מאמר שיטה

ניטור העצרת של מופרש בקטריאלי ארסי פקטור שימוש Crosslinking אתר ספציפי

DOI:

10.3791/51217

⸱

17 בדצמבר 2013

 ,  , 
1Genetics and Biochemistry Branch of the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מדגים את השימוש בתיוג רדיו רודף דופק בשילוב עם קישור פוטו-צולב ספציפי לאתר כדי לנטר אינטראקציות בין חלבון מעניין לגורמים אחרים ב-E. coli. בניגוד לשיטות הצלבה כימיות מסורתיות, גישה זו מייצרת "תמונות" ברזולוציה גבוהה של מסלול הרכבה מסודר בתא חי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר שיטה לאיתור וניתוח אינטראקציות דינמיות בין חלבון מעניין לבין גורמים אחרים in vivo. השיטה שלנו מבוססת על טכנולוגיית דיכוי הענבר שפותחה במקור על ידי פיטר שולץ ועמיתיו1. מוטציה בענבר מוצגת לראשונה בקודון ספציפי של הגן המקודד את החלבון המבוקש. המוטציה הענברית מתבטאת לאחר מכן ב-E. coli יחד עם גנים המקודדים tRNA מדכא ענבר ו-amino acyl-tRNA synthetase שמקורו ב-Methanococcus jannaschii. באמצעות מערכת זו, חומצת האמינו האנלוגית הניתנת להפעלה בצילום p-benzoylphenylalanine (Bpa) משולבת בקודון הענבר. לאחר מכן תאים מוקרנים באור אולטרה סגול כדי לקשר קוולנטית את שאריות ה- Bpa לחלבונים הנמצאים בטווח של 3-8 Å. פוטוקרוסלינג מבוצע בשילוב עם תיוג דופק ומשקעים חיסוניים של החלבון המעניין על מנת לנטר שינויים באינטראקציות חלבון-חלבון המתרחשות על פני סולם זמן של שניות עד דקות. ביצענו אופטימיזציה של ההליך כדי לחקור את ההרכבה של גורם אלימות חיידקי המורכב משני תחומים עצמאיים, תחום המשולב בקרום החיצוני ותחום המועבר לחלל החוץ-תאי, אך ניתן להשתמש בשיטה כדי לחקור תהליכי הרכבה רבים ומסלולים ביולוגיים בתאים פרוקריוטיים ואאוקריוטיים כאחד. באופן עקרוני, ניתן לזהות גורמים אינטראקטיביים ואפילו שאריות ספציפיות של גורמים אינטראקטיביים הנקשרים לחלבון מעניין על ידי ספקטרומטריית מסה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לעתים קרובות חיוני לזהות ולאפיין אינטראקציות בין חלבון מעניין לרכיבים תאיים אחרים כדי להגדיר את תפקידו במסלול ביולוגי, להבין את הרכבתו או להבהיר את מנגנון הפעולה שלו. מגוון רחב של גישות משמשות בדרך כלל לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון, אך לכולן יש מגבלות. השיטה הפשוטה ביותר לזיהוי חלבונים הנקשרים לחלבון מעניין היא טיהור (או קו-אימונופרספיטציה), אך גישה זו דורשת שקומפלקס חלבונים יישאר שלם במהלך הליך הטיהור. ניתן לייצב אינטראקציות חלבון חלשות או חולפות באמצעות קישור צולב כימי, אך שיטה זו דורשת בדרך כלל שימוש בתרכובות המקשרות חלבונים באמצעות אמינים ראשוניים המפוזרים באופן נרחב ברצף החלבון. ניתן ליצור דפוסי קישור צולבים מסובכים שקשה לפרש, במיוחד כאשר חלבונים מעניינים הם רכיבים של קומפלקסים מרובי חלבונים. יתר על כן, מכיוון שזרועות המרווח של מקשרים צולבים כימיים בדרך כלל עולות על 10 Å באורך, ניתן ליצור קשרים קוולנטיים עם חלבונים הממוקמים בסמיכות לחלבון המעניין אך אינם מקיימים איתו אינטראקציה ישירה. שיטות כגון כרומטוגרפיה של זיקה ומסכים דו-היברידיים שימושיות לעתים קרובות גם לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון. הגישה הראשונה, לעומת זאת, דורשת שכפול תנאים המקדמים אינטראקציות משמעותיות מבחינה פיזיולוגית ולא ניתן להשתמש בהם כדי לזהות אינטראקציות חלשות. הגישה האחרונה דורשת שניתן יהיה לשכפל אינטראקציות קשירה באורגניזם המארח ולהישמר כאשר חלבון מעניין ושותפיו המחייבים ממוקמים בהקשר של חלבון היתוך. שיטות דו-היברידיות נוטות גם לייצר תוצאות חיוביות כוזבות2. לאחר שנוצרה אינטראקציה בין חלבון לחלבון, לעתים קרובות נדרשת עבודה ניכרת כדי למפות את אתר האינטראקציה. אולי החיסרון המשמעותי ביותר של הגישות המסורתיות הוא שהן אינן מספקות מידע על הרצף הטמפורלי של אינטראקציות בין-מולקולריות או על הקינטיקה של הקשירה.

מאמר זה מתאר שיטה פשוטה המתגברת על חלק מהמגבלות של גישות אחרות המשמשות לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון. בתחילה, מוטציה בודדת של ענבר מוחדרת לגן המקודד חלבון מעניין. המוטציה הענברית מתבטאת לאחר מכן עם tRNA מדכא ענבר וסינתטאז אמינו אציל-tRNA שמקורו ב-Methanococcus jannaschii שתוכננו לשלב את חומצת האמינו האנלוגית הניתנת לפוטו-אקטיביות p-benzoylphenylalanine (Bpa) רק בקודון ענבר3. הקרנה של תאים עם אור אולטרה סגול (UV) באורך גל ארוך (~365 ננומטר) מקלה על היווצרות קשר קוולנטי בין Bpa לחלבונים שנמצאים בטווח של ~3-8 Å4,5. בהקשרים ניסיוניים מסוימים, יכולים להיווצר קישורים צולבים גם בין Bpa מופעל לבין רכיבים שאינם חלבונים של תאים כגון ליפידים וחומצות גרעין6. מולקולות המסתיימות בקודון הענבר צריכות בדרך כלל להיות ניתנות להבחנה בקלות מהחלבון באורך מלא ב-SDS-PAGE ולא ניתן לקשר אותן לחלבונים אחרים. על ידי הכפפת תאים לתיוג רדיו של דופק לפני קישור צולב ולאחר מכן משקעים חיסוניים או תוצרי קישור צולבים לטיהור זיקה, ניתן לקבוע את הרצף ומשך האינטראקציות בין חלבון לחלבון. היכולת לייצר מידע זמני על אינטראקציות בין-מולקולריות היא בעלת ערך במיוחד כדי לחקור את התקדמות החלבון המעניין דרך כל מסלול הרכבה רב-שלבי, סחר או איתות מסודר ולזהות מתווכים במסלול. בדומה לקישור צולב כימי, קישור צולב ספציפי לאתר מזהה אינטראקציות חלבון-חלבון המתרחשות בתנאים פיזיולוגיים, אך הכנסת קישור צולב במיקום יחיד מקלה על ניתוח האינטראקציות בין מקטעים בודדים של חלבון וגורמים אחרים. תכונה ייחודית זו של קישור צולב ספציפי לאתר היא יתרון במיוחד כאשר לחלבון המעניין יש מספר מקטעים או תחומים שיש להם פוטנציאל לקיים אינטראקציה עם שותפי קשירה מובחנים. יתר על כן, ניתן להשתמש בקישור צולב ספציפי לאתר בשילוב עם שיטות כגון ספקטרומטריית מסה כדי למפות את השאריות המתווכות אינטראקציות חלבון-חלבון בדיוק. למרות ששיטה זו מותאמת לשימוש ב- E. coli, דווח על שילוב של אנלוגים של חומצות אמינו הניתנות להפעלה פוטואקטיבית בחלבונים על ידי דיכוי ענבר בתאי מיקובקטריום, שמרים ויונקים7-11. לפיכך, באופן עקרוני ניתן להשתמש בשיטה שלנו במערכות אחרות.

השתמשנו בשיטה זו באופן נרחב כדי לזהות אינטראקציות בין-מולקולריות המקלות על הביוגנזה של EspP, גורם אלימות E. coli O157:H7. EspP הוא חבר במשפחת-על של חלבונים המכונה "טרנספורטרים אוטומטיים" המכילים תחום חוץ-תאי גדול N-terminal ("תחום נוסע") ותחום aC-terminal ("תחום b") המתקפל למבנה חבית b גלילי ומעגן את החלבון לממברנה החיצונית (OM)12. המנגנון שבאמצעותו מועבר תחום הנוסעים על פני ה-OM הוא תעלומה ארוכת שנים. כמו כל חלבוני פני התא החיידקי, EspP חייב להיות מועבר על פני הממברנה הפנימית, מועבר על פני הפריפלזמה (המרווח בין הממברנות הפנימיות והחיצוניות), וממוקד ל-OM בסדרה של אירועים מסודרים. לאחר הטרנסלוקציה שלו על פני ה-OM, תחום הנוסעים של EspP מופרד גם מתחום b על ידי מחשוף פרוטאוליטי ומשתחרר משטח התא. על ידי שילוב של קישור צולב ספציפי לאתר עם תיוג רדיו של דופק, הראינו ששני התחומים של החלבון מקיימים אינטראקציה ראשונית עם המלווה המולקולרי Skp בפריפלזמה6. לאחר מכן, מקטעים בדידים של תחום b מקיימים אינטראקציה באופן סטריאוספציפי עם רכיבים של הטרוליגומר הנקרא קומפלקס Bam, המזרז את השילוב של חלבוני חבית b לתוך ה-OM החיידקי על ידי מנגנון לא ידוע. אולי המעניין ביותר הוא שגילינו שתחום הנוסעים נמצא במגע עם אחת מיחידות המשנה המורכבות של Bam (BamA) כשהוא חוצה את OM13. התוצאות שלנו אפשרו לנו לבנות מודל מפורט להרכבת אוטוטרנספורטר14 והיו מעורבות במתחם ה-Bam בהובלת תחום הנוסעים על פני ה-OM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בניית פלסמיד

  1. לאחר שיבוט גן המקודד חלבון מעניין לווקטור ביטוי מתאים, הכנס מוטציות ענבר במיקומים הרצויים באמצעות ערכת מוטגנזה מכוונת אתר.
    הערה: מידע מבני ותחזיות חשיפה לפני השטח יכולים לשמש כמדריכים שימושיים לקביעת מיקומי המוטציות. מכיוון שהיעילות של דיכוי ענבר וקישור צולב יכולה להשתנות במידה ניכרת, יש להכניס מוטציות ענבר במספר עמדות. יתר על כן, מכיוון ש-Bpa הוא אנלוגי של טירוזין ופנילאלנין, נסה להכניס מוטציות ענבר במיקומים המקודדים בדרך כלל חומצות אמינו הידרופוביות גדולות כדי למזער הפרעות במבנה ותפקוד החלבון. לבסוף, בעת בחירת וקטור ביטוי יש לזכור כי ייצור יתר של חלבון מעניין ברמה גבוהה מאוד עלול להגביל את יעילות שילוב ה-Bpa.

2. הכנה לתרבות

  1. השתמש באלקטרופורציה כדי להפוך זן E. coli מתאים עם פלסמיד המקודד את מערכת דיכוי הענבר (pDULE-p Bpa; ראה התייחסות4) ופלסמיד תואם המקודד את החלבון המעניין עם מוטציה ענברית.
  2. תאי צלחת באגר LB המכילים אנטיביוטיקה מתאימה (השתמש ב-5 מיקרוגרם/מ"ל טטרציקלין כדי לבחור עבור pDULE-p Bpa). דגרו את הלוחות O/N ב-37 מעלות צלזיוס.
  3. למחרת, התחל תרביות O/N ממושבות בודדות ב-3-5 מ"ל M9 בינוני14 המכיל 0.2% גליצרול, כל חומצות האמינו L למעט מתיונין וציסטאין (40 מיקרוגרם/מ"ל) ואנטיביוטיקה. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  4. למחרת, תרביות O/N צנטריפוגות ב-2,500 x גרם למשך 5 דקות ב-RT לתאי גלולה. השעו מחדש את התאים במדיום M9 טרי של 5 מ"ל וחזרו על הצנטריפוגה.
    הערה: שלב שטיפה זה הוא קריטי לשמירה על פלסמידים המקודדים עמידות לאמפיצילין מכיוון שכמויות קטנות של b lactamase הקיימות במדיום מתרביות O/N מפרקות אמפיצילין טרי שנוסף לפני שמתרחשת צמיחת תאים משמעותית.
  5. השעו מחדש את התאים במדיום טרי של 2 מ"ל ומדדו את ריכוז התאים בספקטרופוטומטר (OD550).
  6. הוסף תאים לבקבוק ארלנמאייר 250 מ"ל המכיל 50 מ"ל מדיום M9 ואנטיביוטיקה ב-OD550=0.03. דגרו על התרבויות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים רועד.

3. שילוב והכנה של Bpa לקישור פוטו-צולב

הערה: הפרוטוקול המתואר להלן מיועד לקורס זמן לדוגמה שיש לו שלוש נקודות זמן (0, 1 ו-5 דקות). התאם את עוצמת הקול בהתאם אם רוצים מספר שונה של נקודות זמן. מתאר ההליך מתואר באיור 1.

  1. בזמן שהתרביות גדלות, הכינו תמיסה טרייה של 1 M (פי 1,000) של Bpa ב-1 M NaOH (27 מ"ג Bpa ב-100 מיקרוליטר 1 M NaOH). השתמש בצינור בעל דופן כהה כדי לשמור על התמיסה בחושך.
  2. כאשר התרבויות מגיעות לשלב המוקדם עד אמצע הלוג (OD550=0.2), הוסף 50 מיקרוליטר 1 M Bpa לכל תרבית. הוסף Bpa טיפה אחת בכל פעם תוך כדי סיבוב הבקבוק כדי למנוע משקעים. לאחר מכן, הוסף את כל המשרתים הדרושים כדי להניע את הביטוי של המוטציה הענברית. המשיכו לדגור על התרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספות.
  3. במהלך תקופת האינדוקציה של 30 דקות סמן שישה צינורות צנטריפוגה חד פעמיים של 15 מ"ל עם נקודת הזמן (0 דקות, 1 דקה, 5 דקות) ו- "+ UV" או "- UV". הניחו את הצינורות על קרח.
  4. מלאו דלי קרח שני בקרח והניחו צלחת תרבית רקמות עם 6 בארות על גבי הקרח.
  5. להפשיר פעילות ספציפית גבוהה (1,000 mCi/mmol) 35S-methionine ו-35S-cysteine (או תערובת מוכנה מראש של שתי התרכובות) לסימון הדופק ולהכין (או להפשיר) תמיסה של L-ציסטאין ו-L-מתיונין לא רדיואקטיביים (100 מ"מ כל אחד) למרדף.
  6. הפעל את מנורת ה-UV חמש דקות לפני תיוג הרדיו.
    הערה: המנורה צריכה להיות מתכווננת כך שניתן יהיה למקם אותה ~ 3-4 ס"מ מהדגימות בצלחת הרב-באר.
  7. הוסף קרח (~2 מ"ל) לכל צינור שכותרתו "- UV" ולשתיים מהבארות בצלחת הרב-בארות.
    הערה: יש להוסיף קרח לבאר שלישית מיד לפני נקודת הזמן של 5 דקות. חיוני להניח קרח ישירות לתוך הצינורות והבארות כדי לעצור תגובות תוך-תאיות באופן מיידי בכל נקודת זמן ובכך לקבל "תמונות" מדויקות של מסלול ביוכימי ספציפי.
  8. בתום תקופת האינדוקציה של 30 דקות, העבירו 25 מ"ל מהתרבית לבקבוק ארלנמאייר חד פעמי של 125 מ"ל שחומם מראש. מניחים את הבקבוק באמבט מים רועדים של 37 מעלות צלזיוס.

4. תיוג דופק וקרינת UV

הערה: לפרוטוקול תיוג מרדף הדופק והקרנת UV יש הרבה שלבים שיש לבצע בזמן ודורשים ארגון והכנה מוקדמת. כל הריאגנטים והצינורות צריכים להיות נגישים בקלות. פרוטוקול לניסוי שיש לו נקודות זמן של 0, 1 ו-5 דקות מוצג להלן.

  1. בשעה 0:00 (דקות:שניות) מעבירים 25 מ"ל תרבית לבקבוק 125 מ"ל.
  2. בשעה 0:30 מוסיפים 30 μCi/ml חומצות אמינו רדיואקטיביות; מערבבים במהירות לערבוב. מניחים את הבקבוק באמבט מי ניעור של 37 מעלות צלזיוס.
  3. בשעה 1:00 מוסיפים 250 מיקרוליטר מתמיסת 100 מ"מ מתיונין-ציסטאין; מערבבים במהירות לערבוב.
    1. פיפטה מיד 4 מ"ל מהתרבות לאחת הבארות של צלחת הרב-בארות המצוננת המכילה קרח. הכניסו מנה שנייה של 4 מ"ל לתוך שפופרת ה-15 מ"ל שכותרתה "0 דקות - UV". החזירו את הבקבוק לאמבט המים.
  4. בזמן 2:00 פיפטה 4 מ"ל מהתרבית לבאר השנייה של צלחת הרב-באר המצוננת המכילה קרח. הכניסו עוד 4 מ"ל לתוך שפופרת ה-15 מ"ל עם הכיתוב "דקה אחת - UV". החזירו את הבקבוק לאמבט המים.
  5. בזמן 6:00 פיפטה 4 מ"ל מהתרבית לבאר השלישית של צלחת הרב-באר המצוננת המכילה קרח. הכניסו עוד 4 מ"ל לתוך שפופרת ה-15 מ"ל שכותרתה "5 דקות - UV".
  6. הנח את דלי הקרח עם צלחת הרב-באר מתחת למנורת ה-UV שחוממה מראש והקרין כל דגימה בנפרד למשך 4 דקות.< > הערה: בניסויים שבהם נקודות זמן מרווחות לפחות 4 דקות זו מזו, יש להקרין כל דגימה ברגע שהיא מוזרמת לצלחת הרב-באר.
  7. העבירו את התאים לצינורות המצוננים של 15 מ"ל המסומנים "0 דקות + UV", 1 דקה + UV" וכו '.
  8. תאי צנטריפוגה ב-2,500 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  9. השעו מחדש כל דגימה במדיום M9 של 300 מיקרוליטר או PBS והוסיפו 33 מיקרוליטר 100% חומצה טריכלורואצטית קרה (TCA) כדי לזרז חלבונים. צנטריפוגה ה-TCA משקעת במיקרופוגה במהירות מרבית למשך 10 דקות ומסירה את הסופרנטנט. בשלב זה ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של - 20 מעלות צלזיוס.

5. זיהוי מוצרים של משקעים חיסוניים וקישור צולב

  1. הוסף חוצץ מסיס של 50 מיקרוליטר (15% גליצרול, 200 מ"מ Trisbase, 15 מ"מ EDTA, 4% SDS, 2 מ"מ PMSF) לכל דגימה וחמם בערבול ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להמיס חלבון משקע.
  2. הוסף 1 מ"ל מאגר בדיקת רדיו-אימונו-משקעים (RIPA) (50 מ"מ Tris pH 8.0, 150 מ"מ NaCl, 1.0% Igepal CA-630, 0.5% דאוקסיכולאט, 0.1% SDS) ובצע משקעים חיסוניים סטנדרטיים15 תוך שימוש בחמישית עד מחצית מכל דגימה.
    הערה: Igepal CA-630 (אוקטילפניל-פוליאתילן גליקול) משמש במקום NP-40, שכבר אינו זמין מסחרית. לא ניתן להבחין בין שתי התרכובות מבחינה כימית.
  3. לפתור חלבונים משקעים חיסוניים על ידי SDS-PAGE. כתם, הימנעות וייבש ג'לים.
  4. לחשוף ג'לים למסך זרחן O/N ולזהות חלבונים רדיואקטיביים (כולל מוצרים צולבים) באמצעות הדמיית זרחן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השתמשנו בקישורים פוטו-צולבים ספציפיים לאתר כדי לזהות חלבונים המקיימים אינטראקציה עם EspP במהלך מסעו ל-OM. בניסויים המוצגים כאן, קודוני פנילאלנין בשאריות 1113 ו-1214 הוחלפו בקודון ענבר. שתי העמדות ממוקמות בדומיין, המשתלב ב-OM ומשמש כעוגן ממברנה. המבנה הגבישי של תחום EspPβ16 מראה ששתי השאריות נמצאות בצד הפריפלזמי של חבית b אך מופרדות על ידי ~120° (ראה מבנה באיורים 2 ו-3). זן E. coli AD20217עבר טרנספורמציה עם pDULE-p Bpa ופלסמיד (pRI22) המקוד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר שיטה המשלבת קישור פוטו-צולב ספציפי לאתר עם תיוג מרדף דופק כדי לבחון את הדינמיקה של אינטראקציות בין חלבון מעניין לרכיבים אחרים של תא חי. השיטה שימושית במיוחד לחקר תהליכים רב-שלביים שבהם החלבון מקיים אינטראקציה ברצף עם גורמים אחרים. בניגוד לגישות הצלבה כימיות מסורתיות, פוטו-קרוס-לינקינג ספציפי לאתר מספק מידע מפורט על המצב של מקטעים בודדים או אפילו שאריות בודדות של חלבון מעניין. מידע זה חשוב במיוחד בניתוח חלבונים שיש להם מספר תחומים או מודולים עצמאיים או, כפי שמודגם כאן, שיש להם שאריות במרווחים קרובים יחסית שבא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר התוך-כיתתית של המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת מוטגנזה מכוונת אתר QuikChange IIAgilent200521
BPA (H-p-Bz-Phe-OH)BachemF-2800
TRAN35S-LABEL, מגיב תיוג מטבולי (35S-L-methionine ו-35S-L-ציסטאין, >1,000 ci/mmol)MP Biomedicals51006
ספקטרולין SB-100P מנורת UV בעוצמה גבוהה במיוחד, 365 ננומטרSpectronics CorporationSB-110P
Spectroline החלפת נורת 100SSpectronics Corporation11-992-15
Falcon Tissue Culture Plate, 6-wellBecton Dickinson Labware353046
חד פעמי 125 מ"ל בקבוק ErlenmeyerCorning430421
Innova 3100 אמבט מים רועדיםחדש ברונסוויק סיינטיפיקנ.א.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 225-249 (2006).
  2. von Mering, C., et al. Comparative assessment of large-scale data sets of protein-protein interactions. Nature. 417, 399-403 (2002).
  3. Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coli. PNAS. 99, 11020-11024 (2002).
  4. Farrell, I. S., Toroney, R., Hazen, J. L., Mehr, R. A., Chin, J. W. Photo-cross-linking interacting proteins with a genetically encoded benzophenone. Nat. Methods. 2 (5), 377-384 (2005).
  5. Wittelsberger, A., Mierke, D. F., Rosenblatt, M. Mapping ligand-receptor interfaces: approaching the resolution limit of benzophenone-based photaffinity scanning. Chem. Biol. Drug Des. 71, 380-383 (2008).
  6. Ieva, R., Tian, P., Peterson, J. H., Bernstein, H. D. Sequential and spatially restricted interactions of assembly factors with an autotransporter beta domain. PNAS. 108, 383-391 (2011).
  7. Wang, F., Robbins, S., Guo, J., Shen, W., Schultz, P. G. Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 5, (2010).
  8. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharyomycescerevisiae. J. Am. Chem. Soc. 125, 11782-11783 (2003).
  9. Young, T. S., Ahmad, I., Brock, A., Schultz, P. G. Expanding the genetic repertoire of the methylotrophic yeast Pichiapastoris. Biochemistry. 48 (12), 2643-2653 (2009).
  10. Hino, N., et al. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nat. Methods. 2 (3), 201-206 (2005).
  11. Liu, W., Brock, A., Chen, S., Chen, S., Schultz, P. G. Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells. Nat. Methods. 4 (3), 239-244 (2007).
  12. Leyton, D. L., Rossiter, A. E., Henderson, I. R. From self sufficiency to dependence: mechanisms and factors important for autotransporter biogenesis. Nat. Rev. Microbiol. 10 (3), 213-225 (2012).
  13. Ieva, R., Bernstein, H. D. Interaction of an autotransporter passenger domain with BamA during its translocation across the bacterial outer membrane. PNAS. 106, 19120-19125 (2009).
  14. Pavlova, O., Peterson, J. H., Ieva, R., Bernstein, H. D. Mechanistic link between barrel assembly and the initiation of autotransporter secretion. PNAS. 110, (2013).
  15. Harlow, D., Lane, D. Using antibodies: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laborator Press. Cold Spring Harbor, NY. (1999).
  16. Barnard, T. J., Dautin, N., Lukacik, N., Bernstein, P., Buchanan, S. K. Autotransporter structure reveals intra-barrel cleavage followed by conformational changes. Nat. Struct. Mol. Biol. 14 (12), 1214-1220 (2007).
  17. Akiyama, Y., Ito, K. SecY protein, a membrane-embedded secretion factor of E. coli, is cleaved by the ompT protease in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 167 (2), 711-715 (1990).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Pulse Chase LabelingAmber SuppressionUVImmunoprecipitationSDS PAGEvirulent

מאמרים קשורים