במבחני חוץ גופית כדי למדוד שכפול נגיף כבר השתפר מאוד על ידי הפיתוח של וירוסי RNA רקומביננטי להביע לוציפראז או אנזימים אחרים מסוגלים פליטת אור. כאן אנו פירוט צינור הקרנת תפוקה גבוהה המשלב זני רקומביננטי כגון חצבת והווירוסים chikungunya לבודד antivirals ספקטרום רחב מספריות כימיות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הקרנת תפוקה גבוהה לספקטרום רחב כימיים מעכבי RNA וירוסים
במאמר זה
סיכום
תקציר
וירוסי RNA אחראים למחלות עיקריות אדם כגון שפעת, ברונכיטיס, דנגה, הפטיטיס C או חצבת. הם גם מייצגים איום מתעורר בגלל חילופים מוגברים ברחבי העולם ואוכלוסיות אנושיות החודרים מערכות אקולוגיות טבעיות יותר ויותר. דוגמא טובה למצב כזה מתעורר היא מגיפות וירוסים chikungunya של 2005-2006 באוקיינוס ההודי. התקדמות של אחרונות בהבנה של מסלולים הסלולר שליטה שכפול נגיפי שלנו מראה כי תרכובות מיקוד פונקציות תא מארחות, ולא את הנגיף עצמו, יכולים לעכב פנל גדול של וירוסי RNA. תרכובות אנטי כמה ספקטרום רחב זוהו עם מבחני מוכוון יעד מארח. עם זאת, מדידת העיכוב בשכפול נגיף בתרביות תאים באמצעות הפחתת השפעות cytopathic כקריאת נתונים עדיין מייצגת אסטרטגית הקרנה בעל חשיבות עליונה. מסכי פונקציונליים כגון שופרו באופן משמעותי על ידי הפיתוח של וירוסי רקומביננטי להביע כתב אנזימי capable של פליטת אור כגון לוציפראז. בדו"ח הנוכחי, אנחנו פירוט צינור הקרנת תפוקה גבוהה, המשלב חצבת רקומביננטי ווירוסים chikungunya עם מבחני כדאיות סלולרית, כדי לזהות תרכובות עם פרופיל אנטי ספקטרום רחב.
מבוא
וירוסי RNA אחראים למגוון רחב של זיהומי אדם, ויש לה השפעה עצומה על אוכלוסייה ברחבי העולם, הוא במונחים של בריאות ציבור ומחיר חסכוני. חיסונים יעילים פותחו נגד מספר וירוסי RNA האנושי, ונמצאים בשימוש נרחב כטיפול מניעתי. עם זאת, עדיין קיים מחסור קריטי של תרופות טיפוליות נגד נגיף RNA. ואכן, חיסונים יעילים אינם זמינים מפני פתוגנים אנושיים גדולים כגון וירוס דנגה, וירוס הצהבת מסוג C או וירוס סינסיציאלי נשימה אנושי (hRSV). חוץ מזה, וירוסי RNA אחראים למרבית מחלות מתפתחות, שגדלו בתדירות בגלל חילופים הגלובליים והשפעת אדם על מערכות אקולוגיות. נגד האיום הזה שמייצגים וירוסי RNA, הארסנל הטיפולי שלנו הוא מאוד מוגבל ולא יעיל יחסית 1-3. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת צלחות בת 96 היטב עם תרכובות
- הזז צלחות אם 96 היטב המכילות 10 פתרונות מניות מ"מ של תרכובות כימיות בDMSO מ-20 ° C לטמפרטורת חדר. תרכובות לדלל 5x בDMSO להשיג צלחות דילול 96 היטב ביניים ב2 מ"מ. דילול מושגת על ידי pipetting 5 μl ל20 μl של DMSO וערבוב.
- פיפטה μl 1 מצלחות דילול לתוך בארות יבשות של צלחות 96 היטב תרבית רקמה לבנה, מסומן בבר. סט ראשון זה של צלחות בתו (D1) ישמש כדי להעריך את הרעילות של תרכובות בריכוז סופי של 20 מיקרומטר. צלחות בתו חנות ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
צינור הקרנה זו נסמך ראשון על הבחירה של תרכובות המעכבות שכפול MV ולא מראה שום רעילות סלולרית משמעותית (איור 1, מסך ראשי). זה לוקח את יתרון של מבחני מבוססי לוציפראז כדי לקבוע רעילות סלולרית והעיכוב בשכפול נגיף. כל רכישת צעדי pipetting והנתונים יכולה להתבצע בהגדרת תפוקה גבוהה עם פלטפורמה רובוטית.
רעילות תאית של תרכובות נבחנת באמצעות assay כדאיות מבוסס לוציפראז שמעריך את מספר תאי חיים בתרבות המבוססת .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
צינור ההקרנה המתואר כאן שואף בבחירת תרכובות עם פרופיל מתאים כמו מעכבי ספקטרום רחב של וירוסי RNA. כאשר ספרייה של 10,000 תרכובות הוקרן עם פרוטוקול זה וקריטריונים לסינון האמורים יושמו, כלומר עיכוב של שכפול MV מעולה ל75%, 40 תרכובות (0.4%) הבקיע חיובי. חוץ מזה, כמחצית מהם הראתה כמה רעילות בassay הכדאיות מבוססת לוציפראז, והיו התעלמות מסיבה זו. לבסוף, עשרות להיטים זמינים בכמות גדולה יותר היו להערכה מחדש. קבוצה קטנה זו להערכה מחדש בקלות לשתי רעילות סלולרית והעיכוב של שכפול נגיפי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
אנו מודים לד"ר איב L. יאנין על הערותיו הפורה והצעות. ברצוננו להודות לHH גד לChik / רן וג Combredet לתמיכה הטכנית שלה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון פסטר, המרכז הלאומי de la משוכלל ונדיר Scientifique (CNRS), המכון הלאומי דה לה סנטה et de la משוכלל ונדיר Médicale (INSERM), קרנו Institut - Infectieuses חוליי פסטר (סטינג התכנית לPOV וHM- L), Nationale סוכנות הידיעות לשפוך la משוכלל ונדיר (ANR-RPIB, תכנית סטינג 2.0 לPOV), ואת "Conseil d'האזורי Ile-de-צרפת" (כימי ספריית הפרויקט, מענקי N ° אני 06-222 / R ואני 09-1739 / R כדי HM-L.). העבודה על CHIKV / רן נתמכה על ידי ArbOAS הפרויקט (מענק ANR 2010-INTB-1601-1602).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פלטפורמת Freedom EVO | TECAN | פלטפורמה רובוטית | |
| 96 בארות תרבית תאי פוליסטירן מיקרו-פלטות, | לבן Greiner Bio One | 655083 | |
| CellTiter-Glo בדיקת כדאיות תא זוהר | Promega | G7570 | בדיקת כדאיות מבוססת לוציפראז |
| Bright-Glo מערכת בדיקת לוציפראז | Promega | E2610 | מגיב המכיל לוציפראז גחליליות מצע |
| Renilla-Glo luciferase Assay System | Promega | E2710 | Reagent המכיל מצע Renilla luciferase |
| Britelite בתוספת Reporter Gene Assay System | Perkin-Elmer | 6016761 Reagent המכיל מצע לוציפראז גחלילית. יכול לשמש כחלופה למגיב Brigh-Glo לקביעת פעילות לוציפראז. |
מקורות
- De Clercq, E. Antiviral drugs in current clinical use. J Clin Virol. 30, 115-133 (2004).
- Debing, Y., Jochmans, D., Neyts, J. Intervention strategies for emerging viruses: use of antivirals. Curr Opin Virol. , (2013).
- Leyssen, P., De Clercq, E., Neyts, J.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
