Method Article

אפיון של מערכות מורכבות באמצעות העיצוב של גישת ניסויים: ביטוי חלבון חלוף בטבק כמקרה מבחן

DOI:

10.3791/51216

⸱

January 31st, 2014

 , 
1Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 2Institute for Molecular Biology and Applied Ecology, Fraunhofer Gesellschaft

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים עיצוב של גישת ניסויים שיכולים לשמש כדי לקבוע ולעצב את ההשפעה של אלמנטי transgene רגולציה, פרמטרים גדילה והתפתחות צמח, ותנאי דגירה על הביטוי החולף של נוגדנים חד שבטיים וחלבונים כתב בצמחים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צמחים מספקים יתרונות רבים לייצור תרופות ביולוגיים כוללים עלויות נמוכות, יכולת הרחבה, ובטיחות. ביטוי חולף מציע יתרון נוסף של פיתוח קצר וזמני ייצור, אבל רמות הביטוי יכולות להשתנות באופן משמעותי בין קבוצות ובכך הולידו חששות רגולטורים בהקשר של ייצור נאות. אנחנו השתמשנו בעיצוב של גישת ניסויים (DOE), כדי לקבוע את ההשפעה של גורמים מרכזיים כגון אלמנטים רגולטוריים במבנה הביטוי, גידול צמחים ופרמטרי פיתוח, ותנאי הדגירה בהבעה, בשונות של ביטוי בין קבוצות. בדקנו צמחים המבטאים נוגדן מודל אנטי HIV חד שבטי (2G12) וחלבון פלואורסצנטי סמן (DsRed). אנו דנים את הרציונל לבחירת מאפיינים מסוימים של המודל ולזהות מגבלות הפוטנציאל שלה. הגישה הכללית בקלות ניתן להעביר לבעיות אחרות, כי את עקרונות המודלמחדש החלים רחב: בחירת פרמטר המבוסס על ידע, הפחתת מורכבות על ידי פיצול הבעיה הראשונית לתוך מודולים קטנים יותר, מונחה תוכנת התקנה של שילובי ניסוי אופטימליים והגדלת עיצוב צעד חכמה. לכן, המתודולוגיה היא לא רק שימושית לאפיון ביטוי חלבון בצמחים, אלא גם לחקירה של מערכות מורכבות אחרות חסרות תיאור מכניסטי. משוואות החיזוי המתארות את הקישוריות בין פרמטרים ניתן להשתמש כדי להקים מודלים מכניסטית למערכות מורכבות אחרות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הייצור של חלבונים ביולוגיות בצמחים יש יתרון משום שצמחים הם זולים לגדול, הפלטפורמה וניתן לשנותם רק על ידי גידול צמחים יותר, ופתוגנים אנושיים אינם מסוגלים לשכפל 1,2. אסטרטגיות ביטוי חולפות מבוססות למשל על החדירה של עלים עם Agrobacterium tumefaciens מספקת יתרונות נוספים בגלל הזמן בין נקודת מסירת DNA והמשלוח של מוצר מטוהר מצטמצם משנה לפחות מ 2 חודשים 3. ביטוי חולף משמש גם לניתוח פונקציונלי, למשל כדי לבדוק גנים ביכולתם להשלים את מוטציות אובדן של פונקציה או לחקור אינטראקציות חלבון 4-6. עם זאת, רמות ביטוי חולפות נוטות להראות גדולה יותר וריאציה אצווה כדי אצווה מ רמות ביטוי בצמחים מהונד....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תכנון אסטרטגיה מחלקת אנרגיה

  1. זהה את הגורמים רלוונטיים ואת התגובות להכללה בעיצוב.
    1. הגדר תגובות אחד או כמה למדידה. הנה, רמות ביטוי 2G12 וDsRed שימשו (מיקרוגרם / מיליליטר), ובכלל זה את ההבדל המינימאלי לזיהוי נחשב (מיליליטר 10 ו20 מיקרוגרם /, בהתאמה) רלוונטי וערך משוער לסטיית התקן המשוערת של המערכת (4 ו -8 מיקרוגרם / מיליליטר, בהתאמה) המבוסס על ניסויים קודמים.
    2. השתמש בספרות זמינה, נתונים מניסויים קודמים או....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודל תיאורים עבור הצטברות DsRed בביטוי חולף באמצעות יזמים ו5'UTRs שונים

הקרינה DsRed בתמציות עלים שימשה כדי להצביע על רמת הביטוי של חלבון רקומביננטי וכך שימש כתגובה באסטרטגית DOE. הבדל גילוי המינימום שאנחנו נחשבים רלוונטיים היה 20 מיקרוגרם / מיליליטר וסטיית התקן המשוער של המערכת הייתה 8 מיקרוגרם / מיליליטר המבוסס על ניסויים ראשוניים. גורמים הנכללים במודל הביטוי החולף נבחרו על בסיס 7,8 .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ניסוי דורש תכנון זהיר, כי משאבים הם לרוב נדירים ויקרים. זה נכון במיוחד לאסטרטגיות מחלקת אנרגיה בגלל שגיאות במהלך שלב תכנון (לדוגמא: בחירת דגם בסיס שאינו מכסה את כל אינטראקציות הגורם משמעותיות) באופן משמעותי יכולות לצמצם את כוח הניבוי של מודלים וכתוצאה מכך ובכך פיחות הניסוי כולו. עם זאת, יכולות בקלות להימנע טעויות אלה על ידי ביצוע נהלים בסיסיים.

שיקולים בתכנון מחלקת האנרגיה

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אגרת הפרסום מומנה באופן חלקי על ידי חברות Statease, Inc (ארה"ב) וStatcon (גרמניה), שלא היו מעורבות במעורב בהכנת כתב היד או אחראית לכל התוכן שלו.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לד"ר תומס Rademacher למתן וקטור ppam צמח הביטוי ואבראהים אל עמדי לטיפוח צמחי טבק המשמשים במחקר זה. ברצוננו להודות לד"ר ריצ'רד מ Twyman לסיועו בעריכת כתב היד. עבודה זו בחלקו מומנה על ידי המועצה האירופית למחקר מתקדם גרנט "העתיד-פארמה", מספר הצעת 269,110 וFraunhofer Zukunftsstiftung (Fraunhofer עתיד הקרן).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מומחה עיצוב(R) 8Stat-Ease, Inc.n.a.DoEתוכנה
טריפטוןCarl Roth GmbH8952.2רכיב מדיה
תמצית שמריםCarl Roth GmbH2363.2רכיב מדיה
נתרן כלוריCarl Roth GmbHP029.2רכיב מדיה
AmpicillinCarl Roth GmbHK029.2אנטיביוטיקה
Agar-AgarCarl Roth GmbH5210.2רכיב מדיה
Escherichia coli K12 DH5aLife Technologies18263-012מיקרואורגניזם
pPAMGenBankAY027531וקטור שיבוט/ביטוי;  
פלסמיד נוקלאוספין MACHEREY-NAGEL GmbH740588.250ערכת בידוד DNA פלסמיד
NucleoSpin Gel וניקוי PCRMACHEREY-NAGEL GmbH740609.250ערכת טיהור DNA פלסמיד
NanoDrop 2000Thermo Scientificn.a.Spectrophotometer
NcoINew England Biolabs Inc.R3193Lהגבלהאנדונוקלאז
EcoRIניו אינגלנד Biolabs Inc.R3101Lהגבלהאנדונוקלאז
AscIניו אינגלנד ביולאבס בע"מR0558Lהגבלהאנדונוקלאז
NEB 4ניו אינגלנד ביולאבס בע"מB7004SRestrictionendonuclease buffer
TRISCarl Roth GmbH4855.3רכיב מדיה
דיסודיום טטרבוראטCarl Roth GmbH4403.3רכיב מדיה
EDTACarl Roth GmbH8040.2רכיב מדיה
AgaroseCarl Roth GmbH6352.4רכיב מדיה
ברומופנול כחולCarl Roth GmbHA512.1מחוון צבע
קסילן ציאנולCarl Roth GmbHA513.1מחוון צבע
גליצרולCarl Roth GmbH7530.2רכיב מדיה
תא Mini-Sub GT CellBioRad170-4406תא אלקטרופורזה ג'ל
Agrobacterium tumefaciens זן GV3101:pMP90RKDSMZ12365מיקרואורגניזם
Electroporator 2510Eppendorf4307000.658
תמצית בקרElectroporator Carl Roth GmbHX975.2רכיב מדיה
PeptoneCarl Roth GmbH2365.2רכיב מדיה
סוכרוזCarl Roth GmbH4621.2רכיב מדיה
מגנזיום גופרתיCarl Roth GmbH0261.3רכיב מדיה
קרבניציליןקארל רוט GmbH6344.2אנטיביוטיקה
קנמיציןקארל רוט GmbHT832.3אנטיביוטיקה
RifampicinCarl Roth GmbH4163.2אנטיביוטיקה
FWD פריימרEurofins MWG Operonn.a.CCTCAG GAA GAG CAA TAC
REV פריימרEurofins MWG Operonn.a.CCAAAG CGA GTA CAC AAC
2720 Thermalcycler Applied Biosystems4359659Thermocycler
RNAfoldwebserver אוניברסיטת וינהn.a.Software
Ferty 2 MegaKammlott5.220072דשן
גרודן קוביות צמר סלעים 10 x10 ס"מGrodann.a.Rockwoolblock
חממה
צמחיםPhytotronIlka Zelln.a.לגידולצמחים
Omnifix-F SoloB. Braun6064204
מזרק Murashige ומלחי SkoogDuchefaM 0222.0010רכיב מדיה
גלוקוזCarl Roth GmbH6780.2רכיב מדיה
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406-5GPhytohormon analogon
  ביופוטומטר פלוסאפנדורף6132 000.008פוטומטר
אוסראם לבן מגניב 36 Wאוסראם4930440מקור אור
דיסודיום פוספטקארל רוט GmbH4984.3רכיב מדיה
צנטריפוגה 5415Dאפנדורף5424 000.410צנטריפוגה
פורמה -86C מקפיא ULT ThermoFisher88400מקפיא
Synergy HTBioTekSIAFRTקורא צלחות פלואורסצנטיות
Biacore T200GE Healthcaren.a.SPRמכשיר
חלבוןLife Technologies10-1006חלבון קושר נוגדנים
HEPESCarl Roth GmbH9105.3רכיב מדיה
Tween-20Carl Roth GmbH9127.3רכיב מדיה
2G12 נוגדןPolymunAB002נוגדן ייחוס
n.a.n.a.לגידול A

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fischer, R., Emans, N. Molecular farming of pharmaceutical proteins. Transgenic research. 9, 277-299 (2000).
  2. Commandeur, U., Twyman, R. M., Fischer, R. The biosafety of molecular farming in plants. AgBiotechNet. 5, 9 (2003).
  3. Shoji, Y., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Design Of ExperimentsTransient Protein ExpressionTobacco PlantsProtein AccumulationLeaf AgeIncubation ConditionsFluorescence MeasurementResponse SurfaceNumerical OptimizationPredictive Modeling

Related Articles