התקדמות מחזור תא הערכה של גזע עצבי ובתאים במוח המתפתח העכבר, למרות מתח genotoxic

סיכום

מנהל של שני אנלוגים של תימידין, edu וBrdU, בעכברים בהריון מאפשר הניתוח של התקדמות מחזור התא בעצבי ובתאים במוח העכבר העוברי. שיטה זו שימושית כדי לקבוע את ההשפעות של מתח genotoxic, כוללים קרינה מייננת, בהתפתחות המוח.

תקציר

נוירונים בקליפת המוח נוצרים במהלך התפתחות מוח מסוגים שונים של תאי גזע ועצביים (NSPC), המהווים האפיתל המצפה את pseudostratified חדרים לרוחב של המוח העוברי. לחצי genotoxic, כגון קרינה מייננת, יש השפעות מזיקות ביותר על המוח המתפתח הקשורות לרגישות הגבוהה של NSPC. הבהרה של המנגנונים התאיים ומולקולריים המעורבים תלויה באפיון של תגובת הנזק לדנ"א של סוגים מסוימים של תאים אלה, המחייב את השיטה מדויקת כדי לקבוע התקדמות NSPC דרך מחזור התא ברקמה הפגועה. כאן מוצג שיטה המבוססת על זריקות intraperitoneal רצופות של edu וBrdU בעכברים בהריון וגילוי נוסף של שני אנלוגים תימידין אלה בסעיפי העטרה של המוח העוברי. Edu וBrdU שניהם שולבו ב-DNA של תאים משכפלים בשלב S ומזוהים על ידי שתי טכניקות שונות (אזיד אונוגדן ספציפי, בהתאמה), המאפשר זיהוי סימולטני שלהם. Edu ומכתים BrdU לאחר מכן נקבעו לכל גרעין NSPC בפונקציה של המרחק שלה מהשוליים של החדר באזור רמת telencephalon הגבי. לכן טכניקת תיוג כפולה זו מאפשרת להבחין בתאים שהתקדמו דרך מחזור התא מאלו שהפעילו מחסום מחזור תא שמוביל לעצירת מחזור התא בתגובה לנזק לדנ"א.

דוגמא לניסוי שהוצגה, שבי edu הוזרק לפני ההקרנה וBrdU מייד לאחר והניתוחים שבוצע בשעה 4 לאחר הקרנה. פרוטוקול זה מספק ניתוח מדויק של תגובת הנזק לדנ"א החריף של NSPC בתפקודו של השלב של מחזור התא שבו הם נחשפים לקרינה. שיטה זו היא קלות transposable למערכות רבות אחרות על מנת לקבוע את ההשפעה של טיפול מסוים על התקדמות מחזור התא ברקמות חיות.

מבוא

במהלך התפתחות מוח עוברית, תאי עצב השלכה של קליפת המוח נוצרים באזור חדרית, האפיתל pseudostratified המורכב מסוגים שונים של גזע עצבי ובתאים (NSPC) של שהחדרים לרוחב קווים. בין NSPC, תאי גלייה רדיאלי (RGC), המשמשים כתאי גזע עצביים, עוברים הגירה גרעינית interkinetic (INM): הם מבצעים מיטוזה על פני השטח של החדר והשלב-S בגבול הבסיס של אזור חדרית (VZ) ^{1, 2,3.} הם יכולים לחלק בין אם באופן סימטרי ליצירת שני RGC או לא סימטרי כדי ליצור RGC אחד ותא עצב אחד או תא ביניים אב (IPC) ^{4, 5.} IPC להגר לשכבה שמעליה מתרבים הנקראת אזור subventricular (SVZ), שבו לאחר החלוקה סימטרית האחרון הם מייצרים שני נוירונים הקרנה בשלה ^6-8. בניגוד לRGC, IPC אינו עובר INM (בדיקה ב ^9). נוירונים חדשים שנוצרו migrאכלתי רדיאלית לאורך הסיבים רדיאליים דרך אזור ביניים (י. ז) כדי להגיע ליעד הסופי שלהם בצלחת בקליפת המוח (CP) ^{10, 8.} התזמון המושלם של כל האירועים הללו הוא חיוני להתפתחות קליפת המוח נכונה. למשל מעבר מההפצה לבידול של אוכלוסיות עצביות נשלטת על ידי משך שלב G1 ^{11, 12.} ההתארכות של שלב G1 וקושרת וכך עם התמיינות תאים.

מתח genotoxic, כגון קרינה מייננת, התפתחות המוח יפגע קשות (שנסקרה ^ב13). אנחנו ואחרים הראו כי NSPC נוטה מאוד לאפופטוזיס מושרה קרינה ^{14, 15,16.} קרינה מייננת לגרום להפסקות גדיל הדנ"א כפולות שהניזק החמור ביותר לתאים מתרבים. מרכיב חיוני אחד תגובת נזק לדנ"א (DDR) בתאי רכיבה על אופניים הוא ההפעלה של מחסומי מחזור תא ב/ מעברי M-G1 / S או G2 או במהלך Sשלב (מחסום התוך S) ^17-21. הם חוסמים את התקדמות מחזור התא כדי לספק זמן לתיקון נזק לדנ"א או חיסול של תאים פגועים מדי. כתוצאה מכך, מוות של תאים, כמו גם התקדמות מחזור התא מעוכבת עשוי לשנות את התפתחות מוח בתגובה לחשיפה לקרינה מייננת ^22-24. זה היה כך מעניין לפתח שיטה להעריך את הפעלת מחסומי מחזור התא בNSPC במוח העוברי של העכברים המוקרן.

ההתקדמות של מחזור התא באופן שיגרתי ואחרי שימוש בשילוב של אנלוגי תימידין, 5-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdU). BrdU משולב בשלב S של מחזור התא, כאשר ה-DNA הוא שכפול. השימוש בנוגדנים נגד BrdU מאפשר לאחר מכן זיהוי של תאים שהיו בשלב S במהלך הדופק של BrdU.

אנלוגי תימידין רומן, 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (edu) הוא זוהה על ידי אזיד ניאון. הדרכים השונות כדי לזהות edu ו-B RDU לא חוצה להגיב ^25, המאפשר זיהוי בו זמני של שני אנלוגים תימידין, וזה שימושי לחקר התקדמות מחזור התא. בדרך כלל תאים פעמו ראשונה עם edu ולאחר מכן פעמו עם BrdU, שבו הזמן בין שתי ההתאגדות נמשך כמה שעות ^{25, 26.} תוספת של BrdU בתקשורת והתרבות המכילה edu תוצאות במעדיפות שילוב של BrdU לתוך DNA עם ההרחקה של EDU, בעוד בנוסף בו זמנית של edu ²⁵ עם BrdU equimolar או חצי equimolar לתוצאות התקשורת בשילוב BrdU רק ^27. זה מפשט את פרוטוקול התיוג הכפול על ידי ביטול הצעדים לשטוף, כי הם בדרך כלל נדרשו להסיר את התווית הראשונה מהתקשורת והתרבות לפני תוספת של התווית השנייה. זה גם הוא של עניין מיוחד עבור in vivo מחקר, שבו צעדי הכביסה אינם אפשריים, כדי לקבוע את העיתוי המדויק של כניסת שלב S או יציאה של אוכלוסיית תאים.

t "> לאחרונה, שיטה של תיוג כפול דופק במוח עכבר העוברי באמצעות edu ^{ו23 BrdU, 24,22} פותחה כדי לנתח את התקדמות מחזור התא וINM של NSPC לאחר הקרנה ברחם. יתר על כן זה כבר הוכיח כי, במהלך שלב S, תאי עכבר לשכפל ראשון אזורי euchromatin ולאחר מכן heterochromatin pericentric ^28,29,30. מעניין, heterochromatin pericentric של כרומוזומים שונים התקבצו בגרעיני interphasic כדי ליצור מוקדי heterochromatic הידוע גם בchromocenters ובקלות לזיהוי על ידי מכתים DAPI כמוקדים בהירים. לכן, stainings edu וBrdU ההפרש של euchromatin וchromocenters עזר לנו לנתח באופן מדויק יותר את התקדמות שלב S של NSPC.

שיטה זו אפשרה להפגנה של חוסר לכאורה של מחסום G1 / S בNSCP ^22-24, וזה די מפתיע שכן מחסום זה אמור להיות קריטי ליציבות הגנום. כמה expעיצובי erimental מבוססים על שילובים שונים של קטניות edu וBrdU שימשו כדי לנתח את התקדמות מחזור התא בtelencephalon הגחון ועל הגב. הנה, אנחנו נותנים דוגמא של פרוטוקולים המאפשרים המחקר של הנזקים אקוטי DNA של NSPC בתוך 4 שעות הראשונות שלאחר הקרנה ברחם של עוברי עכברי E14.5.

פרוטוקול

1. נהלי בעלי החיים

פרוטוקול זה תוכנן בהתאם להוראת מועצת הקהילות האירופית של 24 נובמבר 1986 (86/609/EEC) ואושר על ידי ועדה המוסדית שלנו על רווחת בעלי חיים (CETEA-CEA DSV צה"ל).

1. זריקות עם edu / BrdU והקרנה של עכברות הרות E14.5 (איור 2 א).
   1. הכן פתרון של edu ב1 מ"ג / מיליליטר וBrdU ב5 מ"ג / מיליליטר PBS. לבצע הזרקה תוך הצפק (IP) של פתרון edu 100 μl באמצעות מחט 25 G לעכברים בהריון. 1.5 שעות מאוחר יותר, להקרין את העכברים (הכוללת הקרנת גוף) בשעה 0 Gy או 2 Gy (0.6 Gy / min). מייד לאחר מכן, להזריק (IP) 200 μl של פתרון BrdU באמצעות מחט 25 G לעכברים בהריון.
2. הכנת פרוסות העטרה של מוח העוברי.
   1. בשעה 1 או 4 שעות לאחר הקרנה, להרדים את העכברים בהריון על ידי פחמן דו חמצני.
   2. פתח את קאווי הבטןty בשלושה סנטימטרים בעזרת מספריים. להפריד בין שתי קרנות רחם משאר הרחם על ידי חתך שני הגפיים של הקרניים. העבר את קרן הרחם לתוך צלחת פטרי המכילה גלוקוז 0.6% PBS. פתח את קרנות רחם עם המלקחיים כדי לבודד את העוברים. הסר את השק השפיר של כל עובר באמצעות מלקחיים.
   3. לנתח ראשים עובריים עם מלקחיים ולתקן אותם על ידי טבילה בparaformaldehyde 4% (PFA, pH = 7.4) O / N ב 4 ° C.
   4. יש לשטוף את הראש עוברי ב-PBS ללילה אחד לפחות ב 4 ° C. יכולים להיות כל הזמן בראשים PBS במשך כמה ימים.
   5. ראשים להטביע בפרפין באמצעות מעבד חדירת ואקום כפי שמצוין בטבלה 1. יכולים גם להתבצע ראשי ההטבעה מתחת למכסת מנוע כימית לאתנול ואמבטיות xylen, ולאחר מכן בתנור 65 מעלות צלזיוס למשך אמבטיות פרפין.
   6. הכן את סעיפי העטרה עבים 5-מיקרומטר עם microtome.
   7. הר על גבי שקופיות מיקרוסקופ מצופה polylysine.
   8. יכולות להישמר שקופיות בטמפרטורת חדר (RT) במשך מספר חודשים.

2. Edu / BrdU מכתים

1. הסרת מסכות Deparaffinization ואנטיגן
   1. Deparaffinize החלקים במוח פרפין, מוטבע על ידי טבילה של שקופיות ב3 אמבטיות של טולואן למשך 5 דקות.
   2. רעננותם במשך 3 דקות ב2 אמבטיות של כל פתרונות של הפחתת ריכוז אתנול כבא: 100% אתנול, 95% אתנול, 70% אתנול, ו 5 דקות בH ₂ O. יכולות להיות כל הזמן במגלשות מים deionized במשך כמה שעות.
   3. מרתיחים את הפרוסות ל10 דקות בתמיסת ציטרט (10 מ"מ, pH 6), ולאחר מכן לדגור במי deionized במשך 5 דקות.
2. מכתים edu
   1. לבצע זיהוי edu על פי הפרוטוקול של היצרן. Permeabilize תאים עם 0.5% X-100 טריטון ב PBS עבור 10min.
   2. הכן את תוסף חיץ 1X edu על ידי דילול פתרון 10X במי deionized. פתרון זה צריך להיעשות טרי והשתמש באותו day.
   3. הכן קוקטייל תגובת edu, כוללים אזיד edu אלקסה פלואוריד 488. חשוב להוסיף את המרכיבים הבאים לפי הסדר הרשום בטבלה 2, אחרת, התגובה לא תמשיך בצורה אופטימלית. השתמש בקוקטייל תגובת edu בתוך 15 דקות של הכנה.
   4. הסר את חיץ permeabilization (צעד 2.1.1), ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם PBS.
   5. הוסף 150 μl של קוקטייל תגובת edu, לשים coverslip, ודגירת 30 דקות בחושך ב RT.
   6. הסר את קוקטייל תגובת edu, ולאחר מכן לשטוף פעם עם PBS.
3. מכתים BrdU
   1. הכן את חיץ הרוויה עם 7.5% נסיוב עזים ו7.5% בסרום שור עוברי ב-PBS. הוסף 150 μl של חיץ הרוויה על פרוסות מוח, לשים את coverslip, ודגירה עבור שעה 1 ב RT לחסום נוגדן שאינו ספציפי מחייב.
   2. הסר את coverslip. הוסף 150 μl של נוגדן ראשוני עכבר אנטי BrdU המדולל ב1/300 במאגר רוויה, לשים coverslip ודגירת O /N ב 4 ° C.
   3. הסר את coverslip, ולאחר מכן לשטוף 3 פעמים ב-PBS.
   4. הוסף 150 μl של נוגדנים משני אנטי עכבר Alexa594 העז מדוללים ב1/400 במאגר רוויה, לשים coverslip, ודגירה עבור שעה 1 ב RT.
   5. הסר את coverslip, ולאחר מכן לשטוף פעם אחת ב-PBS.
   6. מכתים גרעיני: להוסיף 150 μl של 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) בשעה 1 מיקרוגרם / מיליליטר PBS, לשים coverslip ו דגירה למשך 2 דקות ב RT.
   7. הר שקופיות בהרכבה בינונית.

3. ניתוח

1. בחן את החלקים במוח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מטרת 20X או מיקרוסקופ confocal ולרכוש תמונות בשלושה ערוצים (488 ננומטר, 594 ננומטר ו-UV) כמפריד בין קבצים.
2. מחסנית תמונות עם תוכנת Photoshop.
3. נתח את החלקים במוח במגזר סטנדרטי של קיר מוחין dorsomedial. מגזר זה הוא 100 מיקרומטר בממד המדיאלי לרוחב והוא מחולק ל18 פחים (או יותר) של 10 μמ 'גובה בממד הרדיאלי שלה באמצעות רשת superposed על תמונות (איור 1) כפי שתואר לעיל ^{ביום 31.}
   1. יישר את הרשת כגון הסל הראשון הוא על פני החדר, עם מקביל לציר הארוך שלה לגבול של החדר. לאחר מכן למספר את edu שכותרתו, BrdU ו / או גרעיני pyknotic (המקביל ל גרעינים אפופטוטיים) בכל סל. מספר גרעין ממוקם על הגבול של שני פחים לפח המכיל חלק שלה גדול יותר, או בסל נמוך יותר, כאשר הגרעין תופס שטחים שווים תוך הפחים.
4. ניתוח סטטיסטי.

לנתח לפחות שתי פרוסות בקליפת המוח לעובר. חזור על ניסויים בלפחות 3 עוברים מהמלטות שונות. יש לתת תוצאות כשגיאה ממוצעת ± התקן של הממוצע (SEM). ניתוחים סטטיסטיים שנערכו עם GraphPad פריזמה באמצעות ANOVA דו כיוונית ובדיקות posthoc השוואה מרובות Bonferroni.

תוצאות

בניסוי המתואר באיור 2, edu היה מנוהל 1.5 שעות לפני ההקרנה וBrdU רק לאחר הקרנה. ארבעה סוגים של תאים ולאחר מכן היו להבחין בפרוסות בקליפת המוח שהוכנו ב1 או 4 שעות שלאחר הקרנה, על פי השילוב של שני edu או BrdU, אף שניהם או (2 א ודמויות 2B). חשוב לציין, לא edu ולא שילוב BrdU שינה את הרמה של אפופטוזיס מושרה קרינה (מידע לא מוצג). יתר על כן, שיטות הצביעה מאפשרות רק את הגילוי של EDU וBrdU שולב במהלך שכפול הדנ"א בשלב-S אבל אין לי הרגישות לזיהוי סינתזה של DNA...

דיון

תכנון הניסוי המתואר כאן מבוסס על שילוב של שעה edu 1.5 לפני הקרנה ושילוב של BrdU מייד לאחר ההקרנה אפשרה להפגנה שNSPCs מסוגל להפעיל S ומחסומי G2 / M אבל לא את מחסום G1 / S בשעת 1 ^st אחרי מתח genotoxic במוח העכבר העוברי. אנחנו ביצענו ניסויים אחרים בהם edu כבר הזריק בזמנים שונים לאחר ההקרנה וBrdU, רק 1 שעות לפני קורבנות עכברים, ומאפשרים לנו להעריך את שיעור כניסת שלב S במיוחד. ניסויים אלה הראו כי NSPC לא יפעיל מעצר G1 / S אחרי מתח genotoxic in vivo ^22,23....

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
EdU	Life Technologies	A10044	1 מ"ג/מ"ל
BrdU	Life Technologies	B5002	5 מ"ג/מ"ל
IBL 637	CIS BIO International
Tissu Tek VIP	Leica
Microtome	Leica	RM 2125 RT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	93443
Click-iT EdU Alexa 488 ערכת הדמיה	Life Technologies	C10083
Anti-BrdU	GE Healthcare	RPN202	1/300
עז נגד עכבר-Alex594	Life Technologies	A11001	1/400
Fluoromount	SouthernBiotech	0100-01
שקופיות פוליסינוס	תרמו מדעי	J2800AMNZ
Paraformaldehyde	סיגמא-אולדריץ'	P6148
PBS	טכנולוגיות חיים	20012-068
DAPI	סיגמא-אולדריץ'	D9542
מיקרוסקופ BX51	מיקרוסקופ קונפוקלי אולימפוס
SPE	Leica
פריזמה תוכנה	Graphpad		גרסה 5.0c
תוכנת פוטושופ	Adobe