עשויים במהירות outcompete ואפילו לחסל לחלוטין את חבריהם המיידיים. לכן, שינויים גנטיים קטנים הצטברות מונחה בחירה של תאים שרכשו מוטציות מועילות עלול להוביל לשינוי מוחלט של הגנוטיפ של אוכלוסיית התא. כאן אנו מציגים הליך כדי לפקח על התפשטות שיבוט מהירה וחיסול של מוטציות מועילות ומזיקות, בהתאמה, באוכלוסיית תאים חיידקיים לאורך זמן על ידי cocultivation של אנשים שכותרתו פלואורסצנטית של חיידק מודל גרם חיובי Bacillus subtilis. השיטה קלה לביצוע וממחישה מאוד כדי להציג תחרות intraspecies בקרב אנשים באוכלוסיית תאים חיידקיים.

מבוא

חיידקי קרקע ניחנים בדרך כלל ברשתות רגולטוריות גמישות ויכולות מטבוליות רחבות. שתי התכונות מאפשרות לתאים להתאים את המסלולים הקטבוליים והאנאבוליים שלהם כדי להתחרות עם חבריהם ומיקרואורגניזמים אחרים עבור החומרים המזינים, הזמינים בנישה אקולוגית נתונה¹. עם זאת, אם החיידקים אינם מסוגלים להסתגל לסביבתם מנגנונים אחרים עשויים להסביר את הישרדותו של מין. ואכן, כמו חיידקים רבים להתרבות מהר ואת האוכלוסיות יכול להגיע צפיפות תאים גבוהה תת-אוכלוסיות אולי צברו באופן ספונטני מוטציות מועילות המספקות לתאים יתרון גדילה סלקטיבי ולכן להגדיל את הכושר שלהם. יתר על כן, נקודות חמות מוטציה ו mutagenesis הסתגלות הנגרמת על ידי מתח יכול להקל על האבולוציה של חיידק לא מזוהה^2,3. לכן, הצטברות של מוטציות וצמיחה תחת בחירה רציפה היא המקור למגוון המיקרוביאלי העצום, אפילו בתוך אותו סוג^4,5. כמו בטבע, עיצוב של גנומים חיידקיים מתרחש גם במעבדה עקב טיפוח מתמשך תחת בחירה. הדבר בא לידי ביטוי בביות של החיידק גראם חיובי B. subtilis, אשר משמש ברחבי העולם במחקר בסיסי ובתעשייה. בשנות ה-40 של ה-40 טופלה סובטיליס בצילומי רנטגן מזיקים לדנ"א ולאחר מכן בטיפוח בתנאי צמיחה מסוימים⁶. המוטציות שהצטברו בחיידקים במהלך הביות שלהם מסבירות את אובדן מאפייני הגדילה הרבים, כלומר זן מעבדת B. subtilis 168 איבד את היכולת ליצור מושבות מורכבות^7,8.

כיום, עבור חיידקי המודל הנחקרים ביותר Escherichia coli ו- B. subtilis, מגוון כלים רבי עוצמה זמינים לתפעל גנטית את הגנום שלהם כדי לענות על שאלות מדעיות ספציפיות. לפעמים חוסר ההשבתה של גן עניין גורם פגם צמיחה חמור, אשר לאחר מכן גלוי בבירור על מדיום צמיחה סטנדרטי⁹. לעומת זאת, לעתים קרובות מתעלמים ממוטציות הגורמות לפגם צמיחה חלש ובכך משפיעות רק במעט על כושר הזן. עם זאת, בשני המקרים דגירה ממושכת והעברת זנים מוטנטים במשך כמה דורות בדרך כלל לגרום הצטברות של מוטנטים מדכאים כי החזירו את הפנוטיפ של זן האב^2,9. האפיון של מוטנטים מדכאים וזיהוי המוטציות שהחזירו את פגם הצמיחה של זן מוטנט האב היא גישה מועילה מאוד המאפשרת הבהרה של תהליכים תאיים חשובים ולעתים קרובות חדשניים^10,11.

אנו מעוניינים בשליטה של הומאוסטזיס גלוטמט ב B. subtilis¹². בדומה ל- E. coli, B. subtilis מגיב להטרדה של הומאוסטזיס גלוטמט (כלומרלחסום השפלה גלוטמט²) על ידי הצטברות של מוטנטים מדכאים. השינויים הגנומיים במוטנטים מדכאים אלה שנרכשו על ידי מוטציה ספונטנית הוכחו כמשקמים במהירות הומאוסטזיס גלוטמט^9,13. לכן, אין זה מפתיע כי הסתגלות של B. subtilis למצב צמיחה ספציפי במהלך ביות של החיידק משתקף סינתזת אנזים ובפעילויות אנזימטיות התפתחו, אשר מעורבים בחילוף החומרים גלוטמט¹². הוצע כי חוסר גלוטמט אקסוגני במדיום הצמיחה במהלך תהליך הביות היה הכוח המניע להופעת קיבעון של גלוטמט מסתורי דהידרוגנאז (GDH) gudB^CR גן בזן המעבדה 168^2,14. השערה זו נתמכת על ידי התצפית שלנו כי הכמות המופחתת של פעילות GDH בזן המעבדה מספקת לחיידקים יתרון גדילה סלקטיבי כאשר גלוטמט אקסוגני הוא נדיר². יתר על כן, טיפוח של זן B. subtilis, סינתזה של GDH GudB, בהיעדר תוצאות גלוטמט אקסוגני הצטברות של מוטנטים מדכאים שהשביתו את הגן gudB ². ברור, הנוכחות של GDH פעיל קטבולי הוא נחות עבור התא כי גלוטמט המיוצר באנדוגניות כי אחרת יכול לשמש אנבוליזם הוא מושפל אמוניום ו 2-oxoglutarate (איור 1). לעומת זאת, כאשר גלוטמט מסופק על ידי המדיום, זן B. subtilis מצויד בפעילות GDH ברמה גבוהה יש יתרון צמיחה סלקטיבית על פני זן כי מסנתז רק GDH פונקציונלי אחד. סביר להניח שפעילות GDH ברמה גבוהה מאפשרת לחיידקים להשתמש בגלוטמט כמקור פחמן שני בנוסף למקורות פחמן אחרים המסופקים על ידי המדיום² (ראו איור 1). לכן, פעילות GDH משפיעה מאוד על כושר של חיידקים, בהתאם לזמינות של גלוטמט אקסוגני.

כאן אנו מציגים שיטה מאוד להמחשה כדי לנטר ולהמחיש תחרות תוך-מינית בין שני זנים של B. subtilis השונים במקום אחד על הכרומוזום (איור 2). שני הזנים סומנו עם הגנים yfp ו- cfp המקודדים את YFP ו- CFP פלואורופורים, ו cocultivated בתנאים תזונתיים שונים. על ידי דגימה לאורך זמן ועל ידי ציפוי דילול מתאים על צלחות אגר הניצולים בכל אחת מהתרבויות ניתן לפקח בקלות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו נפוץ. ההליך המתואר במאמר זה קל לביצוע ומתאים לדמיין את ההתפשטות המהירה של שיבוט וחיסול מוטציות מועילות ומזיקות, בהתאמה, באוכלוסיית תאים לאורך זמן.

פרוטוקול

1. הכנת צלחות אגר, מדיה תרבותית, קריוסטוקים וקדם-תרבויות

1. הכן מדיית צמיחה ריאגנטים נדרשים (ראה טבלה של חומרים ריאגנטים).
2. פס הזנים B. subtilis (למשל. BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-yfp)ו- BP52 (rocG⁺ gudB⁺ amyE::P_gudB-cfp) המבטאים GDHs פעיל אחד ושתיים, בהתאמה)² שישמשו בניסוי התחרות על לוחות אגר בינוני SP כדי לקבל מושבות בודדות. דגירה הצלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
3. קח מושבות בודדות לחסן צינורות תרבות סטריליים המכילים 4 מיליליטר LB נוזלי בינוני. לגדל את החיידקים לילה ב 28 °C (69 °F) ו 220 סל"ד.
4. לגדול תרבויות לילה ב 28 °C (69 °F) כדי למנוע כי התאים lyse או לקעקע.
5. למדוד את הצפיפות האופטית של התרבויות באורך גל של 600 ננומטר (OD₆₀₀₎באמצעות ספקטרופוטומטר סטנדרטי.
6. אם התרבויות הגיעו OD₆₀₀ של 2.0, לערבב 0.75 מ"ל של התרבויות עם 0.75 מיליליטר של פתרון גליצרול סטרילי 50% ב 1.5 מיליליטר צינורות תגובה. OD_{הסופי 600} צריך להיות 1.0 כדי להשיג cryostocks המכיל כ 10⁸ תאים / מיליליטר.
7. לאחסן את הצינורות ב -80 מעלות צלזיוס.
8. הפוך שלוש precultures של כל זן שכותרתו עם cfp ו yfp קידוד גנים פלואורופור. לחסן את precultures (צינורות תרבות סטרילית המכילה 4 מיליליטר LB נוזלי בינוני) עם 1 תאים μl מ -80 מעלות צלזיוס cryostocks. דגירה את התרבויות לילה ב 28 °C (69 °F) ו 220 סל"ד.

2. Cocultivation של חיידקים, איסוף מדגם, ואחסון מדגם

1. מכינים טריים 100 מ"ל C-Glc ו- CE-Glc בינוני מינימלי (ראה טבלה של ריאגנטים וחומרים), ומעבירים 20 מ"ל של כל מדיום לתוך צלושי טלטול סטריליים 100 מ"ל.
2. קח 0.1 מ"ל של precultures שגדלו בן לילה, לדלל אותם עם 0.9 מיליליטר LB בינוני ב 1.5 מיליליטר cuvette, ולקבוע את OD₆₀₀.
3. לניסוי התחרות, לקחת את אלה precultures של זנים שונים שיש להם OD_{דומה 600 בין} 1.0-1.5.
4. כדי להשיג אוכלוסיות תאים מעורבות, לדלל את התאים של precultures כי היה המתאים OD₆₀₀ כדי OD₆₀₀ של 0.05 ב 20 מיליליטר C-Glc ו CE-Glc בינוני מינימלי בתוספת 100 מ"ל לנער בקבוקונים. לניסוי התחרות יש לערבב בין שני הזנים ביחס של 1:1.
5. קח 10 דגימות מיליליטר מן הבקבוקים, להעביר אותם 15 מ"ל צינורות פלסטיק, לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 4,000 x g בצנטריפוגה העליון שולחן סטנדרטי, ולהשליך את supernatant.
6. לשים מחדש את התאים 0.5 מ"ל טרי LB בינוני, ולהעביר את התאים לתקרה סטרילית 1.5 מ"ל תגובה. מוסיפים 0.5 מ"ל של גליצרול סטרילי 50%, מערבבים את ההשעיה על ידי מערבולת קפדנית ומאחסנים את הדגימות במקפיא של -80 מעלות צלזיוס עד להמשך הטיפול.
7. דגירה את התאים שנותרו צלוחי לנער עד 24 שעות ב 37 °C (60 °F) ו 220 סל"ד. שמור את צלושי לנער בחושך כדי למנוע הלבנה תמונה של פלואורופורים.
8. קח דגימות נוספות של 0.1 מיליליטר לאחר 7 שעות ו 24 שעות של צמיחה. למדוד ולשים לב OD₆₀₀ של 1:10 דילול (ב C-Glc או CE-Glc בינוני מינימלי) של הדגימות.
9. קח את הכמות המתאימה של תאים מכל תרבות כדי להפוך cryostocks כי יש OD₆₀₀ של 1.0. לאחסן את הדגימות ב -80 מעלות צלזיוס עד להמשך הטיפול.

3. טיפול מדגמי, ציפוי והדגירה לניתוחים כמותיים

1. לאחר איסוף כל הדגימות, להפשיר את cryostocks, לדלל את התאים בתמיסת מלח 0.9% (ראה טבלה של ריאגנטים וחומרים) עד^10-3.
2. צלחת 0.1 מ"ל של 10^-3 דילול על לוחות אגר בינוני SP ולהפיץ את התאים באמצעות פיפטות זכוכית סטרילית.
3. דגירה הצלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס בחושך עד מושבות יחיד הופיעו.

4. ספירת הניצולים לפי מיקרוסקופיית פלואורסצנטי סטריאו לניתוח כמותי

1. מחלקים את תחתית צלחת האגר בעט שחור בארבעה חלקים לצורך אוריינטציה טובה יותר תוך ספירת הניצולים תחת מיקרוסקופ הפלואורסצנטי של הסטריאו.
2. מניחים את הצלחת במהופך מתחת למיקרוסקופ ומביאים את המושבות לפוקוס באמצעות מקור האור הקר.
3. לאחר שהמושבות נמצאות במוקד, עבור אל ערכת המסנן המתאימה עבור CFP כדי לדמיין את התאים ששרדו של הזן בעל התווית cfp. לספור את הניצולים של זן זה על ידי תיוג המושבות עם עט ולשים לב למספר.
4. הסר את התוויות עם אתנול ולעבור למסנן YFP להגדיר לדמיין את התאים ששרדו של זן yfpשכותרתו. לספור את הניצולים שוב על ידי תיוג המושבות עם עט ולשים לב למספר.

5. טיפול מדגמי ומיקרוסקופיה לניתוחים חצי שוויוניים

1. לנתונים הממחישים, ספוט 10 μl של^10-4 דילול (כ 100 תאים) משלב 3.1 על צלחת אגר SP (ראה איור 3).
2. דגירה הצלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס בחושך עד מושבות יחיד הופיעו.
3. מניחים את צלחת פטרי ללא מכסה מתחת למיקרוסקופ ומביאים את המקום לפוקוס באמצעות מקור האור הקר.
4. צלם תמונות של המקומות להמחשה של דמויות. בחר זמן חשיפה מתאים לצילום התמונות של המושבות עם מקור האור הקר.
5. מבלי להזיז את הלוח, עבור למסנן CFP, התאם את זמן החשיפה וצלם תמונה. בצע את אותו הדבר עם ערכת המסננים של YFP ושמור את התמונות לניתוחים נוספים.

6. ניתוח נתונים

1. השתמש בתוכנות כגון Excel עבור ניתוחי הנתונים הכמותיים. בהתבסס על המושבות שנספרו, לחשב את אחוז המושבות הצהובות והכחולות ביחס למספר שלם של מושבות, אשר מוגדרים 100%.
2. השתמש במספרים המחושבים כדי ליצור דיאגרמת עמודות מוערמות (ראו איור 4 ואיור 5). השתמשו בתוכנית לעיבוד תמונות כמו Adobe Photoshop לבניית תמונות ממוזגות של התמונות שצולמו מהנקודות השונות. לחלופין, התוכנה הזמינה בחופשיות ImageJ, להורדה http://rsbweb.nih.gov/ij/ יכול לשמש לעיבוד תמונה.
3. פתח את התמונות מנקודה אחת שצולמו באמצעות ערכת המסננים CFP והמסנן YFP. מטב את הניגודיות ואת הבהירות כדי להפחית את פלואורסצנטיות הרקע מהמדיה.
4. עבור לאחת התמונות ובחר הכל. העתק את התמונה והדבק אותה בתמונה האחרת.
5. השתמש בפונקציה "השתמטות צבע" כדי למזג את התמונות או לכסות את התמונות הפלואורסצנטיות באמצעות הכרטיסיה ערוצים. תמונות ממוזגות של המושבות מאמצעי תקשורת שונים ונקודות זמן שונות מייצגות את הצמיחה של הזנים השונים בתרבות הנוזלית.

7. טיפים ספציפיים: ניסוי מתג צבע ו Cocultivation של זנים Isogenic שכותרתו עם cfp ו yfp

הביטוי של אחד משני הגנים המקודדים פלואורופור ב B. subtilis עשוי להשפיע על כושר ובכך את קצב הצמיחה של החיידקים. לכן, מומלץ לבצע את הניסויים הבאים על מנת לשלול כי חיסול של זן מתחרה אחד מאוכלוסיית התא במהלך הטיפוח הוא פשוט בשל השפעה שלילית של הפלואורפור:

1. חזור על כל הניסוי ו cocultivate זנים מתויגים הפוך(למשל, הזן הקודם cfpשכותרתו מסומנת כעת עם הגן yfp ולהיפך). למרות ההופכי, התוצאות שהתקבלו צריך להיות דומה התצפית הקודמת כי זן אחד יש יתרון צמיחה סלקטיבית על פני הזן השני.
2. חזור על כל הניסוי ו cocultivate זנים isogenic שכותרתו yfp ו CFP (למשל BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-yfp)ו BP41(rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-cfp)). להעריך את ההשפעה השלילית של אחד משני פלואורופורים על כושר של החיידקים על ידי ביצוע הרכב אוכלוסיית התא לאורך זמן.

תוצאות

השיטה המתוארת כאן הוחלה בהצלחה כדי לדמיין תחרות תוך-מין באוכלוסיית תאים המורכבת מזני B. subtilis שסומנו בגנים cfp ו- yfp המקודדים את הפלואורופורים CFP ו- YFP, בהתאמה. כפי שמוצג באיור 3, ניתן להשתמש בשיטה כדי לדמיין תחרות תוך-מין באופן הממחיש מאוד. על ידי איתור הדגימות על אזורים קטנים, הרכב השיבוט של אוכלוסיית התאים נעשה גלוי במבט חטוף. למרות שאינה מתאימה לניתוחים כמותיים, גישה זו שימושית להערכת ההשפעה של פרמטרי צמיחה שונים(כלומרמקור חנקן) על התפתחות אוכלוסיית תאים שהכי...

דיון

מספר שיטות פותחו כדי לנתח כושר תחרותי של^{חיידקים 16}. במקרים רבים החיידקים תויגו עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה שונות¹⁷. בדומה לגישה שלנו, תיוג התאים עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה מאפשר הערכה של כושר תחרותי של החיידקים במהלך cocultivation בתנאי גדילה מוגדרים. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש כדי לקבוע כושר תחרותי של תאים שונים זה מזה בוקוס מסוים על הכרומוזום¹⁷. עם זאת, ישנם כמה חסרונות באמצעות קלטות עמידות לאנטיביוטיקה כדי לפקח על כושר תחרותי. כמו הביטוי של הגנים ההתנגדות מונעת בעיקר על ידי מקדמי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
(NH4)2SO4	Roth, גרמניה	3746
Agar	Difco, ארה"ב	214010
אמוניום ברזל ציטראט (CAF)	Sigma-Aldrich, גרמניה	9714
CaCl2	Roth, גרמניה	5239
Glucose	Applichem, גרמניה	A3617
גליצרול	רוט, גרמניה	4043
K2HPO4• 3H2O	Roth, Germany	6878
KCl	Applichem, גרמניה	A3582
KH2PO4	Roth, Germany	3904
KOH	Roth, Germany	6751
MgSO4• 7 ש'<תת>2O	Roth, גרמניה	P027
MnCl2	Roth, גרמניה	T881
MnSO4• 4H2O	Merck Millipore, Germany	102786
NaCl	Roth , גרמניה	9265
Nutrient broth	Roth , גרמניה	X929
אשלגן גלוטמט	Applichem , גרמניה	A3712
Tryptone	Roth , גרמניה	8952
Tryptophan	Applichem , גרמניה	A3445
תמצית שמרים	רוט, גרמניה	2363
1.5 מ"ל צינורות תגובה	Sarstedt, גרמניה	72,690,001
2.0 מ"ל צינורות תגובה	Sarstedt, גרמניה	72,691
15 מ"ל צינורות פלסטיק עם מכסה בורג	Sarstedt, גרמניה	62,554,001
צלחות פטרי	Sarstedt, גרמניה	82.1473
1.5 מ"ל קוביות פוליסטירן	Sarstedt, גרמניה	67,742
15 מ"ל שפופרות תרבית זכוכית	מותג, גרמניה	7790 22
100 מ"ל צלוחיות שייק עם פקקי אלומיניום	מותג, גרמניה	928 24
פיפטות זכוכית סטריליות 10 מ"ל	מותג, גרמניה	278 23
אינקובטור (28 ו-37 מעלות; ג)	ניו ברונסוויק	M1282-0012
סט פיפטות סטנדרטי (2-20 μ l, 10-100 μ l, 100-1,000 μ l)	Eppendorf, גרמניה	4910 000.034, 4910 000.042,
צנטריפוגה שולחנית לצינורות תגובה של 1.5 ו -2 מ"ל	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, גרמניה	75002425
צנטריפוגה שולחנית לצינורות פלסטיק 15 מ"ל	Heraeus Biofuge Primo R, גרמניה	75005440
ספקטרופוטומטר סטנדרטי	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, גרמניה	80-2112-21
מיקרוסקופ סטריאופלואורסצנטי	Zeiss SteREO Lumar V12, גרמניה	495008-0009-000
מקפיא (-20 ו-80 מעלות; ג)	-
מקרר (4 מעלות; C)	-	-Autoclave
	Zirbus, LTA 2x3x4,	גרמניה-מד
pH	pH-meter 766, קלימטי, ניק, גרמניה	766
Vortex	Vortex 3, IKA, גרמניה	3340000
איזון	CP2202S, סרטוריוס, גרמניה	הוחלף בעט
שחור (סמן קבוע)	שטדלר, גרמניה	317-9
תוכנית Powerpoint	מיקרוסופט, ארה"	ב-Office
תוכנית אקסל	מיקרוסופט, ארה	"ב-תוכנית	לעיבוד נתונים
Adobe Photoshop CS5	Adobe, ארה"	ב הוחלף ב-CS6, הורד	תוכנת מחשב לעיבוד תמונה
מחשב	PC או תוכנת Mac-ZEN
pro 2011 למיקרוסקופ סטריאופלואורסצנטי	Zeiss, גרמניה	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. הושג באמצעות Zeiss
<מתכוני תמיסה ספציפיים>strong
SP בינוני
8 גרם מרק
0.25 מ"ג MgSO4• 7H2O
1 גרם KCl
15 גרם אגר למדיום			במידת הצורך
הוסף 1 ליטר עם חיטוי H2O			למשך 20 דקות ב-121 מעלות; C
1 מ"ל CaCl2 (0.5 M), מעוקר בסינון
1 מ"ל MnCl2 (10 מ"מ), מעוקר על ידי סינון
2 מ"ל אמוניום ברזל ציטראט (CAF, 2.2 מ"ג/מ"ל), מעוקר על ידי סינון
<חזק>LB בינוני
10 גרם טריפטון
5 גרם תמצית
10 גרם NaCl
15 גרם אגר למדיום			מוצק במידת הצורך
להוסיף 1 ליטר עם חיטוי H2O			למשך 20 דקות ב-121 מעלות; C
C-Glc מינימלי בינוני
200 מ"ל 5 x מלחי
10 מ"ל L-טריפטופן (5 מ"ג/מ"ל), מעוקר בסינון
10 מ"ל אמוניום ברזל ציטראט (CAF, 2.2 מ"ג/מ"ל), מעוקר בסינון
10 מ"ל מלחי
25 מ"ל גלוקוז (20%)			חיטוי למשך 20 דקות ב-121 מעלות; C
להוסיף 1 ליטר עם H2O
CE-Glc מינימלי בינוני
200 מ"ל 5 x מלחי
10 מ"ל L-טריפטופן (5 מ"ג/מ"ל), מעוקר על ידי סינון
10 מ"ל אמוניום ברזל ציטראט (CAF, 2.2 מ"ג/מ"ל), מעוקר על ידי סינון
10 מ"ל III’ מלחים
20 מ"ל גלוטמט (40%)
25 מ"ל גלוקוז (20%), חיטוי למשך 20 דקות ב-121 מעלות; C
הוסף 1 ליטר עם H2O
סטרילי 5 x מלחי C
20 גרם KH2PO4
80 g K2HPO4• 3H2O
16.5 g (NH4)2SO4
הוסף 1 L עם חיטוי H2O			סטרילי למשך 20 דקות ב-121 ° מלחי
			III'
0.232 גרם MnSO4• 4H2O
; 7H2O
הוסף 1 ליטר עם H2O סטרילי, חיטוי למשך 20 דקות ב-121 ו-deg; תמיסת
			40% גלוטמט
200 גרם חומצה
להתאים את ה-pH ל-7.0 על ידי הוספת כ-80 גרם KOH
להוסיף 0.5 ליטר עם חיטוי סטרילי H2O			למשך 20 דקות ב-121 מעלות; C
<חזק>0.9% תמיסת מלח (NaCl)
הוסף 1 ליטר עם חיטוי סטרילי H2O			למשך 20 דקות ב-121 מעלות; תמיסת
			50% גליצרול
295 מ"ל גליצרול (87%)
הוסף 0.5 ליטר עם חיטוי סטרילי H2O			למשך 20 דקות ב-121 מעלות; C
חיידקים (כל הזנים מבוססים על זן Bacillus subtilis 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-yfp)			זני מעבדה
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-yfp)