הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

רגישות סמים של adenylyl cyclase: התייעלות Assay ומזעור למולקולה קטנה ויישומים הקרנת siRNA

12K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51218

⸱

27 בינואר 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 2Quantitative Biology, Eli Lilly and Company

במאמר זה

סיכום

הפעלה מתמדת של תוצאות מעכבות G-חלבון בשילוב קולטנים ברגישות של איתות cyclase adenylyl. כדי לזהות את המסלולים מולקולריים החיוניים, גישות nonbiased נחוצות, עם זאת, אסטרטגיה זו מחייבת הפיתוח של assay רגישות cAMP מבוסס תאים ניתן להרחבה. בזאת, אנו מתארים assay רגישות למולקולה קטנה והקרנת siRNA.

תקציר

רגישות של cyclase adenylyl איתות (AC) הייתה מעורבת במגוון רחב של הפרעות נוירופסיכיאטריות ונוירולוגיות, כולל שימוש בסמים ומחלת פרקינסון. הפעלה חריפה של / קולטנים צמודים o Gαi מעכבת את פעילות AC, ואילו הפעלה מתמשכת של תוצאות קולטנים אלה ברגישות Heterologous של AC ורמות מוגברות של cAMP התוך התאי. שמחקרים קודמים הוכיחו כי שיפור זה של היענות AC הוא ציין הן במבחנה in vivo לאחר ההפעלה הכרונית של מספר סוגים של קולטנים / צמוד o Gαi כולל D 2 דופאמין וμ קולטני אופיואידים. למרות רגישות Heterologous של AC דווחה לראשונה לפני כארבעה עשורים, המנגנון (ים) העומד בבסיס תופעה זו אינו ידוע ברוב. המחסור בנתונים מכניסטית ככל הנראה משקפים את המורכבות כרוכות בתגובה מסתגלת זה, טוען כי גישות nonbiased יכולים לסייע בזיהויing המסלולים המולקולריים מעורבים ברגישות Heterologous של AC. מחקרים קודמים מעורבים קינאז ואיתות Gbγ כחופפים מרכיבים המווסתים את רגישות Heterologous של AC. כדי לזהות מטרות חופפות וייחודיות נוספות הקשורות לרגישות של AC, הפיתוח והאימות של assay רגישות cAMP מדרגי נדרש לתפוקה גדולה יותר. גישות קודמות כדי ללמוד רגישות הן בדרך כלל מסורבלות מעורבת תחזוקה רציפה תא תרבות, כמו גם במתודולוגיה מורכבת למדידת צבירת cAMP שכוללת שלבי שטיפה מרובים. לכן, הפיתוח של assay מבוסס תאים חזק שיכול לשמש עבור הקרנת תפוקה גבוהה (HTS) בפורמט גם 384 יקל מחקרים עתידיים. שימוש בשני דגמי D 2 קולטן דופמין סלולריים (כלומר. CHO-D 2L וHEK-AC6 / D 2L), יש לנו להמיר assay שלנו 48 היטב הרגישות (> 20 צעדים 4-5 ימים) ולחמש-sTEP, assay יום אחד בפורמט 384 גם. התבנית חדשה זו ניתנת להקרנת מולקולה קטנה, ואנו מראים כי עיצוב assay זה יכול גם לשמש בקלות עבור transfection ההפוך של siRNA בציפייה להקרנת ספריית siRNA ממוקד.

מבוא

Cyclase adenylyl אדפטיבית (AC) איתות תגובה המכונה Heterologous או סופר רגישות התגלה לראשונה במעבדתו של חתן פרס נובל, ד"ר מרשל נירנברג. ד"ר נירנברג הציעה שנצפתה היענות AC עלתה בעקבות הפעלת קולטן כרונית δ אופיואידים הייתה מנגנון המעורב בסובלנות אופיום ותלות 1. בנוסף להפעלת קולטן כרונית δ אופיואידים, תגובת neuroadaptive זה של איתות AC מתרחשת גם לאחר הפעלה מתמשכת של כמה קולטנים אחרים Gαi / מצמידים o 2. יש לציין, רבים של קולטנים אלה קשורים לכאב, הפרעות נוירופסיכיאטריות ונוירולוגיות, וכוללים אופיואידים μ / κ, D דופמין 2/4, 5HT 1A, ו-M 2/4 קולטנים מוסקריניים 2. בנוסף לממצאיו של ד"ר נירנברג, גוף גדול של ראיות המקשר רגישות של איתות AC להפעלת קולט אופיואידים כרונית שני במבחנה in vivo 3-7. רגישות של AC גם הייתה קשורה עם מגוון רחב של מחלות מעורבים קולטני דופאמין כמו 2 D כולל סכיזופרניה ומחלת פרקינסון (לסקירה ראתה התייחסות 2). למרות החשיבות הפוטנציאלית של רגישות, המנגנון המדויק (ים) הקשורים / הפעלה מתמשכת Gαi מצמידים o רצפטור שמוביל לעלייה בהיענות AC נשארה במידה רבה לא ידועה.

מחקרים אלה מספקים רציונל לבחינת המנגנונים לרגישות של cyclase adenylyl כיעד הנוירוביולוגי חשוב. כמו כן, את הרלוונטיות הפיזיולוגיות של AC איתות 8 ואת החשיבות שisoforms AC הבודד להחזיק בתגובה מסתגלת זה צריכים גם להיות מוכר 2,9,10. בהקשר של המחקר שלנו, את התכונות הכלליות הקשורים לרגישות Heterologous של isoforms רקומביננטי של AC במקביל מאפיינים אלה described ללימוד isoforms אנדוגני של AC. באופן ספציפי, המחקרים קודמים מצאו כי ההפעלה של חלבוני Gαi / o ויחידות מהשנה שלאחר מכן שחרור / βγ התארגנות הן דרישות חשובות לרגישות הקולטן המושרית של כל isoforms AC. בנוסף, מספר מחקרים מצביעים על כך שהאיתות מקינאז החלבון ויחידות משנת Gβγ מעורבות ברגישות 2,11-13. מזגנים בודדים גם להציג דפוסי רגישות ייחודיים ומובחנים 12. לדוגמא, חשיפה מתמשכת של D 2 קולטנים לאגוניסטים קשורה לרגישות של AC1 וAC8 Ca 2 גירוי + / calmodulin 14,15, ואילו AC3 הקשור קשר הדוק לא רגיש 2. AC2, AC4, וAC7 קשור באופן הדוק, עם זאת, רק פעילות AC2 PKC מגורה היא רגישה וחסונה לאחר חשיפה ממושכת של D 2 קולטנים לאגוניסטים 7,14,16,17. בנוסף, AC5 וAC6 להראות מידה ניכרת של יתר מכירהרגישות ologous לגז וצבירת cAMP מגורה forskolin הבא הפעלה של D 2 קולטנים 14,18-20, אבל נראה שונים בדרישה שלהם לGβγ מקטע-AC קשרי גומלין ש21. למרות שרוב המחקרים של רגישות AC השתמשו קווי מודל תא (לדוגמא תאי HEK293 להביע isoforms AC הבודד), נראה כי ממצאים אלה לתרגם למודלי תא עצביים מקומיים 4,22. לאחרונה, את ההשפעות של מעכבי איזופורם AC סלקטיבית מולקולה קטנות שזוהו בתאי HEK293 להביע isoforms AC יכולות גם להיות מתורגמות למחקרים התנהגותיים in vivo 23.

חוסר מנגנון מולקולרי שזוהה ולרגישות Heterologous כנראה משקף את המורכבות של התגובה המסתגלת, כמו גם מאפייני רגולציה הייחודיים של הפרט AC isoforms 12. להתיר מורכבות כזה מסתבך עוד יותר על ידי השימוש במתודולוגיה לא מסורבליםכובע הגביל חוקרים אקדמיים מהעסקת גישות משוחדת. לדוגמא, המחקרים מכניסטית הקודמים שלנו כללו שימוש במודלים סלולריים ברציפות תרבותי באמצעות 24 - ופורמט תרבית רקמת 48 היטב 15. תאים בתרבית גדלו בדרך כלל עבור 48 שעות ולאחר מכן נתון לטיפול אגוניסט תרופה (2-18 hr) ואחריו סדרה של שוטף התא וincubations (איור 1). פרוטוקולי הצטברות cAMP הספציפי AC-איזופורם היו אז מועסקים ואחרי מדידה של הצטברות cAMP באמצעות [3 H] מפרך וזמן רב cAMP מחייב מתודולוגיה 15,24. המשך מהתחלה ועד סוף לכל assay נדרש בדרך כלל כולל של ארבעה עד חמישה ימים מציפוי תא לניתוח נתונים (איור 1). היישום של טכנולוגיות ואוטומציה חדשות הוביל לשיפורים ניכר ללימודי רגישות בסביבה התעשייתית ומרכז HTS. לדוגמא, קבוצה עובדת עם המרכז הלאומי לחמיםקאל ג'נומיקס דיווח יומיים HTS הליך assay לזיהוי מעכבי מולקולה קטנים של μ רגישות מושרה אופיואידים הקולטן בפורמט 1,536 היטב 25.

המאמר הנוכחי מתאר את המאמצים שלנו כדי לפתח assay HTS ללימודים של רגישות Heterologous תוך שימוש בטכנולוגיות שזמינות ברוב מוסדות מחקר האקדמיים. אסטרטגיה זו הושגה על ידי שילוב של השימוש בתאי cryopreserved ממודלי תא heterologously מבטא את קולטן דופמין D 2 בשילוב עם isoforms cyclase adenylyl רקומביננטי אנדוגני או אדם (CHO-D 2L או HEK-AC6 / D 2 ליטר). כדי לשפר את התפוקה שלנו, אנחנו מחדש assay שלנו 48 גם הרגישות (בערך> 20 צעדים על 4-5 ימים) לחמישה שלבים assay יום אחד, בפורמט 384 גם שהיה למעשה "לערבב ולקרוא". הפורמט החדש משתמש בקרינת זמן הומוגני זמינה מסחרי נפתרה assay (HTRF) כדי למדוד ACC cAMPumulation בתאים שלמים עם קורא צלחת מצב מרובה. Assay הוא איתן וניתן להקרנת מולקולה קטנה, ויכול להיות מיושם בצורה יעילה למסך למעכבים של רגישות Heterologous. בנוסף, אנו מספקים מידע שמאפשר השימוש של assay זה עם transfection ההפוך של siRNA להקרנת ספריית siRNA רחבה ממוקדת או הגנום עם שינוי קל בלבד לגישה הכללית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. התרחבות וCryopreservation של תאי Assay מוכנים

  1. תרבות CHO-K1-DRD 2L תאים (CHO-D 2L) על צלחת 15 סנטימטר 2 תא תרבות בתקשורת F12 של שינקין בתוספת 1.0 מיקרומטר L-גלוטמין, 800 G418 מיקרוגרם / μl, 300 מיקרוגרם / hygromycin μl, 100 u / μl פניצילין, 100 מיקרוגרם / μl סטרפטומיצין, ו10% בסרום שור העובר (FBS).
  2. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עם 5% CO 2 עד לתאים ומחוברות 90-95%. לשטוף את התאים עם 10 μl בופר פוספט (PBS), ולאסוף את התאים על ידי הוספת 3 μl של חיץ התא דיסוציאציה במשך 5 דקות ב37 ° C. Resuspend התאים באמצעות 12 μl של התקשורת והתרבות ולספור תאים באמצעות הרחקת trypan כחולה.
  3. צנטריפוגה ההשעיה תא XG 500 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב μl 5 של תקשורת הקפאה (10% sulfoxide דימתיל, 90% FBS). לדלל את ההשעיה התא כדי להשיג את הריכוז הרצוי של התאים (לדוגמא: 1-20 x 10 6 תאים / μl).
  4. μl 1.0 aliquot של פתרון תא לכל cryovial. דגירה cryovials במכל הקפאת תא ב -80 ° C במשך הלילה. העבר את cryovials לN 2 מיכל נוזל לאחסון ארוך טווח.

2. תאי ציפוי Assay מוכנים (ואופציה ההפוך Transfection)

  1. במהירות להפשיר cryovial קפוא של תאים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. ברגע שתאים מופשרים, להעביר את תאי צינור חרוטי 15 μl מכיל 9 μl של Opti-ממ, ומערבבים על ידי צינור היפוך 3-5x.
  2. צנטריפוגה התאים ב XG 500 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב supernatant ו resuspend התאים ב1 μl Opti-ממ.
  3. ספירת התאים באמצעות הרחקת trypan הכחולה כדי לקבוע כדאיות תא ולדלל את תאי קיימא במידת צורך (למשל. 3 x 10 5 תאים / ריכוז μl) בOpti-ממ. צלחת 10 μl / טוב של תאים בתרבית רקמה שטופלה צלחת 384 גם בעזרת פיפטה רבה.
  4. הפוך דילולים סדרתי של המחנה בOpti-ממ כדי ליצור עקומה סטנדרטית להערכת ייצור cAMP על ידי התאים (לפי מייצר המלצות - ראה סעיף 7). הוסף 10 μl / טוב של הסטנדרטים cAMP לצלחת הערה:. עקומת סטנדרט אחד יכולה להיות מוכנה על צלחת נפרדת או בארות ריקות באחת מצלחות assay.
  5. צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס חממת humidified עם 5% CO 2 למשך שעה 1.

3. הפוך אפשרות transfection siRNA *

סעיף זה הוא אופציונלי ורלוונטי לאיור 3.

  1. הכן פתרון של siRNA ב DDH RNase ללא 2 O (0.4 pmol / μl לדוגמא). הוסף 5 μl לבארות בודדות של צלחת 384 גם, ו צנטריפוגות הצלחת ב100 XG 15 seג בטמפרטורת חדר.
  2. לדלל Lipofectamine 2000 בOpti-ממ בפקטור של 0.006 (למשל להוסיף 6 μl של Lipofectamine 2000 ל1,000 μl של Opti-ממ), ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה.
  3. דגירה פתרון Lipofectamine 2000/Opti-MEM במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. הוסף 5 μl של פתרון Lipofectamine 2000/Opti-MEM המדולל לבארות בודדות של צלחת 384 גם שכבר מכיל siRNA. צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר.
  4. דגירה את הצלחת ל30 דקות בטמפרטורת חדר.
  5. תאים מוכנים assay הצלחת כפי שתואר לעיל (סעיף 2). צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר.
  6. חזור צלחת assay לחממת humidified על 37 מעלות צלזיוס (5% CO 2) ל48-96 שעה כפי שנקבע לגן ממוקד להפיל (ראו דיון).

4. הקרנת מולקולה קטנה

  1. לדלל את התרופה של עניין (מעכבים למשל. מולקולה קטנה) בOpti-ממ ל6x הריכוזים הסופיים הרצויים. דילולים סידוריים ניתן להשלים באמצעות טפטפות כף יד או תחנת טיפול נוזלית.
  2. הוסף 2.5 μl / טוב של מתחם הבדיקה או מאגר המכיל רכב (למשל DMSO) לצד השני של הבארות בעזרת פיפטה רבה.
  3. צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר (דגירה היא אופציונלית).

5. מתמשך אגוניסט טיפול

  1. הכן 600 ננומטר (כלומר. 6 פעמים הריכוז הסופי הרצוי של 100 ננומטר) פתרון של quinpirole בOpti-ממ.
  2. הוסף 2.5 μl / טוב של פתרון quinpirole ננומטר 600 לצד השני של הבארות בעזרת פיפטה רבה.
  3. צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס חממת humidified עם 5% CO 2 למשך 2 שעות.

6. גירוי של cAMP צבירה

  1. במהלך הדגירה 2 שעות, להכין stimulatiעל פתרון בOpti-ממ. פתרון הגירוי מורכב מ40 forskolin מיקרומטר, 2 מיקרומטר 3-isobutyl-1-methyxanthine (IBMX), ו -4 spiperone מיקרומטר (כל הריכוזים בשלב 6 הם 4x הריכוז הסופי הרצוי).
  2. הוספת μl 5 / היטב פתרון הגירוי לצד השני של הבארות בעזרת פיפטה רבה.
  3. צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר, ודגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1.

7. מרווה והערכת cAMP הצבירה

  1. ייצור של cAMP בתאים נמדד באמצעות 2 הערכה הדינמית cAMP על פי הוראות יצרן. בקצרה, מחדש אנטי cAMP-cryptate וcAMP-D2 במים מזוקקים. להקפיא aliquots ב -20 ° C עבור אחסון לטווח קצר.
  2. מדולל aliquot אחד נגד cAMP-cryptate וaliquot אחד בנפרד cAMP-D2 במאגר תמוגה על פי הוראות היצרן כדי להפוך את הפתרונות עובדים.
  3. dd 10 μl / טוב של הפתרון עובד נגד cAMP-cryptate ו10 μl / טוב של הפתרון עובד cAMP-D2 לצלחת 384 גם בעזרת פיפטה רבה.
  4. צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר, ודגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1.
  5. קראו את הצלחת בקורא צלחת פלואורסצנטי (הגדרת קנה מידה אוטומטית לרגישות) באמצעות עירור של 337 ננומטר, ולמדוד את הפליטות ב620 ננומטר ו665 ננומטר למייצר הוראות.
  6. החל ניתוח ratiometric להעריך עקומת סטנדרט cAMP למייצרת הוראות. שימוש בערכים שהתקבלו, להסיק את הצטברות cAMP המוערכת בבארות הבדיקה באמצעות תוכנה לניתוח נתונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

חלק א פיתוח assay רגישות גם Heterologous 384 לזיהוי מעכבי מולקולה קטנים תוך שימוש במודל סלולרי זמין באופן מסחרי.

ללמוד רגישות Heterologous במודל תא, עשינו מספר השיפורים שאפשרו לנו לייעל את assay לפורמט "לערבב ולקרוא". כמה מהשינויים המרכזיים מודגשים בהמשך, והם מתוארים בפירוט רב יותר בדיון. צעד המפתח הראשון היה שינוי תרבית התאים שלנו מהתאים ברציפות בתרבית תאי cryopreserved 26. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במאמץ להקל על מחקרים של רגישות Heterologous, יש לנו בהרחבה שונו השיטה הקודמת שלנו להשגת יעילה "תערובת ולקרוא" פורמט זה הוא amendable להקרנת תפוקה גבוהה ומנגנון של בדיקת פעולה. השינויים העיקריים לפרוטוקול שלנו ניתן לסכם באופן הבא: 1) השימוש בתאי cryopreserved כמו חומרים כימיים "assay-Ready"; 2) המזעור של assay לפורמט 384 גם: 3) הניצול של מדידת HTRF של cAMP.

האימוץ של שימור בהקפאה למבחני תא מבוס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים מבקשים להודות למר ריצ'רד אבץ וטוד Wiernicki להכשרה מתודולוגית והדרכה assay. אנו מודים גם יוחנן פאולוס ספנס לקריאה זהירה ועריכת הצעות. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות 060,397 MH, מוח והתנהגות קרן מחקר, ואלי לילי וחברה באמצעות התכנית לילי פרס המחקר (LRAP).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
CHO-K1-DRD2L תאיםDiscoveRx930579C2
חזיר' s F12 מדיהVWRSH30026fs
סרום בקר עובריVWRSH3007003
G418SigmaA1720
HygromycinFisher50-230-5556
פניצילין/סטרפטומיציןLife Technologies15070063
כלים 15 ס"מBD Falcon353025
DMSOSigmaD2650
מאגר דיסוציאציה של תאיםLife Technologies13150016
Phosphate Buffered SalineLife Technologies10010-049
CryovialsFisher976171
Opti-MEMLife Technologies31985070
TC מטופל 384 צלחותPerkin-Elmer6007688
HTRF cAMP Dynamic 2 kitCisbio Bioassays62AM4PEBhttp://www.htrf.com/camp-cell-based-assay
Synergy 4BiotekH4MLFPTAD
Prism 6GraphPad SoftwareNA
3-Isobutyl-1-methylxanthineSigmaI5879
(±)QuinpiroleSigmaQ111
SpiperoneSigmaS7395
ClozapineSigmaC6305
HaloperidolSigmaH1512
S-(-) SulpirideSigmaS112
Lipofectamine 2000 מגיב טרנספקציהInvitrogen11668019
Trypan blueLife טכנולוגיותT10282
MP ביו-רפואינטול מים, DNase ו-RNase821739
Gas siRNADharmaconמותאם אישית siRNA
בקרת siRNA לא ממוקדתDharmaconD-001206-14-20
siGlo RedDharmaconD-001630-02

מקורות

  1. Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
  2. Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
  3. Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
  4. Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
  5. Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence. Nature. 408, 720-723 (2000).
  6. Nestler, E. J. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).
  7. Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).
  8. Sadana, R., Dessauer, C. W. Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17, 5-22 (2009).
  9. Kim, K. S., et al. Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).
  10. Watts, V. J. Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection. Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).
  11. Beazely, M. A., Watts, V. J. Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report. Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).
  12. Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Chapter 10. Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. Siehler, S., Milligan, G. 10, Cambridge University Chapter. 189-217 (2010).
  13. Lin, Y., Smrcka, A. V. Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting. Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).
  14. Cumbay, M. G., Watts, V. J. Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).
  15. Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).
  16. Nevo, I., et al. Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors. Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).
  17. Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes. Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).
  18. Beazely, M. A., Watts, V. J. Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6. Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).
  19. Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1. Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).
  20. Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
  21. Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly. J. Signal Transduct. 2012, 210324(2012).
  22. Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells. J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).
  23. Wang, H., et al. Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain. Sci. Transl. Med. 3, 65ra3(2011).
  24. Nordstedt, C., Fredholm, B. B. A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid. Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).
  25. Xia, M., et al. Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format. Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).
  26. Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).
  27. Varga, E. V., et al. Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells. Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).
  28. Masri, B., et al. Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).
  29. Thaker, N. G., et al. Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development. Neurosurg. Focus. 28, E4(2010).
  30. Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).
  31. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  32. Ejendal, K. F., et al. Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).
  33. Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors. PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478(2012).
  34. Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).
  35. Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).
  36. Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

cAMPHTS384HTRFsiRNAD2Quinpirole
רגישות סמים של adenylyl cyclase: התייעלות Assay ומזעור למולקולה קטנה ויישומים הקרנת siRNA
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.