מאמר שיטה

אפיון של מערכות מורכבות באמצעות העיצוב של גישת ניסויים: ביטוי חלבון חלוף בטבק כמקרה מבחן

16.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51216

⸱

31 בינואר 2014

 , 
1Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 2Institute for Molecular Biology and Applied Ecology, Fraunhofer Gesellschaft

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים עיצוב של גישת ניסויים שיכולים לשמש כדי לקבוע ולעצב את ההשפעה של אלמנטי transgene רגולציה, פרמטרים גדילה והתפתחות צמח, ותנאי דגירה על הביטוי החולף של נוגדנים חד שבטיים וחלבונים כתב בצמחים.

תקציר

צמחים מספקים יתרונות רבים לייצור תרופות ביולוגיים כוללים עלויות נמוכות, יכולת הרחבה, ובטיחות. ביטוי חולף מציע יתרון נוסף של פיתוח קצר וזמני ייצור, אבל רמות הביטוי יכולות להשתנות באופן משמעותי בין קבוצות ובכך הולידו חששות רגולטורים בהקשר של ייצור נאות. אנחנו השתמשנו בעיצוב של גישת ניסויים (DOE), כדי לקבוע את ההשפעה של גורמים מרכזיים כגון אלמנטים רגולטוריים במבנה הביטוי, גידול צמחים ופרמטרי פיתוח, ותנאי הדגירה בהבעה, בשונות של ביטוי בין קבוצות. בדקנו צמחים המבטאים נוגדן מודל אנטי HIV חד שבטי (2G12) וחלבון פלואורסצנטי סמן (DsRed). אנו דנים את הרציונל לבחירת מאפיינים מסוימים של המודל ולזהות מגבלות הפוטנציאל שלה. הגישה הכללית בקלות ניתן להעביר לבעיות אחרות, כי את עקרונות המודלמחדש החלים רחב: בחירת פרמטר המבוסס על ידע, הפחתת מורכבות על ידי פיצול הבעיה הראשונית לתוך מודולים קטנים יותר, מונחה תוכנת התקנה של שילובי ניסוי אופטימליים והגדלת עיצוב צעד חכמה. לכן, המתודולוגיה היא לא רק שימושית לאפיון ביטוי חלבון בצמחים, אלא גם לחקירה של מערכות מורכבות אחרות חסרות תיאור מכניסטי. משוואות החיזוי המתארות את הקישוריות בין פרמטרים ניתן להשתמש כדי להקים מודלים מכניסטית למערכות מורכבות אחרות.

מבוא

הייצור של חלבונים ביולוגיות בצמחים יש יתרון משום שצמחים הם זולים לגדול, הפלטפורמה וניתן לשנותם רק על ידי גידול צמחים יותר, ופתוגנים אנושיים אינם מסוגלים לשכפל 1,2. אסטרטגיות ביטוי חולפות מבוססות למשל על החדירה של עלים עם Agrobacterium tumefaciens מספקת יתרונות נוספים בגלל הזמן בין נקודת מסירת DNA והמשלוח של מוצר מטוהר מצטמצם משנה לפחות מ 2 חודשים 3. ביטוי חולף משמש גם לניתוח פונקציונלי, למשל כדי לבדוק גנים ביכולתם להשלים את מוטציות אובדן של פונקציה או לחקור אינטראקציות חלבון 4-6. עם זאת, רמות ביטוי חולפות נוטות להראות גדולה יותר וריאציה אצווה כדי אצווה מ רמות ביטוי בצמחים מהונדסים 7-9. הדבר זה מפחית את הסבירות לכך שתהליכי ייצור ביולוגיות המבוססים על wi ביטוי החולףתהיה מאושר בהקשר של תרגול טוב ייצור (GMP), כי שחזור הוא תכונת איכות קריטית והוא כפוף להערכת סיכונים 10. וריאציה כזו יכולה גם להסוות את כל אינטראקציות שחוקרים מתכוונים לחקור. לכן, יצאנו לזהות את הגורמים העיקריים המשפיעים על רמות ביטוי חולפות בצמחים ולבנות מודל חיזוי כמותית באיכות גבוהה.

הגישה אחת גורם ב-פעמי (OFAT) משמשת לעתים קרובות כדי לאפיין את ההשפעה (אפקט) של פרמטרים מסוימים (גורמים) על התוצאה (בתגובה) של ניסוי 11. אבל זה לא טובים, כי הבדיקות בודדות (פועל) במהלך חקירה (ניסוי) תהיה מיושרת כמו פנינים במחרוזת דרך אזור הפוטנציאל מורחב על ידי הגורמים שנבדקו (מרחב תכנון). הכיסוי של עיצוב החלל, ולכן המידה של מידע ההופק מהניסוי הואדל, כפי שמוצג באיור 1 א 12. יתר על כן, תלות הדדית בין גורמים שונים (אינטראקציות גורם) יכולה להישאר נסתרת וכתוצאה מכך מודלים עניים ו / או החיזוי של אופטימה הכוזבת, כפי שמוצג באיור 1 ב 13.

ניתן להימנע מהחסרונות שתוארו לעיל באמצעות עיצוב של ניסויי גישה (DOE), שבריצות של ניסוי מפוזרות בצורה שווה יותר לאורך כל מרחב תכנון, כלומר יותר מגורם אחד הוא נע בין שתי ריצות 14. ישנם עיצובים מיוחדים לתערובות, הקרנת גורמים (עיצובי עצרת) ולכמת את השפעות גורם בתגובות (שיטות משטח תגובה, RSM ים) 15. יתר על כן, יכול להתממש RSMs עיצובים מרכזיים-מרוכבים אבל גם יכול להיות מושגת בצורה יעילה על ידי שימוש בתוכנות מיוחדות שניתן להחיל קריטריונים שונים לבחירה של ריצות. לדוגמא, מה שנקרא D-optimalitקריטריון y יבחר ריצות כך כדי למזער את השגיאה במקדמים של המודל וכתוצאה מכך, בעוד שקריטריון IV-האופטימלי בוחר ריצות כי להשיג את שונות התחזית הנמוכה ביותר בחלל העיצוב 15,16. RSM אנו מתארים כאן מאפשר לכמת המדויקים של ביטוי חלבון החולף בצמחים, אבל זה יכול בקלות להיות מועבר לכל מערכת מעורבת מספר (~ 5-8) גורמים מספריים (למשל טמפרטורה, זמן, ריכוז) וכמה (~ 2 - 4) גורמים משמעיים (למשל אמרגן, צבע) שבו תיאור מכניסטית אינו זמין או מורכב מדי לדגמן.

גישת מחלקת האנרגיה שמקורה במדעי החקלאות, אך התפשטה לאזורים אחרים בגלל זה הוא להעברה לכל מצב שבו כדאי להקטין את מספר ריצות צורך לקבל נתונים אמינים וליצור מודלים תיאורים עבור תהליכים מורכבים. זה בתורו הוביל להכללתה של מחלקת אנרגיה ב" ההדרכה לתעשייה, Q8 (R2) תרופות פיתוח ", שפורסם על ידי הרמוני הבינלאומי של דרישות טכניות עבור רישום של תרופות לשימוש בבני אדם (ICH) 17. DOE הוא כיום בשימוש נרחב במחקר ותעשייה 18 מדעיים. עם זאת, יש להקפיד במהלך התכנון והביצוע של הניסוי, כי בחירת תואר פולינום לא תקין למודל מרובה ליניארי רגרסיה (דגם בסיס) יכולים להציג את צורך בריצות נוספות למודל את כל השפעות הגורם בצורה נכונה. יתר על כן, פגום או חסר נתונים ליצור מודלים ופגומים שגויים תחזיות, ואף עלול למנוע כל ניסיון בניית מודל כפי שמתואר בסעיפי הפרוטוקול ודיון 18. בקטע הפרוטוקול, יהיה להגדיר תחילה אנו את צעדי תכנון החשובים ביותר לניסוי מבוסס RSM ולאחר מכן להסביר את העיצוב מבוסס על האיילה v8.1 תוכנת DesignExpert. אבל עיצובים דומים יכול להיות בנוי עם includi תוכנה אחרng JMP, Modde, וSTATISTICA. הליכי הניסוי ואחריו הוראות לניתוח נתונים והערכה.

figure-introduction-1
איור 1. השוואה של OFAT והאיילה.. וריאציה רציפה של גורם אחד בכל פעם (OFAT) בניסוי (עיגולים שחורים, אדום וכחול) משיגה כיסוי נמוך של מרחב תכנון (אזורים בקעו). לעומת זאת, הווריאציה של יותר מגורם אחד בכל פעם באמצעות העיצוב של ניסויי אסטרטגיה (DOE) (עיגולים ירוקים) משפרת את הכיסוי ובכך הדיוק של המודלים וכתוצאה מכך. ב '. כיסוי מרחב תכנון המוטה אומר שניסויי OFAT (עיגולים שחורים) גם יכולים שלא לזהות את האזורים אופטימליים הפעלה (אדום) ולחזות פתרונות לא אופטימליים (עיגול שחור גדול), ואילו strategi מחלקת האנרגיהes (כוכבים שחורים) יש סיכוי גבוה יותר לזהות תנאים עדיפים (כוכב שחור גדול).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תכנון אסטרטגיה מחלקת אנרגיה

  1. זהה את הגורמים רלוונטיים ואת התגובות להכללה בעיצוב.
    1. הגדר תגובות אחד או כמה למדידה. הנה, רמות ביטוי 2G12 וDsRed שימשו (מיקרוגרם / מיליליטר), ובכלל זה את ההבדל המינימאלי לזיהוי נחשב (מיליליטר 10 ו20 מיקרוגרם /, בהתאמה) רלוונטי וערך משוער לסטיית התקן המשוערת של המערכת (4 ו -8 מיקרוגרם / מיליליטר, בהתאמה) המבוסס על ניסויים קודמים.
    2. השתמש בספרות זמינה, נתונים מניסויים קודמים או עיצובי הקרנה מיוחדים (לדוגמא: עיצוב עצרת, ראו מבוא) כדי לבחור גורמים משמעותיים שהשפעתם על התשובות יהיה לכמת (טבלה 1) 7,8,19,20.
    3. להקצות סוגי הגורם (מספריים או משמעיים) ולבחור טווחים שבתוכה הגורמים המספריים יהיו מגוונים במהלך חקירת מחלקת האנרגיה (טבלת 1).
    4. זהה numeriג גורמים שלוריאציה רציפה היא קשה ליישום.
      1. הימנע משימוש בוריאציה רציפה לגורמים שלא יכול להיות מותאמת בדיוק לרמה מסוימת. למשל טמפרטורת דגירה בדרך כלל ניתן לשלוט רק בתוך ± 2 מעלות צלזיוס, ולכן וריאציה רציפה תוך שימוש בערכים כגון 27.2 ° C, 25.9 מעלות צלזיוס, וחובת 29.3 ° C להימנע.
      2. במקום זאת, בחר מספר הרמות בדידות לגורמים אלה (טבלת 1). מספר הרמות צריך להתאים את מודל הבסיס הצפוי (שלב 1.2). זה חשוב רק לעיצובים אופטימליים, משום שתמיד יש עיצובי מרוכבים מרכזיים רמות גורם בדידות.
    5. הקצאה אם גורם משמעי הוא נומינלי, כלומר ללא סדר מכללא (למשל יצרנים שונים), או סודר ולכן פרמטר בדיד מספרי (למשל עלים שונים בצמח).
    6. בחר את הרמות עבור שני הסוגים של גורמים משמעיים.
  2. בחר בסיס מודל שימושי.
    1. המבוסס על הניסויים וספרות הראשוניים, לצפות את הקשר בין כל גורם והתגובה, כמו גם אינטראקציות גורם והתגובה. לדוגמא, ליניארי (יותר טוב), (גידול / קיטון חד אופטימלי או לא קוי) ריבועית או מעוקב (מוטה אופטימלי).
    2. ודא כי מספר הרמות עבור גורמים מספריים בדידים הוא n 1 +, עם n להיות תואר פולינום של הקשר בין הגורם ותגובה. לדוגמא, אם הטמפרטורה צפויה להיות השפעה ריבועית בתגובה, n = 2, ולכן יש לחקור לפחות שלוש רמות טמפרטורה על מנת להשיג את האפקט ריבועית לנכון.
  3. הגדר את החלק היחסי של מרחב תכנון (FDS) שעבורו את שונות החיזוי צריכה להיות מתחת לסף מסוים (ברמת אלפא). FDS צריך להיות> 0.95 (לכסות יותר מ 95% משטח העיצוב) כדי להשיג דגמים שמניבים תחזיות חזקות לאורך כלכל 21-23 עיצוב החלל.
    הערה: סף 0.05 מתאים לרמה של 5% משמעות (סוג אני שגיאה), והוא ערך טיפוסי. הגדלת ערך זה יהיה לצמצם את מספר הניסויים הדרושים לאסטרטגיה מחלקת אנרגיה אך בו זמנית להגדיל את הסיכוי שהשפעות משמעותיות תחסר וכי הערכות של ההשפעה שלהם על התגובה תהיה שגויות.

figure-protocol-1
טבלת 1. גורמים המשפיעים על ביטוי חלבון חולף בטבק, כולל הווריאציה נע במהלך DOE. גורמים מודגשים נכללו רק בעיצוב לניסויים שתוארו תחת "מודל תיאורים עבור הצטברות DsRed בביטוי חולף באמצעות אמרגן / 5'UTRs שונה", ואילו גורמים בכתב נטוי נכללו רק בעיצוב ל" אופטימיזציה אינקובטוריםתנאי n וערכות יבול לייצור נוגדנים חד שבטיים בצמחים באמצעות ביטוי חולף ".

figure-protocol-2
איור 2. תהליך תכנון DOE. גורמים עם השפעה משמעותית על התגובה תחת החקירה נבחר מבוסס על נתונים הקיימים. ואז תכונות גורם (לדוגמא מספרית), טווחים והרמות מוקצות. ידע וניסויים קודמים משמשים להגדרת מודל בסיס מתאים. דרישות כוח הניבוי מוגדרות המבוססות על היישום / מטרת המודל הסופי. לאחר מכן ניתן להעביר את הנתונים שנאספו לתוך תוכנת מחלקת אנרגיה מתאימה.

2. הגדרת RSM בDesignExpert

  1. התחל DesignExpert ובחר באפשרות "עיצוב חדש". בחלון "תגובת שטח", בחר &34 #; אופטימלי "והזן את מספר הגורמים המספריים ונחרצים שנבחרו בסעיף 1.1).
  2. הזן את גורם שמות, יחידות, סוגים, תת סוגים, מספר רמות / גבולות רמה וערכים לרמות עבור כל הגורמים בשדות המתאימים.
  3. המשך לדף הבא ותחת "חיפוש" אפשרויות בחירה "הטוב ביותר", כמו גם את הקריטריון "האופטימלי" הרצוי, כאן "D-אופטימלי".
  4. בתפריט "מודל עריכה ...", בחר במודל המכיל את הגורמים ואינטראקציות צפויות בסעיף 1.2). אם לא ברור, בחר במודל מלא המכסה את כל הגורמים ואינטראקציות עבור פולינום מידה מסוימת, כאן "ריבועית". שים לב שבחירה במודל מלא (המכיל את כל האינטראקציות) יכולה להגדיל את מספר הניסויים הדרושים לאיילה.
  5. בחר את מספר "בלוקים". הנה, בלוק אחד היה בשימוש, כי כל הצמחים מאותו אצווה, כל החיידקים היו בתרבית במקביל וכל הזריקות בוצעו באותו היום על ידי אותו מפעיל. השתמש בבלוק אחד או יותר אם אצווה אחד או יותר של צמחים משמש או כמה מפעילים להתמודד עם הזריקות.
  6. לאזן את העיצוב
    1. אפשר "להכריח את האיזון נחרץ" כדי להפיץ את הריצות של הניסוי באופן שווה בין רמות הגורם הנחרצות, למשל יזמים שונים שנבדקו.
      שים לב: זה יכול להפחית את אופטימלי של העיצוב במידה שDesignExpert תדווח כערך% בהתאם לנקודות שנבחרו על ידי האלגוריתם האופטימלי.
    2. לחשב מחדש את העיצוב מספר פעמים באמצעות אלגוריתם הזרע האקראי יושם כדי לצמצם את הירידה באופטימלית.
      הערה: הפסדים באופטימליים יכולים לנוע בין ~ 3-40% תוך שימוש באותה נתוני קלט, אבל לשנות את מספר החזרות ניתן להשתמש כדי לשמור על איזון משמעי.
  7. התוכנה תציע ערך למספר "נקודות דגם", המבוסס על מודל הבסיס, כאן 70 ריצות. התאם את מספר הריצות ל" משכפל "ו" כדי להעריך את חוסר ההתאמה "כדי להבטיח שהוא> 5% ממספר" נקודות דגם "לכל אחד, כאן 10 ריצות כל אחד.
  8. המשך בעמוד הבא, בחר את מספר התגובות ולהזין השמות והיחידות שלהם. ניתן גם להוסיף תגובות נוספות בכל עת במהלך הערכת נתונים ללא כל השפעה שלילית על העיצוב.
  9. תמשיך להפעיל את האלגוריתם, חישוב רמות הגורם לריצות של האיילה. אם בסיס המודל שנבחר אינו תואם את מספר הרמות עבור גורם מסוים, הודעות יוצגו והחישוב לא יתחיל. במקרה זה אחד משתיים:
    1. להגדיל את מספר הרמות עבור גורם זה, או
    2. בטל את הבחירה במונחים בבסיס המודל שלא יכול להיות מחושב על בסיס המספר הנוכחי של רמות.
    3. לדוגמא, אם יש שתי רמות לגורם לא "זמן דגירה" (כלומר, 2 ד ו 5 ד) בtהוא עיצוב הנוכחי ומודל בסיס ריבועית כוללים לא לטווח 2 נבחר, או להוסיף רמה שלישית עבור t (כלומר 8 ד) או להסיר את t הגורם 2 מהמודל.
  10. שמור את הגיליון האלקטרוני המכיל שילובי גורם אופטימליים המוצג פעם אחת החישוב הוא מוחלט.
  11. בצומת "העיצוב" בחר את "ההערכה" משנה הצומת וללכת ללשונית "הגרפים".
    1. ב" כלי הגרפים "בחר" FDS "ובתיבה" FDS הגרף "לבחור" Pred "כסוג השגיאה. לאחר מכן, הזן את ההבדל המינימאלי לזיהוי, כמו גם את הערך המשוער לסטיית התקן המשוערת של מערכת הגדרתו בסעיף 1.1.1) כערכים עבור "ד" ו "ים" בהתאמה (כאן 20 ו8 מיקרוגרם / מיליליטר לDsRed). גם להזין את רמת אלפא (% מקובלים חסר השפעה משמעותית) המתאימה ליישום, בדרך כלל 0.05 (5%).
    2. ודא שFDS המחושב תואם את אחוז הגדרתו בסעיף 1.3) (בדרך כלל> 0.95 למודלים חזוי). עקום שטוח בעלילת FDS עדיף, מה שמעיד דיוק חיזוי אחיד בכל מרחב התכנון.
      1. אם זה לא המקרה (כפי שנמצא כאן, FDS היה 1% כפי שמוצג באיור 3 א), לחזור לצומת "העיצוב" ובשורת המשימות לבחור "כלים עיצוב", ואז "להגדיל עיצוב ..." ולבחור " להגדיל ".
      2. בחר אותם הקריטריונים "חיפוש" ו" אופטימליים "כמו קודם. גם בחר את אותו "מודל ערוך" והגדרות "כוח איזון נחרץ". אם הגדלת העיצוב מתבצעת לפני כל ניסוי (כפי שנעשה כאן), ולאחר מכן לשנות את "שים את הריצות לבלוק" הגדרה "Block1".
      3. בסעיף "פועל" הזן את מספר "נקודות דגם" נוספות, שמירה על "משכפל" לפחות 5% ו" כדי להעריך חוסרשל ההתאמה "בעיצוב הכולל. הנה, 100 ריצות נוספו ולא" משכפל "ו" כדי להעריך חוסר ההתאמה "היו כלול.
      4. ברגע שהחישוב הסתיים, לבחון מחדש את גרף FDS כפי שתואר לעיל. אם FDS עדיין אינו משביעת רצון, לחזור על הגדלת העיצוב כפי שתואר לעיל. הנה FDS היה 100% לאחר הגדלת ולכן לא הייתה צורך בהגדלה נוספת (איור 3 ב).

figure-protocol-3
איור 3. השוואה בין חלקות FDS. . איילה בהיקף של 90 ריצות מייצרת FDS מספק של 1% בלבד לשגיאה סטנדרטית של חיזוי, תוך שימוש במודל בסיס ריבועית בשילוב עם הערכים על ההפרש המינימאלי לזיהוי (20 מיקרוגרם / מיליליטר) ואסתיהזדווגו סטיית התקן של המערכת (8 מיקרוגרם / מיליליטר). ב '. הגדלת של האיילה לסך של 210 ריצות השיגה FDS 100% ועקומים שטוחים המציין דיוק אחיד של המודל בחלל העיצוב.

3. שיבוט וניתוח של ביטוי קלטות

  1. טפח את חיידקי Escherichia ב 5 מיליליטר מדיום LB (tryptone 10 גר '/ ל', תמצית שמרים 5 גר '/ ליטר, 170 mM NaCl, 50 מ"ג / אמפיצילין L; צלחות LB-אגר אגר כוללות L / 15 ז) ב37 מעלות צלזיוס במשך 6 -8 שעות או למשך הלילה על שייקר מסלולית ב160 סל"ד. זהירות: אמפיצילין הוא חומר מזיק. לחסן מדיום LB עם או 50 μl של תרבות נוזל או תאי העברה ממושבות גדלו על צלחות באמצעות קצה פיפטה.
  2. לטיהור של ה-DNA פלסמיד PSO, ומכשירים הנגזרים אחרים של ppam (GenBank AY027531), מE. זן החיידק K12 DH5a, בצע את ההוראות במדריך לטיהור DNA ערכת 24. זהירות: k הטיהורהוא מכיל כימיקלים מזיקים (ראה לעיל במדריך לפרטים נוספים). רצף פלסמיד מתואר באיור 4 ועל ידי הקונה ואח'. 20.
  3. קבע את ריכוז ה-DNA בeluate המטוהרים על ידי מדידת הספיגה של מדגם 2 μl ב 260 ננומטר במכשיר NanoDrop.
  4. לאשר את זהותו של ה-DNA פלסמיד מטוהר על ידי עיכול עם endonucleases הגבלה (מיל ').
    1. בחר מיל פי רצף פלסמיד, כך שדפוסים שבר ייחודיים ומובחנים נוצרים. עקוב אחר ההמלצות של היצרן לתנאי העיכול כגון נפח תגובה, זמן, טמפרטורה וריכוז של אלבומין בסרום שור מייצב. בהתאם לרגישות מכשיר הניתוח, השתמש 50-500 ng של DNA פלסמיד לעיכול.
    2. הכן ג'לי .8-2.0% להפרדה של שברי DNA על ידי הרתחת agarose בטריס-borate-EDTA חיץ (TBE) (90 מ"מ טריס, 90 borate מ"מ, 2 מ"מ EDTA; pH 8.0). Tהוא צפוי שברים גדולים יותר, יש להשתמש פחות בagarose ג'ל.
    3. הוסף 5 μl של חיץ מדגם פי חמישה (5x סאבו, 0.1% (w bromophenol / V) כחול, 0.1% (w / v) cyanol קסילן, 10% (w גליצרול / V) מומס בTBE) 50 μl של RE טופלו דגימת DNA ולהפריד את שברים על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose ב100 V ל~ 40 דקות או עד שהפרדה ברורה של שברים מושגת. בכל ג'ל, כולל נתיב המכיל סמני גודל סולם DNA לצורך ההשוואה, לדוגמא 2-3 μl סולם 1-KB.
  5. החלף את 5'UTR אומגה בPSO עם אחד משלוש 5'UTRs האחר.
    1. שחרר את רצף 5'UTR אומגה מ ~ 4-DNA PSO מטוהר מיקרוגרם על ידי טיפול עם 20 יחידות של Eco RI-HF ומיל I-HF מש"ק ב4 NEBuffer ב37 מעלות צלזיוס במשך ~ 60 דקות. ואז להפריד את שברים כמפורט בסעיפי 3.4.2 ו 3.4.3.
    2. לבודד את שבר הגדול יותר (PS, "עמוד השדרה") מagarose ג'ל באמצעות ג'ל נוסףערכת ction על פי היצרן של מדריך ל25 ולקבוע את הריכוז של ה-DNA המטוהרים כפי שתואר בסעיף 3.3). זהירות: ערכת חילוץ ג'ל מכילה כימיקלים מזיקים, ראה את המדריך לפרטים.
    3. לבודד את CHS, CHS-LPH וTL 5'UTRs מוקטורי תורם מתאימים על ידי טיפול ~ 10 מיקרוגרם של כל וקטור עם 20 יחידות של Eco RI-HF ומיל המש"ק I-HF ב4 NEBuffer ב37 מעלות צלזיוס במשך ~ 60 דקות. ואז להפריד את שברים כמפורט בסעיפי 3.4.2 ו 3.4.3 ולטהר את הבר 5'UTR המכיל הקטן יותר כמתואר בסעיף 3.5.2.
    4. ולקשור 5'UTRs מטוהר המבודד בaliquots נפרדים לווקטור המבודד מטוהר PS יניארי 25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות על פי המלצות היצרן 26. השתמש ~ 50 ng של DNA וקטור ועודף טוחנות פי שלוש מ5'UTR DNA בנפח כולל של 20 μl.
  6. תאי coli E טרנספורמציה עם הפלסמידים דואר רקומביננטי 26,27.
    1. להוסיף ~ 10 ng (~ 4-5 μl) של תערובת קשירה (ראה סעיף 3.5.4) ל50 E. המוסמך RbCl μl coli ומערבבים בעדינות, ולאחר מכן דגירה של 30-60 דקות על קרח. הלם חום ל1.5 דקות ב42 מעלות צלזיוס ומקרר על קרח ל5-30 דקות.
    2. הוספת 950 μl של מדיום LB ללא אנטיביוטיקה ודגירה עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס ו160 סל"ד. לבחירת transformants, להפיץ 50 ו100 μl של התרבות על צלחות אגר LB המכילות אמפיצילין ודגירה ~ שעות 16-20 ב 37 ° C.
    3. לחסן 5-10 מושבות נפרדות המייצגות את כל קשירת האמרגן-5'UTR המתואר בסעיף 3.1 לaliquots 5 מיליליטר של מדיום LB המכילים אמפיצילין. לאחר מכן לטהר את ה-DNA פלסמיד ולאשר את הזהות שלה כמפורט בסעיפים 3.2-3.4.
  7. החלף את אמרגן 35SS עם אמרגן nos בכל אחד מארבעת פלסמידים 5'UTR באמצעות מיל עולה לי ואקו RI בNEBuffאה 4 ב-C ° 37 עבור שעה 1 כפי שתואר בסעיפים 3.5 ו3.6.
  8. להציג את כל אחד משמונת פלסמידים שנוצרו לתוך א tumefaciens GV3101 מתח: pMP90RK ידי electroporation 28.
    1. להוסיף ~ 500 ng של DNA פלסמיד מטוהר ל50 א μl המוסמך tumefaciens תאים על קרח. לערבב בעדינות ולהעביר לתוך קובט electroporation 0.2 סנטימטר prechilled. ודא שהתערובת היא בחלק התחתון של קובט ואינו מכילה בועות.
    2. תאי דופק ב2.5 קילו וולט עבור 5 אלפית שני ולאשר את עוצמת ומשך הדופק.
    3. הימנעו מריכוזי מלח גבוהים בדגימת DNA או הכנה לא נכונה של א 'המוסמכת tumefaciens תאים, כי אלה עלולים לגרום לזרמי יון גבוהים גורמים לאידוי מיידי של ההשעיה התא, מקטין מאוד את יעילות שינוי.
    4. הוספת 950 μl של מדיום ייב ללא אנטיביוטיקה (תמצית בשר בקר 5 גר '/ ליטר, תמצית שמרים גרם 1 / L, pepton 5 גר' / ליטרדואר, סוכרוז 5 גר '/ ליטר, 2 מ"מ MgSO 4, pH 7.0), לערבב בעדינות ולהעביר מייד לצינור תגובה 1.5 מ"ל סטרילי. דגירה של 2-4 שעות ב 26-28 ° C ו 160 סל"ד.
    5. מורחים 1-2 μl על גבי צלחות אגר ייב המכילות אנטיביוטיקה (50 מ"ג / ליטר   carbenicillin, 25 kanamycin מ"ג / ליטר, 25 מ"ג / ליטר ריפאמפיצין) לבחירת transformants. זהירות: ריפאמפיצין הוא חומר רעיל.
    6. לחסן שלושה aliquots 5 מיליליטר של מדיום ייב המכילים אנטיביוטיקה עם תאים ממושבות נפרדות המייצגות את כל קשירת האמרגן-5'UTR ודגירה של 48-72 שעות ב 26-28 ° C ו 160 סל"ד.
  9. לאשר את ההצלחה של א ' tumefaciens שינוי.
    1. העברה 2 μl של כל aliquot מסעיף 3.8.6 להפריד 48 aliquots μl של mastermix PCR (2 μl של כל מנית פריימר 10 מיקרומטר (400 ריכוז סופי ננומטר של כל צבע יסוד),1 μl תמהיל 10 מ"מ dNTP (200 מיקרומטר ריכוז סופי של כל אדנוזין deoxynucleoside), 5 μl פי 10 להרחיב חיץ נאמנות גבוהה עם 15 מ"מ MgCl 2, 0.75 μl להרחיב תערובת אנזים נאמנות גבוהה, ומים מזוקקים סטריליים 39.25 μl).
    2. להגביר את קלטת הביטוי של כל פלסמיד באמצעות פריימרים מתאימים (FWD: 5'-CCT CAG GAA GAG CAA TAC-3 ', כריכת 1026 נוקלאוטידים במעלה הזרם של האמרגן; REV: 5'-CCA AAG CGA GTA CAC-AAC-3', כריכה בתוך אתר polyadenylation 35S) בתנאי PCR מתאימים. הנה, 94 ° C שימש לdenaturation הראשוני ואחריו 30 מחזורים של denaturation 94 מעלות צלזיוס במשך 15 שניות, חישול 51 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות והתארכות 72 מעלות צלזיוס למשך 120 שניות, וצעד התארכות סופי ב72 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות.
    3. לקבוע את גודלו של מוצרי ה-PCR על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose כמפורט בסעיף 3.4.3.
  10. הכן א tumefaciens מניות גליצרול ידי(V / V) גליצרול סטרילי ערבוב 500 μl 50% עם 500 μl של א ' tumefaciens תרבויות מ3.8.6 מקטע שעבורו שינוי אושר (סעיף 3.9.3). אחסן את מניות גליצרול ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
  11. לחשב את אנרגיות קיפול של mRNAs השונים באמצעות שרת האינטרנט של RNAfold 29 וכוללים רצף נוקליאוטידים מאתר תחילת השעתוק דרך ל50 נ"ב הראשון של אזור הקידוד.
    1. בסעיף "מקפלים אלגוריתמים ואפשרויות בסיסיות" בחר את "אנרגיה מינימאלית בחינם (MFE) ופונקציית החלוקה" ו" להימנע מבודדות זוגות בסיסים "אפשרויות.
    2. ב, "הפרמטרים RNA (מודל טרנר, 2004)" "אפשרויות קיפול מתקדמות" בוחרות "מתנדנדות אנרגיות משני צידי סליל בכל מקרה" ולשנות את "rescale פרמטרים אנרגיה לטמפרטורה מסוים (C)" ל25 ° C.
    3. בסעיף "אפשרויות פלט" בחר בכל האפשרויות.
    4. מ" התוצאות עבור התרמודינמית הרכב חיזוי "בסעיף של קובץ הפלט, לחלץ את" האנרגיה חופשית של ההרכב תרמודינמיים "ואת" בתדר של מבנה MFE בהרכב "הערכים לשם השוואה.

figure-protocol-4
איור 4. יזם ו5 'UTR גרסאות. קלטות הביטוי נוצרו על ידי ההחלפה בשלבים של 5'UTR, וכתוצאה מארבעה שילובים עם אמרגן CaMV 35SS, ואחרי ההחלפה של האמרגן הזה עם רצף nos מניב ארבע גרסאות נוספות ו בסך הכל שמונה שילובי אמרגן / 5'UTR שונים.

4. לגידול צמחים

  1. הכן פתרון 0.1% מהדשן Ferty2 מגה במי דה המיונן ב-pH 5.9.
  2. הכן 10 לוקי x 10 x 8 Rockwool סנטימטר על ידי שטיפה נרחבת עם מים deionized כדי להסיר שאריות של חומרים כימיים ולבסוף לאזן עם דשן.
  3. זרעי צמחי טבק על ידי הצבת 1-2 זרעי טבק על כל בלוק Rockwool ובעקבותיו שטף קצר עם הדשן להיות זהיר, כדי למנוע שטיפת הזרעים.
  4. לנבוט ולטפח את צמחי טבק ל42 ימים בחממה בטמפרטורת 25/22 יום C ° / לילה, 70% לחות יחסית וphotoperiod 16-HR (180 מילימול שניות -1 מ -2; λ = 400-700 ננומטר) . במהלך photoperiod זה, להשקות עם דשן ל15 דקות בכל שעה בתרבות הידרופוני.

5. ביטוי חלבון חולף

  1. הכן א tumefaciens להזרקה לתוך עלים.
    1. לחסן 5-50 מיליליטר של מדיום ייב המכיל אנטיביוטיקה עם א '1% tumefaciens תרבות cryo-מניות ולדגור על 27 מעלות צלזיוס עד שהובסו <תת> 600nm מגיע 5.0 (~ 48-72 שעות בהתאם לכמות וסוג הכלי).
    2. לדלל את א ' תרבות tumefaciens עם מים ובינוני הסתננות פי 2 (מלחי 4.3 g / L Murashige וSkoog (pH 5.6), סוכרוז 5 גר '/ ליטר, 1.8 גרם גלוקוז / L, 100 acetosyringone מ"מ) כדי להתאים 600nm OD הנדרש להזרקה. לאשר את 600nm OD ממש לפני ההזרקה. הערה: 600nm OD של 1.0 מקבילה ~ x 1.43 ± 0.12 10 9 מושבה להרכיב יחידות למ"ל.
  2. הזרק א tumefaciens השעיה לעלים.
    1. בחר ולתייג את העלים ועמדות noncotyledon עליה להתייחס אליהם (לדוגמא: על פי אסטרטגית DOE).
    2. אין להזריק א שונה tumefaciens פתרונות לאותו שדה צלעי. במקום זאת, השתמש סעיפים מנוגדים בכל צד של ציר אמצע וריד. אם יותר משני פתרונות שונים צריכים להיות מוזרקים באותה התנוחה להשתמש additionaצמח ליטר.
    3. יסודיות לנער א פתרון tumefaciens לresuspend כל תאים שאולי התיישבו מאז הכנת הדילול ולשאוב לתוך מזרק 1 מ"ל.
    4. בעדינות לגרד את העור במיקום המיועד להזרקה עם קצה פיפטה או דומה כדי להקל על הזרם של א tumefaciens פתרון. הימנע פקיעת הלהב עלה תוך כדי כך.
    5. החזק את המזרק בניצב ללהב העלה נוגע בחבית נגד שדה הצלע שיתייחסו אליו ודחף בעדינות את השקע (ללא מחט מחוברת) על גבי הצד התחתון של העלה. לחץ על הצד העליון של העלה בעדינות באותו הזמן כדי למנוע את הלהב עלה מהסטה או פקיעת.
    6. דחף בעדינות את הבוכנה המזרק. א פתרון tumefaciens ייכנס לחללים אינטר בתוך הלהב עלה כפי שעולה מהאזורים שטופלו מופיעים ירוק ולח כהים יותר. חזור על תהליך זה במספר התפקידים עד שכל intercostaשדה l הוא שחדר עם א ' tumefaciens. לאחר מכן להמשיך עם שדה הצלע הבא.
    7. ודא את המזרק נשאר בניצב לעלה. הטיית המזרק תגרום להשעית החיידקים למזרקה החוצה בלחץ גבוה.
    8. אם א 'שונה פתרונות tumefaciens משמשים (למשל כדי לבדוק את היזמים שונים), להסיר כל פתרון עודף שנותר בחלק התחתון של העלה מהזריקה הראשונה בעזרת מגבת נייר או דומה לפני יישום הפתרון הבא.
  3. דגירה שלאחר חדירה של צמחים ודגימה.
    1. הכן phytotron לצמחים שטופלו ~ 24 שעות לפני ההזרקה כדי לאפשר איזון טמפרטורה ולחות ברמות הנדרשות לאיילה.
    2. לאחר הזרקה, העברת מפעלים לphytotron ולהכניס אותם לתוך מגשים גדולים מספיק להשקיה במים עד תום תקופת הדגירה שנקבעה על ידי משרד האנרגיה.
    3. להקים אוריה 16 שעותoperiod באמצעות שישה 36 צינורות Osram מגניבים לבנים W ניאון ל0.7 מ 2 (75 מילימול שניות -1 מ -2; λ = 400-700 ננומטר). למנוע צמחים מהצללה אחד את השני על ידי הגבלת המספר של צמחים לשישה ל0.7 מ '2.
    4. לפני הדגימה, ודא ששדה הצלע הנכון נבחר על ידי השוואת התווית הוסיפה בסעיף 5.2.1 ותכנית DOE.
    5. השתמש במקדח פקק כדי להסיר 4-5 דיסקים עלה משדות הצלע שטופלו בעמדות וזמנים שצוינו על ידי משרד האנרגיה. אין להסיר את כל העלים מהצמח בדגימה. לייצב את העלים במגבת נייר ביד בזמן הסרת הדיסקים כדי למנוע קרע.
    6. לקבוע את המסה של כל דגימה ולמקם אותו בצינור תגובת פלסטיק 1.5 מיליליטר שכותרת עם שם של מדגם והמוני. אחסן את הדגימות ב -20 מעלות צלזיוס או -80 מעלות צלזיוס לפני quantitation החלבון. התהליך עשוי להיות מושהה בשלב זה לכמה חודשים, תלוי ביציבות מדגםוטמפרטורת האחסון.

6. Quantitation חלבון

  1. לחלץ חלבונים מדגימות דיסק עלה.
    1. הוסף 3 מיליליטר של מיצוי מאגר (פוספט נתרן 50 מ"מ, נתרן כלורי 500 מ"מ; pH 8.0) למ"ג של מסה לדוגמא ולטחון דיסקים עלה בצינור התגובה באמצעות העלי חשמלי עד שלא שברים גדולים יישארו. הימנע מחימום יתר של המדגם.
    2. הסר מוצקים פוזרו על ידי צנטריפוגה המדגם פעמיים בXG 16,000 עבור 20 דקות ב 4 ° C. מעביר את supernatant לתוך צינור תגובה 1.5 מיליליטר נקי לאחר כל שלב מבלי להפריע גלולה.
    3. לאחר צנטריפוגה, התהליך עשוי להיות מושהה על ידי הקפאת תמציות הצמחים ב -20 מעלות צלזיוס או -80 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים, תלוי ביציבות המדגם וטמפרטורת אחסון. ודא שמחזור ההפשרה הקפאה אינו משפיע על הריכוז של חלבון המטרה (ים).
  2. למדוד את הקרינה DsRed.
    1. הכן שלושה משכפל טכני של כל דגימה לתוך צלחות שחורות 96 היטב חצי אזור (50 תמצית μl לכל טוב). למנוע היווצרות של בועות במהלך pipetting.
    2. להשתמש בערכה של שישה דילולים (0, 25, 75, 125, 175 ו225 מיקרוגרם / מיליליטר) של תקן לצלחת 96 היטב DsRed כדי ליצור עקומת התייחסות אניה. הכן את דילולים בPBS ולאחסן אותם ב-C ° 4 לשימוש תוך 3 חודשים.
    3. למדוד את הקרינה פעמיים, ברצף, בצלחת מצוידת ב530/25 עירור ננומטר ו590/35 מסנני פליטת ננומטר קורא 96 היטב.
    4. עבור כל דגימה, בממוצע הקרינה לאורך שני קוראת ושלוש טכניים משכפל ולחסר הערך שנרשם לשליטה הריקה המכילה 0 מיקרוגרם / DsRed מיליליטר. גם לחסר ערך זה מקורא מהדילולים סטנדרטיים ולהשתמש בערכים המתוקנים ריקים אלה לרגרסיה ליניארית מניב עקום התייחסות (דרך המקור של צירים).
    5. השתמש בשיפוע העקום ההתייחסות להמיר וluorescence נמדד הדגימות לתוך ריכוזי DsRed. במידת צורך, לדלל את הדגימות כך שאת ההודעה נופלת בתוך מרווח הריכוז של הסטנדרטים ולשקול גורם לדילול זה בחישובים שלאחר מכן.
  3. קבע את הריכוז של 2G12.
    1. הכן את מכשיר התהודה plasmon פני השטח (SPR) למדידת ריכוז נוגדנים על ידי צימוד חלבון אל פני השטח הפעיל של תא זרימה אחד. השתמש בזרימת תא אחר כמו התייחסות על ידי inactivating המשטח ללא צימוד של חלבון 30,31.
    2. לדלל תמציות צמחים 01:20 במאגר פועל SPR (10 HEPES מ"מ pH 7.4, 3 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.05% v v / Tween-20) ולמדוד את יחידות התגובה (RU) של נוגדן מחייבים את החלבון בשלוש משכפל טכני של כל דגימה בסוף הזרקת 90 μl (180 שניות ב30 μl / min). הפחת את RU נמדד בזרימת הפניה לתא (לא חלבון) מRU נמדד בfl הניסיוניow תא (חלבון פני השטח).
    3. מדוד סטנדרטי 585 ng / ml 2G12 לאחר כל 10-15 דגימות ולחסר הערך הנמדד בזרימת התייחסות התאים כפי שתואר לעיל. השתמש RU הממוצע של סטנדרטים אלה כדי לחשב עקומת התייחסות ליניארי דרך המקור של קואורדינטות.
    4. חשב את ריכוזי 2G12 בדגימות המבוססות על הדילול 1:20 ושיפוע העקום ההתייחסות.
    5. בדוק אם לא ספציפי מחייב חזקות לתא ההתייחסות, שיכול להשחית את המדידה. כמו כן לבדוק אם הסטנדרטים 2G12 לשמור על ערכים כ קבועים (<וריאציה 5%) ​​לאורך כל ניתוח, כמו וריאציה יותר משקפת את ההזדקנות של חלבון פני השטח.

7. ניתוח נתונים ולהערכה

  1. ידני לנתח את התגובות שנצפו בניסויים הביטוי לערכים (i) קיצוניים טעויות מדידה (גבוהות או נמוכות) המציין (ii) תוצאות יוצאות דופן, למשל שילובי גורם שגןלדרג תגובות בלתי צפויות המצביעות על חילופי נתונים, וכן (iii) חסר ערכים.
    הערה: להשתמש בפעולות אלה כדי למנוע בניית מודל המבוסס על נתונים שגויים.
  2. להעביר את הנתונים ניתחו תגובה (כאן ריכוזי החלבון) לתוך הצומת "העיצוב" של DesignExpert. ודא כי נתוני תגובה בצורה נכונה מוקצים להגדרות הגורם המתאימות. יש סעיף עזרה מקיף זמין בתוכנת DesignExpert המכסה את ההיבטים התייחסו בהמשך.
  3. בצומת "ניתוח", לבחור את התגובה כדי להיות מנותחים ותחילה בחר באפשרות "אף אחד" בכרטיסיית השינוי.
    הערה: שינוי מומלץ לדקות / יחסי מקסימום של התגובה הגדולה יותר מאשר 10. ניתן להשיג השינוי שימושי ביותר מBox-Cox-העלילה בכרטיסייה "האבחון" בסעיף "האבחון" של "כלי האבחון" המתואר להלן (סעיף 7.8). שינוי התחבר 10 הוא לעתים קרובות מתאים.
  4. המשך ללשונית "סיכום Fit", אשר מספקת מידע כללי אודות גורמים החשובים למערכת תחת חקירה (למשל אינטראקציות שני גורמים, השפעות ריבועית). התוכנה תציע מודל ראשוני המבוסס על משמעותו.
  5. בכרטיסייה "המודל", מודל ראשוני שנבחרו מראש על סמך התוצאות "סיכום Fit". להשתמש במצב האוטומטי כדי לערוך מודל זה:
    1. בחר "כדי תהליך", כלומר סדר אחד מעל המודל המוצע, למשל, אם המודל שהוצע הוא "2FI" (שתי אינטראקציה גורם) לאחר מכן בחר "ריבועית".
    2. בחר "מפגר" בתחום "הבחירה", אשר איטרטיבי להסיר מונחים לא משמעותיים מהמודל לאחר שתמשיך ללשונית "אנובה", המבוססת על ערך "אלפא החוצה" שאמור להיות בתחילת 0.100.
    3. אם יתבקש על ידי התוכנה, תמיד באופן אוטומטי לתקן את היררכית המודל כי זה necessary כדי לייצר מודלים אמינים 32,33.
  6. בכרטיסייה "אנובה", לחקור את המודל המוצע וגורמים הכלולים. אם יש צורך, להסיר באופן ידני את כל גורמים עם p-ערכים מעל סף מוגדר מראש (כאן 0.05, המקביל לרמה מובהקת של 5%) או כאלה שמבוססים על שיקול סביר מכניסטית על ידי מעבר חזרה ללשונית "הדגם", שינוי "בחירה" "ידני" ומבטל את הגורמים המתאימים מהמודל.
  7. חזור בכרטיסייה "אנובה", להעריך את המודל רעננים במונחים של p-value של "המודל" (ערך נמוך רצוי, כי זה מצביע על משמעות) ו( ערך גבוה "חוסר של ההתאמה" רצוי כי זה מעיד על חוסר המשמעות), כמו גם את הערכים עבור "R בריבוע", "מותאם R בריבוע" ו "חזוי R בריבוע" (ערכים> 0.80 רצויים עבור כל שלושת הערכים).
    1. השוואת ערכים אלה עבורr מודלים שונים כולל / לא כולל גורמים בכמה רמות משמעות.
      הערה: זה עשוי להיות מועיל כדי לשכפל את טור התגובה בצומת "העיצוב" ולבצע כל ניתוח בנפרד, או לייצא את הטבלה "אנובה" שלמה לתכנית אחרת, כגון גיליון אלקטרוני.
  8. המשך ללשונית "האבחון" כדי לאשר את איכותו של המודל ולזהות חריגות אפשריות בבסיס הנתונים שיש להם השפעה חזקה על המודל על ידי בחינה כל הלשוניות ב" כלי האבחון "(" אבחון "וסעיף" השפעה ") .
    1. בסעיף "האבחון" של "כלי האבחון", לבצע את הפעולות הבאות:
      1. ודאו הנקודות מפוזרות באופן אקראי במסגרת המגבלות ב" לעומת השאריות חזויות "תרשים. הנה, הפצה בצורת האות V. מצביעה על צורך לשינוי נתונים.
      2. ודאו הנקודות מפוזרות באופן אקראי במסגרת המגבלות ב"לעומת שאריות חזויות" תרשים. הנה, הפצה בצורת האות V. מצביעה על צורך לשינוי נתונים.
      3. לחקור אם הנקודות בפיזור התרשים "שאריות לעומת לרוץ" באופן אקראי במסגרת המגבלות. דפוס ("חדר מדרגות" למשל) מצביע על מגמה בבניין נתונים ובלוק יכול לשמש כדי לנטרל את השפעתה על המודל.
      4. חפש קו אלכסוני ישר מציין את המודל האידיאלי ב" חזוי לעומת בפועל "עלילה. הפיזור של נתונים ברחבי האלכסוני גדול יותר, פחות מדויק למופת.
      5. הגעה לחפיפה של כחול (הטוב ביותר) וירוק קווים אנכיים (בפועל) בתיבה-Cox-העלילה המציינת את שינוי הנתונים. אם הקו הירוק אינו תואם את כחול אחד (מחוץ למרווח שצוין על ידי הקווים האנכיים האדומים) לחזור לסעיף 7.3 ולשפר את סיבוב בניית מודל על ידי בחירת שינוי הנתונים שהוצע על ידי Box-Cox-העלילה. שוב כפל מחדשטור sponse יכול להיות שימושי כדי להשוות בין דגמים שונים.
      6. ודא שהנקודות בתרשימים "שאריות לעומת פקטור" (יש תרשים אחד עבור כל גורם מודל) מתפזרות באופן אקראי במסגרת המגבלות. עקמומיות בהפצת הנתונים עשויה להצביע על גורם חסר במודל.
    2. בסעיף "ההשפעה" של "כלי האבחון", לוודא שיש פיזור של נתונים בתוך הגבולות ב" שאריות studentized חיצונית "אקראי," DFFITS "" מינוף "ועלילות" DFBETAS "והפצה באופן שווה נמוכה ללא ערכים קיצוניים בעלילה "המרחק של קוק".
  9. בכרטיסייה "גרפים דגם", להמחיש את מודל ההערכה. למספר מצומצם של גורמים מספריים (לדוגמא 3) ייצוג פני שטח התגובה ("משטח 3D") הוא שימושי כדי להעריך אופטימה / מאפיינים באופן ידני.
    הערה: משטחי תגובה רק להמחיש את ההשפעה של שני factors בתגובה תחת חקירה. ההשפעה של גורם נוסף כלשהו בתגובה מתגלה על ידי שינוי הערך (גורמים מספריים) או ברמה (גורמים משמעיים) שלה בחלון "כלי גורמים". לחלופין, ניתן להקצות לגורמי ציר העלילה על ידי לחיצה ימנית עליהם בחלון "כלי גורמים" ובחירת ציר המשתנה הבלתי תלוי הרצוי.
    1. לתפעל את רמות הגורם ולהקצות אותם לצירי הגרף באמצעות "כלי הגורמים".
    2. גרפים יצוא באמצעות "גרף היצוא לקובץ ..." הפקודה בכרטיסייה "קובץ".
  10. השתמש "נומרית" משנה הצומת בצומת "אופטימיזציה" כדי לייעל את התגובה מבחינה מספרית (למזער, להגדיל, בטווח) כתלות בגורמי המודל, לאשר בתורו יכולים להיות מיושמים על אילוצים מסוימים (למשל גבולות ומשקולות) באמצעות "קריטריונים" כרטיסייה.
    1. לחשב ולבחון את הפתרונות מספריים ב" פתרונות "כרטיסייה המבוססת על הקלט הניתן בכרטיסייה "קריטריונים".
    2. לייצא את הפתרונות הללו לתוכנה אחרת (למשל גיליונות אלקטרוניים) לצורך ניתוח נוסף (לדוגמא היסטוגרמות) חושף את הגדרות הגורם מזוהות עם ערכי תגובה גבוהים או נמוכים.
      שים לב: זה מועיל אם יש יותר משלושה גורמים מספריים נחקרים וייצוג 3D הוא קשה.
  11. השתמש בתת הצומת "תחזית פוינט" כדי לחזות את התגובה לגורם הגדרות ספציפיות.
    1. השתמש בתחזית זו לכל ההגדרות להיות מוערכות (כאן, כל האמרגן ושילובי 5'UTR כמו גם את כל העלים ופעמים דגירה או עמדות עלה וטמפרטורות דגירה).
    2. לייצא את הערכים החזויים ולעבד אותם למערך נתונים שניתן להשתמש בם כדי לתאר ביטוי חולף בצמחי טבק, למשל על ידי חישוב הביטוי לשילוב האמרגן-5'UTR ספציפי בזמן מסוים בממוצע לכל עמדות העלה או אקרוss כל העלים של צמח.
    3. לנרמל את נתוני ביטוי המבוססים על המוני העלים השונים כדי להניב את הרמה הספציפית ביטוי (מיקרוגרם g -1) או שיעור מסוים ביטוי (-1 שעות מיקרוגרם g -1).
    4. לחלופין, לייצא את המקדמים של "המשוואה הסופית" מהחלק התחתון של הכרטיסייה "אנובה" לתוך גיליון אלקטרוני ולהכפיל אותם עם מערך של הגדרות גורם להניב את אותו מערך נתונים.
      שים לב: מערך זה יכול להכיל רק ערכים מגורמי ייצור במרחב התכנון הראשוני, כי משוואת המודל המצויד אינה מתאימה לניפוח.
  12. לערוך ניסוי לאישור נקודות מודל שיש בם עניין גדול.
    1. בצע ביטוי חלבון חולף תחת תנאים שנבחרו עבור "חיזוי פוינט" (סעיף 7.11). למשל להשתמש באותו טמפרטורות ועלים וכו '
    2. לקבוע את ריכוז החלבון לדואר ביטוי חולף זהxperiment כמו לתאר לעיל (סעיף 6) ולהשוות אותם עם הערכים החזויים על ידי המודל.
    3. בדקו אם ריכוז החלבון הממוצע בניסוי האישור נופל בתוך מרווח החיזוי של מודל משטח התגובה שהושג במהלך חיזוי נקודה. התאמה מאשרת את כוח הניבוי של המודל. חוסר התאמה מציינת יכולים להידרש באיכות מודל נמוכה וריצות נוספות.
    4. הערה: השתנות אצווה כדי אצווה צמח מרחיבה את מרווח החיזוי ויכולות לפחת ניסויי אישור הופיעו עם קבוצה של צמחים שונה. עם זאת, דוגמאות שלא השתמשו כדי ליצור את המודל, אלא שמקורו מאותה אצווה צמח כמו הדגימות הכלולות במודל יכולות לשמש בקרות אפקטיביות באותה מידה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מודל תיאורים עבור הצטברות DsRed בביטוי חולף באמצעות יזמים ו5'UTRs שונים

הקרינה DsRed בתמציות עלים שימשה כדי להצביע על רמת הביטוי של חלבון רקומביננטי וכך שימש כתגובה באסטרטגית DOE. הבדל גילוי המינימום שאנחנו נחשבים רלוונטיים היה 20 מיקרוגרם / מיליליטר וסטיית התקן המשוער של המערכת הייתה 8 מיקרוגרם / מיליליטר המבוסס על ניסויים ראשוניים. גורמים הנכללים במודל הביטוי החולף נבחרו על בסיס 7,8

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כל ניסוי דורש תכנון זהיר, כי משאבים הם לרוב נדירים ויקרים. זה נכון במיוחד לאסטרטגיות מחלקת אנרגיה בגלל שגיאות במהלך שלב תכנון (לדוגמא: בחירת דגם בסיס שאינו מכסה את כל אינטראקציות הגורם משמעותיות) באופן משמעותי יכולות לצמצם את כוח הניבוי של מודלים וכתוצאה מכך ובכך פיחות הניסוי כולו. עם זאת, יכולות בקלות להימנע טעויות אלה על ידי ביצוע נהלים בסיסיים.

שיקולים בתכנון מחלקת האנרגיה

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אגרת הפרסום מומנה באופן חלקי על ידי חברות Statease, Inc (ארה"ב) וStatcon (גרמניה), שלא היו מעורבות במעורב בהכנת כתב היד או אחראית לכל התוכן שלו.

תודות

המחברים מודים לד"ר תומס Rademacher למתן וקטור ppam צמח הביטוי ואבראהים אל עמדי לטיפוח צמחי טבק המשמשים במחקר זה. ברצוננו להודות לד"ר ריצ'רד מ Twyman לסיועו בעריכת כתב היד. עבודה זו בחלקו מומנה על ידי המועצה האירופית למחקר מתקדם גרנט "העתיד-פארמה", מספר הצעת 269,110 וFraunhofer Zukunftsstiftung (Fraunhofer עתיד הקרן).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מומחה עיצוב(R) 8Stat-Ease, Inc.n.a.DoEתוכנה
טריפטוןCarl Roth GmbH8952.2רכיב מדיה
תמצית שמריםCarl Roth GmbH2363.2רכיב מדיה
נתרן כלוריCarl Roth GmbHP029.2רכיב מדיה
AmpicillinCarl Roth GmbHK029.2אנטיביוטיקה
Agar-AgarCarl Roth GmbH5210.2רכיב מדיה
Escherichia coli K12 DH5aLife Technologies18263-012מיקרואורגניזם
pPAMGenBankAY027531וקטור שיבוט/ביטוי;  
פלסמיד נוקלאוספין MACHEREY-NAGEL GmbH740588.250ערכת בידוד DNA פלסמיד
NucleoSpin Gel וניקוי PCRMACHEREY-NAGEL GmbH740609.250ערכת טיהור DNA פלסמיד
NanoDrop 2000Thermo Scientificn.a.Spectrophotometer
NcoINew England Biolabs Inc.R3193Lהגבלהאנדונוקלאז
EcoRIניו אינגלנד Biolabs Inc.R3101Lהגבלהאנדונוקלאז
AscIניו אינגלנד ביולאבס בע"מR0558Lהגבלהאנדונוקלאז
NEB 4ניו אינגלנד ביולאבס בע"מB7004SRestrictionendonuclease buffer
TRISCarl Roth GmbH4855.3רכיב מדיה
דיסודיום טטרבוראטCarl Roth GmbH4403.3רכיב מדיה
EDTACarl Roth GmbH8040.2רכיב מדיה
AgaroseCarl Roth GmbH6352.4רכיב מדיה
ברומופנול כחולCarl Roth GmbHA512.1מחוון צבע
קסילן ציאנולCarl Roth GmbHA513.1מחוון צבע
גליצרולCarl Roth GmbH7530.2רכיב מדיה
תא Mini-Sub GT CellBioRad170-4406תא אלקטרופורזה ג'ל
Agrobacterium tumefaciens זן GV3101:pMP90RKDSMZ12365מיקרואורגניזם
Electroporator 2510Eppendorf4307000.658
תמצית בקרElectroporator Carl Roth GmbHX975.2רכיב מדיה
PeptoneCarl Roth GmbH2365.2רכיב מדיה
סוכרוזCarl Roth GmbH4621.2רכיב מדיה
מגנזיום גופרתיCarl Roth GmbH0261.3רכיב מדיה
קרבניציליןקארל רוט GmbH6344.2אנטיביוטיקה
קנמיציןקארל רוט GmbHT832.3אנטיביוטיקה
RifampicinCarl Roth GmbH4163.2אנטיביוטיקה
FWD פריימרEurofins MWG Operonn.a.CCTCAG GAA GAG CAA TAC
REV פריימרEurofins MWG Operonn.a.CCAAAG CGA GTA CAC AAC
2720 Thermalcycler Applied Biosystems4359659Thermocycler
RNAfoldwebserver אוניברסיטת וינהn.a.Software
Ferty 2 MegaKammlott5.220072דשן
גרודן קוביות צמר סלעים 10 x10 ס"מGrodann.a.Rockwoolblock
חממה
צמחיםPhytotronIlka Zelln.a.לגידולצמחים
Omnifix-F SoloB. Braun6064204
מזרק Murashige ומלחי SkoogDuchefaM 0222.0010רכיב מדיה
גלוקוזCarl Roth GmbH6780.2רכיב מדיה
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406-5GPhytohormon analogon
  ביופוטומטר פלוסאפנדורף6132 000.008פוטומטר
אוסראם לבן מגניב 36 Wאוסראם4930440מקור אור
דיסודיום פוספטקארל רוט GmbH4984.3רכיב מדיה
צנטריפוגה 5415Dאפנדורף5424 000.410צנטריפוגה
פורמה -86C מקפיא ULT ThermoFisher88400מקפיא
Synergy HTBioTekSIAFRTקורא צלחות פלואורסצנטיות
Biacore T200GE Healthcaren.a.SPRמכשיר
חלבוןLife Technologies10-1006חלבון קושר נוגדנים
HEPESCarl Roth GmbH9105.3רכיב מדיה
Tween-20Carl Roth GmbH9127.3רכיב מדיה
2G12 נוגדןPolymunAB002נוגדן ייחוס
n.a.n.a.לגידול A

מקורות

  1. Fischer, R., Emans, N. Molecular farming of pharmaceutical proteins. Transgenic research. 9, 277-299 (2000).
  2. Commandeur, U., Twyman, R. M., Fischer, R. The biosafety of molecular farming in plants. AgBiotechNet. 5, 9 (2003).
  3. Shoji, Y., et al. A plant-based system for rapid production of influenza vaccine antigens. Influenza Other Resp. 6, 204-210 (2012).
  4. Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A., Lommel, S. A. Nicotiana benthamiana: Its history and future as a model for plant-pathogen interactions. Mol Plant Microbe In. 21, 1015-1026 (2008).
  5. Berg, R. H., Beachy, R. N. Fluorescent protein applications in plants. Method Cell Biol. 85, 153 (2008).
  6. Chung, S. M., Vaidya, M., Tzfira, T. Agrobacterium is not alone: gene transfer to plants by viruses and other bacteria. Trends in plant science. 11, 1-4 (2006).
  7. Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 96, 608-614 (2007).
  8. Wydro, M., Kozubek, E., Lehmann, P. Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene expression system in leaves of Nicotiana benthamiana. Acta Biochimica Polonica. 53, 289-298 (2006).
  9. Buyel, J. F., Fischer, R. Processing heterogeneous biomass: Overcoming the hurdles in model building. Bioengineered. 4, (2013).
  10. Fischer, R., Schillberg, S., Hellwig, S., Twyman, R. M., Drossard, J. GMP issues for recombinant plant-derived pharmaceutical proteins. Biotechnol Adv. 30, 434-439 (2012).
  11. Daniel, C. One-at-a-time plans. Journal of the American Statistical Association. 68, 353-360 (1973).
  12. Czitrom, V. One-Factor-at-a-Time versus Designed Experiments The American Statistician. 53, 6 (1999).
  13. Anderson, M. J., Kraber, S. L. Keys to successful designed experiments. ASQ - The global voice of quality. 6, 6 (1999).
  14. Montgomery, D. C. Design and Analysis of Experiments. , John Wiley & Sons Inc. (2007).
  15. Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments. , Wiley. (2009).
  16. Piepel, G. F. Programs for generating extreme vertices and centroids of linearly constrained experimental regions. J Qual Technol. 20, 15 (1988).
  17. FDA. , U.S. Department of Health and Human Services. Rockville, MD, USA. (2009).
  18. Shivhare, M., McCreath, G. Practical Considerations for DoE Implementation in Quality By Design. BioProcess International. 8, 9 (2010).
  19. Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnology and bioengineering. 109, 2575-2588 (2012).
  20. Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnology and bioengineering. 110, 471-482 (2013).
  21. Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. , Productivity Inc. (2000).
  22. Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. Response Surface Methods Simplified. , Productivity Press. (2005).
  23. De Gryze, S., Langhans, I., Vandebroek, M. Using the correct intervals for prediction: A tutorial on tolerance intervals for ordinary least-squares regression. Chemometr Intell Lab. 87, 147-154 (2007).
  24. Plasmid DNA purification User manual. , MACHEREY-NAGEL. Düren. (2012).
  25. PCR clean-up Gel extraction User manual. , MACHEREY-NAGEL. Düren. (2012).
  26. Quick Ligation Protocol. 4, NewEnglandBiolabs. Ipswich. (2009).
  27. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High-Efficiency Transformation of Escherichia-Coli with Plasmids. Gene. 96, 23-28 (1990).
  28. Main, G. D., Reynolds, S., Gartland, J. S. Electroporation protocols for Agrobacterium. Methods in Molecular Biology. 44, 405-412 (1995).
  29. Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neubock, R., Hofacker, I. L. The Vienna RNA websuite. Nucleic acids research. 36, 70-74 (2008).
  30. Howell, S., Kenmore, M., Kirkland, M., Badley, R. A. High-density immobilization of an antibody fragment to a carboxymethylated dextran-linked biosensor surface. J Mol Recognit. 11, 200-203 (1998).
  31. Newcombe, A. R., et al. Evaluation of a biosensor assay to quantify polyclonal IgG in ovine serum used for the production of biotherapeutic antibody fragments. Process Biochem. 41, 842-847 (2006).
  32. Peixoto, J. L. Hierarchical Variable Selection in Polynomial Regression-Models. Am Stat. 41, 311-313 (1987).
  33. Peixoto, J. L. A Property of Well-Formulated Polynomial Regression-Models. Am Stat. 44, 26-30 (1990).
  34. Sanders, P. R., Winter, J. A., Barnason, A. R., Rogers, S. G., Fraley, R. T. Comparison of cauliflower mosaic virus 35S and nopaline synthase promoters in transgenic plants. Nucleic acids research. 15, 1543-1558 (1987).
  35. Ma, J. K. C., et al. Generation and Assembly of Secretory Antibodies in Plants. Science. 268, 716-719 (1995).
  36. Wycoff, K. L. Secretory IgA antibodies from plants. Curr Pharm Design. 11, 2429-2437 (2005).
  37. Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci. 4, 2411-2423 (1995).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים